全 文 ：园
艺
学
报
2002, 29 ( 6) : 571~ 572
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2002- 01- 07; 修回日期: 2002- 05- 28
基金项目: 教育部高校青年教师教科奖励基金资助项目; 北京市重点实验室  果树逆境生理与分子生物学实验室 资助项目
* 通讯作者
苹果属小金海棠种的遗传一致性研究
李英慧1
韩振海1*
许雪峰1
鲁韧强2
亓丽萍1
( 1中国农业大学园艺学院园艺植物研究所, 北京 100094;
2北京市农林科学院林业果树研究所, 北京 100083)
摘
要: 应用AFLP技术, 用 8 对引物对 20株小金海棠家植实生群体进行遗传一致性分析。结果表明,
小金海棠实生群体内具有高度的遗传一致性, 遗传相似系数为 98. 92 % ; 1. 08 %的遗传差异可能是由于有
性杂交的基因重组导致差异片段出现所造成的。
关键词: 苹果属; 小金海棠; AFLP; 遗传一致性
中图分类号: S 661

文献标识码 : A

文章编号: 0513
353X ( 2002) 06
0571
02
1
目的、材料与方法
小金海棠 (Malus xiaojinensis Cheng et Jiang) 是苹果属的四倍体野生种质资源 ( 2n= 4x= 68) , 具有
耐盐碱、耐热、耐旱、耐涝、抗寒、抗白粉病等特性, 是非常有希望的实生半矮化砧木!1, 2∀。又是携
带铁高效利用基因、抗缺铁黄叶病的资源!3∀。小金海棠的无融合生殖能力较强!4∀, 据报道, 去雄套袋
后花朵坐果率为 86. 7 %!5∀, 但在自然授粉条件下无融合生殖情况未见报道。本试验的目的是利用
AFLP 技术研究小金海棠的无融合生殖情况, 检测其家植实生群体个体间的遗传一致性。
供试材料采自北京市农林科学院林果所的 15年生 20株小金海棠实生群体, 春季取嫩叶进行分
析。DNA的提取和定量采用改良的 CTAB法!6∀。将提取的 DNA溶于适量的TE中, 经紫外分光光度法
和溴化乙锭荧光强度琼脂糖电泳定量法将符合纯度要求的样品 DNA 浓度调整到 200 ng/
L 。AFLP 分
析: 50
L 的酶切体系中含 DNA 模板 1. 0
L, 10 # R+ 缓冲液 5. 0
L, EcoR ∃ ( 10 U/
L) 0. 5
L,
Mse ∃ ( 10 U/
L) 0. 5
L, 超纯水43
L。37 % 酶切 3 h, 65 % 酶切 3 h。然后加入 10
L 接头连接液,
含有T 4
DNA连接酶 ( 10 U/
L) 0. 2
L, 10 # R+ 缓冲液 2. 0
L, EcoR ∃接头和 Mse ∃接头 ( 50 pmol/

L) 各 1. 0
L, ATP ( 10 pmol/
L) 1. 0
L, 超纯水 4. 8
L。22 % 连接 6 h, 65 % 处理 10 min。预扩
增反应体系为 50
L, 其中连接样品 5
L, 10 # PCR缓冲液 4. 0
L, 2. 5 mmol/ L dNTP 4. 0
L, Taq酶
(5 U/
L) 0. 2
L, 超纯水 33. 8
L, M
A 和 E
C 引物 ( 50ng/
L) 各 1. 5
L。扩增程序为 94 % 30 s,
56 % 30 s, 72 % 60 s。选择性扩增反应体系为 20
L, 其中 5
L稀释 20 #预扩增产物, EcoR ∃引物和
Mse ∃引物 ( 50 ng/
L) 各 0. 6
L, 2. 5 mmol/ L dNTP 1. 6
L, Taq酶 ( 5 U/
L) 0. 1
L, 10 # PCR缓
冲液 2. 0
L, 超纯水 10. 6
L。扩增程序为 94 % 变性 120 s, 然后 94 % 30 s, 65~ 56 % 30 s (每一个循
环下降 0. 7 % , 至 56 % 后退火温度不再变化) , 72 % 60 s, 共 35个循环, 最后 72 % 延伸 4 min。选择
性扩增产物的检测: 95 % 变性 3 min后点样于 6%的变性聚丙烯酰胺序列胶电泳, 银染。DNA 扩增仪
为Techne公司的TEDHGENE
FTGENE 5D, EcoR ∃酶、Mse ∃酶及T4
DNA连接酶购自MBI, Taq酶购自
中国农业大学农业生物技术国家重点实验室, 其它试剂购自上海生工, 接头和引物由上海生工合成。
2
结果与分析
用随机抽取的 8对皆含有 3个选择性碱基的引物对 20株小金海棠样本进行 AFLP 分析, 获得了较
好的扩增结果 (图 1) , 共得到清晰度较好的片段 10 049个, 其中差异片段为 109个, 每一对引物在
样本间都可以有效地扩增出 10~ 22个差异片段。8对引物在全部分析样本中的扩增结果见表 1。
表1表明, 每个样本由 8对引物扩增出的平均片段数为 62. 8 , 平均差异片段数为 0. 68 , 遗传相
似系数为 98. 92% , 说明小金海棠家植实生群体内具有高度的遗传一致性。从表 1结合图 1可见, 在
109个差异片段中, 有 94个分布在 S8泳道, 说明了 S8是有性杂交后代, 差异片段来源于有性杂交的
基因重组。换言之, 自然条件下, 小金海棠的实生群体内无融合生殖率为 95%。在其它样本的泳道
上零星地分布有 15个差异片段, 可能是由于苹果
属植物染色体上某个位点发生了点突变等基因突
变所造成的, 由此可估测, 自然条件下小金海棠
的基因突变率为 0. 15%。
表 1
8对引物在 20株小金海棠样本中的扩增结果
Table 1
The number of polymorphic fragments in M. xiaoj inensis
produced by each of the eight pairs of primers used in AFLP analysi s
引物
Primer
总片段数
No. of total
fragments
差异片段数
No. of
polymorphic
fragments
差异片段百分率
Percentage of
polymorphic
fragments (% )
M
CAC~ E
ACC 1110 8( + )
2( - ) 0. 90
M
CAT~ E
AAC 1662 14( + )
8( - ) 1. 32
M
CAC~ E
ACG 1172 8( + )
4( - ) 1. 02
M
CAA~ E
ACG 810 8( + )
2( - ) 1. 24
M
CAG~ E
AAC 1353 10( + )
3( - ) 0. 96
M
CTA~ E
AGG 1417 12( + )
5( - ) 1. 20
M
CAA~ E
ACT 1375 10( + )
5( - ) 1. 09
M
CAT~ E
AAC 1150 8( + )
2( - ) 0. 87
注: ( + ) 代表增多的差异片段, ( - ) 代表缺少的差异片段。
Note: (+ ) added polymorphic fragments, (- ) deficient polymorphic fragments.
图 1
引物 M
CAT~ E
AAC在 20个样品中所产生的 AFLP带型
泳道从左至右分别为Marker, 样品 S1~ S20, Marker。
Fig. 1
The AFLP profile of the 20 samples analyzed
in the experiment produced by primer M
CAT- E
AAC
Lanes ( left to right) are marker, samples S1- S20, marker.
参考文献:
1
王继世, 董绍珍, 张桂琴, 等. 苹果无融合生殖型砧木 &76
2∋ 的利用研究初报. 果树科学, 1985, ( 1) : 14~ 19
2
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3
韩振海, 许雪峰. 不同铁效率果树基因型研究的现状和前景. 园艺学年评, 1995, 1: 1~ 16
4
周志钦, 李育农. 苹果属植物无融合生殖研究进展. 园艺学报, 1995, 22 (4) : 341~ 347
5
成明昊, 扬晓红. 苹果砧木资源 ( 小金海棠的调查研究初报. 西南农学院学报, 1984, 3: 38~ 43
6
Haymes K M. Mini
prep method suitable for a plant breeding program. Plant Molcular Biology Reporter, 1996, 14 (3) : 280~ 284
Genetic Identity Analysis of Malus xiaojinensis by AFLPs
Li Yinghui
1
, Han Zhenhai
1
, Xu Xuefeng
1
, Lu Renqiang
2
, and Qi Liping
1
( 1College of Horticulture, China Agricultural University , Beij ing 100094, China; 2Forestry and Fruit Institude, Beijing Academy of
Agric
forestry Sciences , Beijing 100083, China)
Abstract: AFLP was applied in this experiment to detect the genetic ident ity of Malus xiaojinensis from natural
population. The fingerprint ing of 20 seedlings of M . xiaojinensis with 8 pairs of primers showed that M. xiaoji

nensis in natural population had a high degree of genetic ident ity, its genetic similar coefficient being 98. 92 %.
Genetic difference also existed in this population, 1. 08 %fragments were different fragments. The patterns analysis
indicated that these different fragments were resulted from gene recombination of sexual hybridizat ion.
Key words: Malus; Malus xiaojinensis; AFLP; Genetic identity
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