全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(6)：707～708
Aeta Horticulturae&reca
小金海棠高效脱毒检测体 系的探讨
程玉琴 韩振海 许雪峰 徐 践2
( 中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100094； 北京农学院园艺系 ，北京 102206)
摘 要：以小金海棠组培苗为试材 ，对其进行苹果潜隐病毒接种 、脱毒及检测方法的研究 ，探讨 了一
种针对小金海棠的快速高效 的脱毒检测体系。结果表明，恒温 38℃处理 20 d或变温 38／22℃处理 30 d并结
合茎尖培养 ，对脱除小金海棠苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒的效果较好 。离体条件下 ，指示植物 ‘苏
俄苹果 ’和 ‘弗琴尼苹果 ’不适合检测该两种病毒 ，而用 PAS—ELISA法检测结果较灵敏。
关键词 ：小金海棠；试管微嫁接 ；接种 ；脱毒 ；检测
中图分类号 ：S 661 文献标识码 ：A 文章编号：0513—353X (2003)06-0707—02
1 目的、材料与方法
小金海棠 (Ma／us xiaojinensis Cheng et Jiang)是一种优 良砧木类型，针对它的脱毒研究至今未见报
道。本试验旨在通过试管微嫁接 、热处理结合茎尖培养及 PAS—ELISA等实验方法，初步建立小金海棠
高效的脱毒检测体系，并探讨其对苹果潜隐病毒的抗性，从而为在生产上推广应用小金海棠提供参考。
小金海棠组培苗由种子繁殖而得。指示植物 ‘苏俄苹果’(R127dO一7A)和 ‘弗琴尼苹果’(Vi唧 a
Crab)组培苗由枝条培养而成。苹果褪绿叶斑病毒 (Apple chlorotic leaf spot virus，AcLSV)标准毒源 1和
苹果茎沟病毒 (Apple stem grooving virus，AsGV)标准毒源 2分别保存在苹果组培苗上。培养基 ：(1)MS
+6-BA 0．2 rng·L一 +NAA 0．05 rng·L一 ；(2)MS+6-BA 0．75 rng·L一 +NAA 0．075 rng·L一 ；(3)1／2MS+
IBA 0．5 rng·L～；(4)1／2MS。在无菌条件下，以带毒源 1或毒源 2约 1．5 cm长的茎段作为砧木，以同样
长且有 2片叶子的小金海棠作接穗，采用劈接法进行微嫁接。将嫁接好的试管苗接入培养基 (3)中生
长 7 d后 ，转入培养基 (4)中生长。每组约嫁接 50棵。嫁接 2个月后且接穗长出新叶时，统计嫁接成
活率和生根率 ，并切下接穗 ，将其接入培养基 (2)中进行继代培养。接穗 (小金海棠)生长 2～3个月
后，各取 15个样品用 PAS—ELISA法⋯检测带毒率。同时以待检植株或毒源植株 (对照)为砧木，以指
示植株为接穗 (‘苏俄苹果’检测 ACLSV，‘弗琴尼苹果 ’检测 ASGV)检测带毒率。每种处理嫁接 30棵
左右。将经检测呈阳性的小金海棠 1(感染 ACLSV)和小金海棠 2(感染 ASGV)健壮组培苗，在培养基
(1)中培养 15 d以后 ，放入光照培养箱进行恒温和变温处理。在恒温处理时，光照培养箱的起始温度设
为 32~C，以后每隔 1 d升高 1℃，直至 38~C，热处理时间从 38~C开始计。变温处理时，光照培养箱的温
度从 8：00～22：00设为 38~C，从 22：00～8：00调至22℃，热处理时间从试材放入光照培养箱第 1天就开始
计。处理时间均为 20、25和 30 d，每种处理 70～90株。热处理结束时统计苗木死亡率并剥取长约 1 1Tln
茎尖接入培养基 (2)中培养，2个月后统计茎尖成活率。茎尖成苗后各取约 30个样品用 PAS—ELISA法
检测病毒，统计脱毒率。组培苗的培养条件参照文献 [2]。
2 结果与分析
2．1 苹果潜隐病毒接种和接穗带毒率检测
在试管微嫁接试验中，各种砧穗组合的嫁接成活率都很高，均为 80％ ～90％；离体条件下，指
收稿 日期：2003—01—23；修回日期 ：2003—04—30
基金项 目：北京市自然科学基础性研究实验室资助项 目 (1970103)
* 通讯作者 Author for eo~ pondence
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园 艺 学 报 30卷
示植物在样品 (小金海棠)和对照 (毒源)上均无明显症状 ，因此至少在该试验条件下，用试管微嫁
接法不能检测这两种苹果潜隐病毒。
用 PAS—ELISA法检测相同的样品得 出了不同的结果。检测 ACISV时 ，15个样品中有 9个样品带
毒 ，带毒率为 60．0％；检测 ASGV时 ，有 11个样品带毒 ，带毒率为 73．3％。这表明用试管微嫁接可
快速得到带病毒的小金海棠组培苗；同时通过微嫁接不能完全将 ACLSV和 ASGV接种到小金海棠上，
在该试验条件下 ，小金海棠感染病毒的机率分别为 60．0％和 73．3％，这可能与小金海棠对该两种病
毒具有某种程度的抗性有关。
2．2 恒温或变温热处理对组培苗死亡率和茎尖成活率的影响
小金海棠在恒温热处理 20、25和 30 d后，苗木死亡率分别依次增加 (表 1)，恒温 38c热处理 30 d
死亡率高达 97．8％，同时发现在恒温热处理下苗木叶多枯焦。变温处理相同时间下 ，小金海棠组培苗均
没有死亡，苗木长势较好。因此变温可有效地延长苗木在处理期间的寿命，这与前人的结论[3j一致。
2．3 恒温或变温热处理结合茎尖培养的脱毒效果
PAS—ELISA法检测结果表明，在同一种热处理方式下，脱毒率均随处理时间延长而提高；在相
同的处理时间下 ，恒温处理 比变温处理更有利于脱除 ACLSV和 ASGV；在同一处理条件下，ASGV的
脱除率均低于 ACLSV的脱除率，说明 ACLSV比 ASGV更容易脱除 (表 1)，这与前人观点 j一致。因
此从苗木死亡率和脱毒率考虑，采取恒温 38c处理 20 d，或变温 38／22~C处理 30 d并结合茎尖培养对
脱除小金海棠 ACLSV和 ASGV的效果较好。
表 1 恒温或变温热处理下组培苗死亡率和茎尖成活率
Table l Percentages of dead plants and survival shoot tips in vitroInl~ l-constant Or alternating heat treatment
参考文献 ：
1 洪 霓，刘福昌，王国平 ，等 ．A蛋白质酶联法检测苹果褪绿叶斑病毒和茎沟病毒的研究 ．中国果树 ，1992，1：44—47
2 王 瑛．小金海棠试管苗生根和移栽技术的研究：[硕士学位论文] 北京 ：中国农业大学，1997．28页
3 Stein A， Spiegel S， Faingersh G， et a1．Responses of micmpmpagated peach cuhivars to thermotherapy for the elimination of尸h necrotic
ringspot rims．Annals of Applied Biolog)，1991， 119：265～271
4 Huang Shuching，Milikan D F．In vitm micrografting of apple shoot．HorlScience，1980，15 (6)：741～743
Studies Oil Efficient System of Elimination and Detection Viruses for Malus xiaoji-
nensis
Cheng Yuqin ， Han Zhenhai ，Xu Xuefeng ， and Xu Jian z
( Colege ofAgronomy and Biotechnology，China Agricultural University，Beiji~ 100094，China ； Department ofHorticalture，Bei一
声 Agr／caltural Coaege， 8e0"／~ 102206，China )
Abstract：An eficient system of elimination and detection viruses for Malus xiaoiinensis was studied in this
article．The results obtained showed that 20 day constan t or 30 day alternating heat therapy in combination with tip
propagation Was efective to eliminate ACLSV and ASGV 0f M ． xiaoiinensis． 1e results also indicated that PAS—
EUSA Was relatively sensitive while micmgrafting technique in vitro Was not suitable to detect ACLSV and ASGV 0f
M．xiaojinensis．
Key words：Malus xiaojinensis；Micrografting technique in、，itm；Inoculate；Heat treatment；Virus detection
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