全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(6)：639～642
Aeta Homculturae Simba
小金海棠和丽江 山荆子的缺铁胁迫反应
李 凌 周泽杨 裴 炎
( 西南农业大学园艺园林学院 ，重庆 400716； 西南农业大学生物技术中心 ，重庆 400716)
摘 要 ：小金海棠实生苗在 pH 7．8的碱性紫色土上生长正常 ，丽江 山荆子实生苗表现严重的缺铁失
绿 ；相同土壤上的丽江山荆子砧上的小金海棠叶片会出现 明显的缺铁失绿现象 ，而小金海棠砧上的丽江山
荆子的叶片却没有缺铁症状出现。小金海棠在缺铁培养下 ，根系的质子分泌和三价铁螯合物还原酶 (FCR)
活性均被诱导增加 ，而且均 明显强于同样培养条件下的丽江山荆子；小金海棠的根 系质子分泌部位和 FCR
活性增强的部位重叠。
关键词 ：苹果属 ；小金海棠；丽江山荆子 ；缺铁胁迫
中图分类号 ：S 661．1 文献标识码：A 文章编号 ：0513—353X (2003)06-0639．04
山荆子 [Malus baccata (L．)Borkh．]是 目前发现的苹果属植物中极易发生缺铁黄叶病的基因型 ，
丽江山荆子(M．rocki Schneid．)是山荆子种中的地理亚种 ，同样不耐缺铁 ；而小金海棠 (M．xiaoji．
nensis Cheng et Jiang．)则是目前发现的苹果属植物中最耐缺铁失绿的基因型⋯ ，但其能够忍耐缺铁的
确切原因至今并不清楚。作者已用拟南芥的三价铁螯合物还原酶 (Ferric Chelate—reductase，FCR)基因
(FRO2)(21作探针进行了胁迫条件下小金海棠和丽江山荆子的组织印迹 Northern杂交、3 J。本研究将小
金海棠和丽江山荆子互为砧木嫁接 ，观察它们缺铁症状的变化 ，同时研究它们的根系在营养液胁迫条
件下 H 分泌和 FCR的变化情况 ，为进一步弄清小金海棠的耐缺铁的生理机制，从中克隆耐缺铁基
因，用分子生物学手段创造综合性状优良的耐缺铁的果树砧木奠定基础。
1 材料与方法
小金海棠和丽江山荆子种子 4℃层积 70 d以上 ，2000年春季播种在西南农业大学园艺系苹果种质
资源圃中 [紫色土，pH 7．8，活性铁 0．02％，总铁 (Fe203)3．098％，管理水平中等]。
剪取小金海棠和丽江山荆子的休眠枝条 ，4℃储存。2002年开春后分别芽接在 2年生的小金海棠
和丽江山荆子砧上，抽梢以后观察、测定 、拍照。
取小金海棠 和丽江山荆 子具 3片真叶的实生苗 ，洗净根部泥土 ，蒸馏水培养 3 d，换全量的
Hoagland液培养 4周 以后进行缺铁处理。对照溶液 的 Fe2 EDTA为 80 tmaol·L～，缺铁处理为不加
Fe2 EDTA。人工通气、光照和控温 ，培养温度 25℃。4周换 1次培养液，每天通气 2 h。
叶绿素含量的测定 ：精确称取叶片，研成糊状，80％丙酮提取 ，过滤定容，适当稀释后比色、4J。
根系质子分泌的测定 ：100 mL蒸馏水加 1 g琼脂 、13．6 g CaCO3、6 mg溴 甲酚紫，加热溶解，冷
却至 50~C，调 pH 6．2(暗红色)，根系贴在平皿上 ，琼脂倒入平皿 ，凝 固后室温暗处放置 30 min以
上，观察、拍照记录⋯。
根系和叶片 FCR活力染色定位测定 ：用含 5 mmol·L Mes[2一(N一吗啉 乙磺酸缓冲液 )] (pH
5．5)、0．5 mmol·L～ CaSO4、0．1 mmol·L Fe2 EDTA、0．3 mmol·L BPDS (过 菲绕 啉二 磺 酸)、
0．75％琼脂的溶液加热，混匀冷却至 50℃以下，将根、叶片平铺在平皿上 ，倒入测定液，凝固后室温
放置 30 min以上、5 J，观察拍照。
收稿日期：2003—02—24；修回日期 ：2003—05—12
基金项 目：科技部转基因植物与产业化专项课题 (Jco-A．008-07)
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园 艺 学 报 30卷
2 结 果 与 分析
2．1 小金海棠和丽江山荆子实生苗在田间的生长状况
连续两年 田间观察发现小金海棠实生苗生长正常，叶色浓绿，无任何缺铁症状 ；而丽江山荆子晚
春和夏季萌发的叶片均出现明显的缺铁失绿症 ，夏季缺铁严重时叶肉组织呈现白色。
2．2 小金海棠砧和丽江山荆子砧上的苗木生长状况
嫁接苗同样生长在西南农大园艺系种质资源圃，丽江山荆子砧上抽发的小金海棠枝条上的叶片出
现清晰可辨的缺铁失绿症；而同一地点的小金海棠实生苗叶片则保持浓郁的绿色。小金海棠砧上抽发
的丽江山荆子新叶一直保持浅绿色 ，未观察到明显的网状失绿症出现。同一地点的丽江山荆子实生苗
则出现明显且严重的失绿症 (见插页 1图版 ，1)。另外 ，丽江山荆子砧上抽发的小金海棠枝条的中下
部缺铁症状明显，枝条顶端新叶的缺铁症状有所减轻。
2．3 小金海棠和丽江山荆子叶片的叶绿素含量
小金海棠和丽江山荆子实生苗和嫁接苗叶片 表1小金海棠和丽江山荆子叶片叶绿素含量及差异显著性
的叶绿素含量和差异显著性见表 1。 T圳。 The emororayn。呲蛐协of。鲫惜of M·x~aoj／nensU
方差分析表明，在可以使丽江山荆子严重缺
铁的土壤条件 (pH 7．8)下 ，小金海棠完全可以
保持正常生长 ，叶绿素含量正常；以丽江山荆子
为砧木的小金海棠接穗新叶叶绿素含量减少 ，出
现了明显的缺铁症。以小金海棠为砧木的丽江山
荆子肉眼可辨的缺铁症消失，表明小金海棠的高
效吸收铁明显改善了丽江 山荆子体 内的铁供应，
使其缺铁症状得到明显缓解。
尽管小金海棠砧上丽江山荆子可见的缺铁症
消失 ，但其叶片的叶绿素含量依然显著低于小金
海棠实生苗 ，说明小金海棠砧虽然改善了丽江山
荆子的铁供应状况，但丽江山荆子对铁的利用效
率却始终比小金海棠差。其原因需要进一步分析
推测
材 料
Materials
叶绿素含量 差异显著性 Diferente
Chlorophyll Rl R2 S
content
(mg／g)
*
， **分别为 0．05和0．01显著水准。
* ． * ： Level ofdiference by 0．05 and 0．01 respectively
2．4 小金海棠和丽江山荆子根系的质子分泌比较
缺铁胁迫 4 d时小金海棠幼根的质子分泌能力已明显强于对照，而丽江山荆子幼根分泌能力则弱
很多 (见插页 1图版 ，2)。缺铁胁迫 12周后小金海棠新根的质子分泌能力依然很强 (见插页 1图版，
3)。
小金海棠幼根分泌质子的范围较广，随着小金海棠的生长 ，根逐渐木栓化，分泌质子的范围逐渐
集中到根尖附近 (见插页 1图版 ，2、3)。
2．5 小金海棠和丽江山荆子根系 FCR活性
在缺铁胁迫 4周时，对照处理的小金海棠根吸收区 (根尖以下 0．5～2 cm左右)会出现微弱的淡
红色；缺铁处理小金海棠根吸收区出现了红色 ，范围和颜色均明显强于对照。而缺铁处理的丽江山荆
子根周围的淡红色与对照处理的小金海棠没有明显的区别。说明缺铁胁迫刺激了小金海棠根吸收区域
FCR活性增强 (见插页 1图版，4)。
观察发现小金海棠叶柄断口附近的红色区域和颜色都 比丽江山荆子强 (见插页 1图版，5)。说明
它们叶柄内同样存在 FCR活性，而且小金海棠叶柄 FCR活性明显 比丽江山荆子强。当然叶柄被切断
时，断口肯定有酚类等分泌 ，这类物质可以还原 Fe¨ 。由于目前所用 FCR活性测定法的原理 ，使这
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6期 李 凌等：小金海棠和丽江山荆子 的缺铁胁迫反应
种方法得到的结果中不仅包括酶对 Fe3 的还原 ，还应该包括还原性物质的作用。
3 讨论
3．1 FCR在植物铁吸收中的作用
Chaney等L6J的研究已经证实植物只能吸收 Fe 。研究发现铁在土壤中多以稳定的三价态形式存
在，植物要先将 Fe3 还原成 Fe 才能吸收 ，FCR的重要性由此可见【 ，引。Robinson等克隆了植物 FCR
基因 (拟南芥)，并把该基因片段导入 FCR缺陷型的拟南芥突变体中，转基因拟南芥在供应 Fe3 的培
养基中生长 良好 ，而突变体在此种培养基中黄化严重 J。
我们的研究发现耐缺铁的小金海棠根系在缺铁胁迫下，FCR活性增强并明显强于丽江山荆子。我
们用拟南芥的 FRO2作探针进行的组织印迹的 Northern杂交的研究也发现 ，在缺铁胁迫条件下 ，小金
海棠的根、茎 、叶柄 、叶片中 FCR基因转录产物水平明显高于丽江 山荆子 J。这两个结果证明小金
海棠耐缺铁能力明显强于丽江山荆子的原因是缺铁胁迫下小金海棠根及其它营养器官的 FCR活性 明
显强于丽江山荆子。
3．2 H 分泌与 FCR
缺铁导致的根际酸化是植物对缺铁胁迫的一个重要反应。用三叶草研究证 明在缺铁 30 min时即
可测到 pH的变化 。本研究发现小金海棠中也有类似现象。虽然没有测定 pH被激活的时间曲线 ，
但缺铁信号对小金海棠根系质子分泌的激活是肯定的。
从图版，3、4还可发现小金海棠根遮缺铁胁迫下增强的质子分泌 区域与增强的 FCR活性 区域是
重叠的。前人的研究发现 ，在 pH较低的条件下 FCR活性高 ．9Il 。我们的观察结果同样表明在缺铁
胁迫下 ，小金海棠根系的质子分泌能力迅速增强 ，可以使根际 pH长时间保持低水平，为 FCR的活动
提供一个适宜的 pH范围。
3．3 砧木对铁吸收的影响
丽江山荆子和小金海棠正反嫁接的试验证明砧木对接穗的铁吸收有明显影响，但接穗中的铁代谢
并不完全取决于砧木，还与 自身的铁吸收运输能力强弱有关。因为植物从土壤中吸收铁并不是植物利
用铁的唯一限制步骤，植物 80％的铁集中在叶绿体，这 80％的铁要到达其最终 目的地就必须要跨越
数层生物膜系统l11 J。我们的 Northem杂交研究已经证实除根 以外 ，高水平的 FCR基因转录产物在小
金海棠的茎、叶柄、叶片的特定组织中都出现 ，但铁低效植物丽江山荆子在铁胁迫条件下的各个营养
器官中均很难检测到转录产物L3j。因此 ，小金海棠作为砧木尽管改善 了丽江山荆子的缺铁症 ，但丽江
山荆子对铁的利用效率却始终 比小金海棠差。原因是丽江山荆子体 内的 FCR基因的表达效率始终很
差L3J，导致体 内缺乏 FCR所致。小金海棠接穗萌发时由于丽江山荆子砧的铁供应不足而使小金海棠
叶片出现缺铁现象 ，但小金海棠在受到缺铁胁迫以后 FCR基因开始表达 ，酶的合成逐渐增加，因此
较后时期抽发的枝条顶端新叶的缺铁现象 自然便会减轻。
参考文献：
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642 园 艺 学 报 30卷
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Physiological Reaction on Resistance to Iron Chlorosis in Malus xiaojinensis and
M ．rocki
Li Ling ，Zhou Zeyang2
， and Pei Yan
( Horticulture and Garden Colege，Southwest Agricultural University，Chorgqirg 400716，Ch／na； Biotechnology Research Center
Southwest Agricultural university，Chortgqing 400716，Ch／na)
Abstract：Ma／us xiaojinemis seedlings grew normaly without any iron ehlorosis symptom at soil pH 7．8 and
its leaf chlorophyl content was much higher than that of control species M ．rockii．which showed severe ehlorosis
under the s~tIne pH conditions．Mild but typical iron ehlorosis sym ptom Was observed in scion leaves of M．xiaoji—
nemis grafted on M ．rockii rootstock in the field with pH 7．8．Conversely，when M ．rocki Was exploited the scion
and grafted on M．xiaojinenesis rootstock．its iron ehlorosis sym ptom disappeared．The rate of root H excretion and
ferric．chelate reduetase activity inereased in M．xiaojinemis and were substantially higher than that of M．rockii un．
der iron deficiency．The part of root H excretion overlappe d with the functioning region of root FCR．It is hypothe-
sized that the high root H excretion in the absorptive parts in the roots of M．xiaojinemis provided an optimum pH
environment for root FcR．
Key words：Jil Z ；Jil Z xiaojinemis；Malus rock西；Resistance to iroB ehlorosis
，驴 驴 驴 ， 自
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凌等 ：小金海棠和丽江 山荆子的缺铁胁迫反应
i Ling．et al：Physiological Reaction on Resistance to Iron Chlorosis in Malus．ria‘uinensis and M．mc
插页 1
A
虱版说明 ：l叶 片 (A 山荆子砧上的小金海 棠，B 小金海 棠实生苗 ，C．山利子实生苗 ，D．小金海棠砧 卜的lll剁 )；2．缺铁 4d
喂系的I{ 分泌 (A 加铁小金海棠 ，B 缺铁小金海棠，C 加铁山荆 f，D．缺铁山荆子)；3．缺铁12N小金海棠根系的质子分泌 ；4．根
．~FCR活性 (A 加铁小金海棠，B 缺铁小金海棠，C 缺铁 江I LI制子)；5叶片FCRiN性 (左 ：lII荆 f；右：小金海棠)。
=
_ xplanation of plates：1．Leaves(A．TheleafofM ．~iaojinensis OilM．， )(’kii；B．TheleafofM．xiaojinensis seedling；C．TheleafofM to[ kii seedling：
)The leaf of M ，T kii on M riaojinensis)；2．Root H excretion under iron deficiency 4 days(A．M．viaojinensis under iron suficiency：B．M．xiaojinensis
mder iron deficiency：C M ，Ot·kii under iron suficieny：D M f。kii under iron deficiency)：3．Root H excretion of M ~iaojinensis under iron
teficiency 1 2 weeks：4．Root FCR activities fA M．xiaojinensis under iron sufficiency；B．M．viaojinensis under iron deficiency：C．M．ro(’ki undm‘
ron deficiency)；5 FCR activity of leaves(Left：M．ro(’kii；Right：M xiaojinensis)．
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