全 文 ：园　艺　学　报　2002 , 29 (6):571 ～ 572
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期:2002-01-07;修回日期:2002-05-28
基金项目:教育部高校青年教师教科奖励基金资助项目;北京市重点实验室 “果树逆境生理与分子生物学实验室” 资助项目
＊通讯作者
苹果属小金海棠种的遗传一致性研究
李英慧1 　韩振海1＊　许雪峰1 　鲁韧强2 　亓丽萍1
(1中国农业大学园艺学院园艺植物研究所 , 北京 100094;　2北京市农林科学院林业果树研究所 , 北京 100083)
摘　要:应用AFLP技术 , 用 8 对引物对 20株小金海棠家植实生群体进行遗传一致性分析。结果表明 ,
小金海棠实生群体内具有高度的遗传一致性 , 遗传相似系数为 98.92 %;1.08 %的遗传差异可能是由于有
性杂交的基因重组导致差异片段出现所造成的。
关键词:苹果属;小金海棠;AFLP;遗传一致性
中图分类号:S 661　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2002)06-0571-02
1　目的 、 材料与方法
小金海棠 (Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)是苹果属的四倍体野生种质资源 (2n=4x=68), 具有
耐盐碱 、 耐热 、 耐旱 、耐涝 、 抗寒 、抗白粉病等特性 , 是非常有希望的实生半矮化砧木〔1 , 2〕 。又是携
带铁高效利用基因 、 抗缺铁黄叶病的资源〔3〕 。小金海棠的无融合生殖能力较强〔4〕 , 据报道 , 去雄套袋
后花朵坐果率为 86.7 %〔5〕 , 但在自然授粉条件下无融合生殖情况未见报道 。本试验的目的是利用
AFLP 技术研究小金海棠的无融合生殖情况 , 检测其家植实生群体个体间的遗传一致性 。
供试材料采自北京市农林科学院林果所的 15年生 20株小金海棠实生群体 , 春季取嫩叶进行分
析。DNA的提取和定量采用改良的 CTAB法〔6〕 。将提取的 DNA溶于适量的 TE中 , 经紫外分光光度法
和溴化乙锭荧光强度琼脂糖电泳定量法将符合纯度要求的样品 DNA 浓度调整到 200 ng/μL 。AFLP 分
析:50μL 的酶切体系中含 DNA 模板 1.0 μL , 10×R+缓冲液 5.0 μL , EcoR Ⅰ (10 U/μL)0.5μL ,
Mse Ⅰ (10 U/μL)0.5μL , 超纯水43 μL。37℃酶切 3 h , 65℃酶切 3 h 。然后加入 10μL接头连接液 ,
含有 T4-DNA连接酶 (10 U/μL)0.2μL , 10×R+缓冲液 2.0 μL , EcoR Ⅰ接头和 Mse Ⅰ接头 (50 pmol/
μL)各 1.0 μL , ATP (10 pmol/μL)1.0 μL , 超纯水 4.8 μL。22℃连接 6 h , 65℃处理 10 min 。预扩
增反应体系为 50μL , 其中连接样品 5 μL , 10×PCR缓冲液 4.0 μL , 2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL , Taq酶
(5 U/μL)0.2 μL , 超纯水 33.8 μL , M-A 和 E-C 引物 (50ng/μL)各 1.5 μL。扩增程序为 94℃30 s ,
56℃30 s , 72℃60 s。选择性扩增反应体系为 20 μL , 其中 5 μL稀释 20×预扩增产物 , EcoR Ⅰ引物和
Mse Ⅰ引物 (50 ng/μL)各 0.6 μL , 2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL , Taq酶 (5 U/μL)0.1 μL , 10×PCR缓
冲液 2.0μL , 超纯水 10.6 μL。扩增程序为 94℃变性 120 s , 然后 94℃30 s , 65 ～ 56℃30 s (每一个循
环下降 0.7 ℃, 至 56℃后退火温度不再变化), 72℃60 s , 共 35个循环 , 最后 72℃延伸 4 min 。选择
性扩增产物的检测:95℃变性 3 min后点样于 6%的变性聚丙烯酰胺序列胶电泳 , 银染。DNA 扩增仪
为Techne公司的 TEDHGENE-FTGENE 5D , EcoR Ⅰ酶 、 Mse Ⅰ酶及T4-DNA连接酶购自MBI , Taq酶购自
中国农业大学农业生物技术国家重点实验室 , 其它试剂购自上海生工 , 接头和引物由上海生工合成。
2　结果与分析
用随机抽取的 8对皆含有 3个选择性碱基的引物对 20株小金海棠样本进行 AFLP 分析 , 获得了较
好的扩增结果 (图 1), 共得到清晰度较好的片段 10 049个 , 其中差异片段为 109个 , 每一对引物在
样本间都可以有效地扩增出 10 ～ 22个差异片段 。8对引物在全部分析样本中的扩增结果见表 1。
表1表明 , 每个样本由 8对引物扩增出的平均片段数为 62.8 , 平均差异片段数为 0.68 , 遗传相
似系数为 98.92 %, 说明小金海棠家植实生群体内具有高度的遗传一致性。从表 1结合图 1可见 , 在
109个差异片段中 , 有 94个分布在 S8泳道 , 说明了 S8是有性杂交后代 , 差异片段来源于有性杂交的
基因重组 。换言之 , 自然条件下 , 小金海棠的实生群体内无融合生殖率为 95%。在其它样本的泳道
上零星地分布有 15个差异片段 , 可能是由于苹果
属植物染色体上某个位点发生了点突变等基因突
变所造成的 , 由此可估测 , 自然条件下小金海棠
的基因突变率为 0.15%。
表 1　8对引物在 20株小金海棠样本中的扩增结果
Table 1　The number of polymorphic fragments in M.xiaojinensis
produced by each of the eight pairs of primers used in AFLP analysis
引物
Primer
总片段数
No.of total
fragments
差异片段数
No.of
polymorphic
fragments
差异片段百分率
Percentage of
polymorphic
f ragments (%)
M-CAC ～ E-ACC 1110 8(+)　2(-) 0.90
M-CAT～ E-AAC 1662 14(+)　8(-) 1.32
M-CAC ～ E-ACG 1172 8(+)　4(-) 1.02
M-CAA～ E-ACG 810 8(+)　2(-) 1.24
M-CAG～ E-AAC 1353 10(+)　3(-) 0.96
M-CTA～ E-AGG 1417 12(+)　5(-) 1.20
M-CAA～ E-ACT 1375 10(+)　5(-) 1.09
M-CAT～ E-AAC 1150 8(+)　2(-) 0.87
注:(+)代表增多的差异片段 , (-)代表缺少的差异片段。
Note:(+)added polymorphic fragments , (-)deficient polymorphic fragments.
图 1　引物 M-CAT～ E-AAC在 20个样品中所产生的 AFLP带型
泳道从左至右分别为Marker , 样品 S1～ S20 , Marker。
Fig.1　The AFLP profile of the 20 samples analyzed
in the experiment produced by primer M-CAT-E-AAC
Lanes(left to right)are marker , samples S1-S20, marker.
参考文献:
1　王继世 , 董绍珍 , 张桂琴 , 等.苹果无融合生殖型砧木 `76-2 的利用研究初报.果树科学 , 1985, (1):14～ 19
2　成明昊 , 李哓林 , 张云贵.苹果优良砧木—小金海棠研究进展.西南农业大学学报 , 2000 , 22 (5):383～ 386
3　韩振海 , 许雪峰.不同铁效率果树基因型研究的现状和前景.园艺学年评 , 1995 , 1:1～ 16
4　周志钦 , 李育农.苹果属植物无融合生殖研究进展.园艺学报 , 1995, 22 (4):341～ 347
5　成明昊 , 扬晓红.苹果砧木资源—小金海棠的调查研究初报.西南农学院学报 , 1984 , 3:38～ 43
6　Haymes K M.Mini-prep method suitable for a plant breeding program.Plant Molcular Biology Reporter , 1996 , 14 (3):280～ 284
Genetic Identity Analysis of Malus xiaojinensis by AFLPs
Li Yinghui
1 , Han Zhenhai1 , Xu Xuefeng1 , Lu Renqiang2 , and Qi Liping1
(1College of Horticulture , China Agricultural University , Beijing 100094 , China;2Forestry and Fruit Institude , Beijing Academy of
Agric-forestry Sciences , Beijing 100083 , China)
Abstract:AFLP was applied in this experiment to detect the genetic identity of Malus xiaojinensis from natural
population.The fingerprinting of 20 seedlings of M .xiaojinensis with 8 pairs of primers showed that M.xiaoji-
nensis in natural population had a high degree of genetic identity , its genetic similar coefficient being 98.92 %.
Genetic difference also existed in this population , 1.08 %fragments were different fragments.The patterns analysis
indicated that these different fragments were resulted from gene recombination of sexual hybridization.
Key words:Malus;Malus xiaojinensis;AFLP;Genetic identity
572　　　　　　　　　　　　　　　　　　园　　艺　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　29卷