全 文 ：书核 农 学 报 2011，25(3) :0477 ～ 0481
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2010-10-12 接受日期:2011-01-05
基金项目:国家科技支撑计划项目(2007BAD34B01)
作者简介:潘丽军(1955-) ，女，安徽金寨人，博士，教授，硕士生导师，研究方向为农产品资源综合利用研究。 Tel:13855157386;E-mail:
panlijun1955@ 163. com
文章编号:1000-8551(2011)03-0477-05
嗜鞣管囊酵母木糖发酵乙醇高产突变株
选育及其发酵特性
潘丽军 储开庆 杨培周
(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽 合肥 230009)
摘 要:目前能够利用木糖发酵产乙醇的菌株很少且产量较低，对菌株进行诱变选育，可以提高其对木质
纤维素的利用率。本试验选择嗜鞣管囊酵母 As2. 1585 为原始菌株，采用 15keV 的低能氮离子进行注入
诱变。随着注量的增加，菌体存活率曲线呈“马鞍型”，综合考虑其存活率和正突变率，确定最佳诱变注
量为 12. 5 × 1014 ions / cm2，对诱变后菌体进行筛选，获得了嗜鞣管囊酵母高产菌株 mut-54，传代 7 次后乙
醇产量稳定。试验表明，突变株 mut-54 对木糖的利用速率、生物量积累以及耐酒精能力均高于原始菌
株，发酵 72 h 乙醇产量较原始菌株提高 12. 74%。突变株 mut-54 比原始菌株更适合用于木糖发酵产乙
醇。
关键词:离子注入;嗜鞣管囊酵母;选育;木糖;乙醇
BREEDING AND FERMENTATION CHARACTERIZATION OF Pachysolen
Tannophilus MUTANT WITH HIGH ETHANOL PRODUCTIVITY FROM XYLOSE
PAN Li-jun CHU Kai-qing YANG Pei-zhou
(School of Biotechnology and Food Engineering，key Laboratory for Agricultural Products
Processing of Anhui Province，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230009)
Abstract:Currently，few strains can utilize xylose to produce ethanol with very low productivity． By the method of
mutation breeding to these strains the rate of lignocellulosic utilization could be improved． In this study，the initial
Pachysolen tannophilus As2. 1585 was treated by N + ions implantation of 15keV． The survival curve showed a saddle
model． Considering the survival rate and range of positive mutation，the N + ions implantation of 12. 5 × 1014 ions / cm2 for
mutation breeding of Pachysolen tannophilus was selected． A Pachysolen tannophilus mutant mut-54，which had perfect
genetic stability of producing ethanol was screened out after continuous 7 passages． The mut-54 had a higher xylose
consumption rate，biomass accumulation and ability of ethanol-resistant than the parent strain． Compared with the parent
strain，the ethanol concentration fermented by the mut-54 for 72h increased by 12. 74 %，which was more suitable for
producing ethanol from xylose than the parent strain．
Key words:ion implantation ;Pachysolen tannophilus;breeding;xylose;ethanol
木质纤维素是一种丰富的可再生资源，它在酸、
碱、纤维素酶系等的作用下可产生以葡萄糖和木糖为
主的还原糖类，再经酵母菌等微生物的作用可转化为
乙醇［1 ～ 4］。目前利用葡萄糖发酵乙醇的菌种很多，且
糖利用率和乙醇产量也很高，但它们大多数不能利用
木糖。能同时利用葡萄糖和木糖发酵产乙醇的菌种较
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少，研究发现少数几个种属的酵母菌可以同时利用葡
萄糖和木糖发酵产乙醇，如嗜鞣管囊酵母(Pachysolen
tannophilus)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、树
干毕赤酵母(Pichia stipitis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia
guilliermondii)、酒香酵母(Brettanomyces anomalus)和
产朊假丝酵母(Candida utilis)［5］，但它们利用木糖发
酵产乙醇的能力仍较弱［6］。对这些菌株进行改良可
以提高对木糖的利用率，缓解日益紧张的能源问题。
离子注入生物体诱变育种是一种对微生物诱变改良的
新技术，起步较晚，但发展迅速［7 ～ 9］。它具有高突变率
和存活率呈马鞍型的特点，可根据不同的诱变育种需
要，选用不同种类的离子、能量、质量和电荷进行组合，
使之产生比其他电离辐射更为丰富的生物学内容和更
为广泛的诱变图谱，为筛选优良的突变型菌株提供广
阔的空间［10］。本文通过对嗜鞣管囊酵母 As2. 1585 进
行离子注入诱变，以筛选木糖发酵乙醇高产突
变株。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种 嗜鞣管囊酵母 As2. 1585，合肥工业大
学生物与食品工程学院实验室保藏，购于中国科学院
普通微生物保藏中心。
1. 1. 2 培养基 TTC 下层培养基:木糖 10g /L，蛋白
胨 2g /L，酵母粉 1. 5g /L，KH2PO4 1g /L，MgSO4·7H2O
0. 4g /L，pH 5. 5 ～ 5. 7，琼脂 20g /L［11］;TTC 上层培养
基:木糖 0. 5g /L，琼脂 15g /L，TTC 0. 05g /L［11］;种子培
养基:木糖 40g /L，葡萄糖 2g /L，酵母浸粉 8g /L，
(NH4)2 SO4 1g /L，KH2PO4 1g /L，MgSO4·7H2O 1g /L;
发酵培养基:木糖 50g /L，酵母浸粉 10g /L，(NH4)2 SO4
1g /L，KH2PO4 1g /L，MgSO4·7H2O 1g /L
［12］;YEPX 培
养基:木糖 20g /L，酵母粉 10g /L，蛋白胨 20g /L［13］。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 离子注入诱变 诱变前处理:用无菌水冲洗原
始菌株新鲜斜面，制成菌悬液，调节菌悬液浓度约为
107 ～ 108 个 /ml，再加入等体积 30%甘油水溶液(已灭
菌) ，吸取 0. 1ml 菌悬液加入无菌培养皿中，涂布均
匀，无菌条件下风干水分，即可用于诱变。诱变条件:
注入离子选择 N +，能量为 15keV，真空度为 10 － 3 Pa，注
量分别为 2. 5 × 1014、5 × 1014、7. 5 × 1014、10 × 1014、
12. 5 × 1014、15 × 1014、17. 5 × 1014、20 × 1014、22. 5 ×
1014和 25 × 1014 ions / cm2。
1. 2. 2 种子液制备 取新鲜斜面用接种针挑取菌体
接入含有 50ml 种子培养基的 250ml 三角瓶中，30℃、
150r /min 下培养 24h。
1. 2. 3 发酵方法 取种子液以 10% 接种量接入含
50ml 发酵培养基的 250ml 三角瓶中，30℃、150r /min
培养 72h。
1. 2. 4 高产菌株的筛选 初筛:经离子注入诱变后的
菌体用 1ml 无菌水冲洗，选择合适的倍数进行稀释，取
稀释后的菌悬液 0. 1ml 涂布在 TTC 下层平板中，待长
成菌落在无菌条件下倒入 TTC 上层培养基，最后挑选
变红色的菌落进行复筛。复筛:将初筛后的菌株进行
发酵，并和原始菌株对比，乙醇产量比原始菌株高出
5%定义为正突变株。存活率 = (某注量下平板中长
出的菌落数 /真空对照平板中长出的菌落数)×
100%。正突变率 =(正突变株数 /平板中长出的总菌
落数)× 100%［14］。
1. 2. 5 突变菌株与出发菌株发酵特性比较 取原始
菌株和突变菌株的种子液以 10% 接种量分别接入含
50ml 发酵培养基的 250ml 三角瓶中，30℃、150r /min
发酵 96h，前 72h 每隔 6h 取样 1 次，后 24h 每隔 12h 取
样 1 次，测定发酵各时期发酵液中的生物量、木糖含
量、乙醇产量。
1. 2. 6 突变菌株与出发菌株耐酒精能力比较 向已
灭菌的 YEPX 培养基中添加不同体积的无水乙醇，制
成含 0 ～ 5%乙醇(体积比)的 YEPX 培养基。取突变
菌株与原始菌株的种子液以 10% 接种量分别接入含
有不同浓度乙醇的 YEPX 培养基中，于 30℃、150r /min
培养 48h 后测生物量。
1. 3 检测
1. 3. 1 还原糖测定 采用 DNS 法［15］。
1. 3. 2 乙醇测定 采用气相色谱法。色谱柱为 MXT-
20，30m × 0. 25mm;检测器为 FID;色谱条件:载气 N2
50ml /min，H2 50ml /min，空 气 400ml /min，进 样 器
180℃，柱温 40℃，检测温度 220℃，进样量 1μl，分流
比 1∶ 60，外标法定量。
1. 3. 3 生物量测定 采用干重法。取发酵液于
5000r /min 下离心 10min，菌体沉淀经无菌水洗涤 1 次再
离心，然后将菌体置于 70℃下烘干至恒重，测其重量。
2 结果与分析
2. 1 氮离子注入对嗜鞣管囊酵母存活率的影响
将氮离子注入诱变后的菌体用 1ml 无菌水制成菌
悬液，选择合适的稀释倍数进行稀释，涂布于 PDA 平
板，计算各注量下的存活率，绘制曲线如图 1。
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3 期 嗜鞣管囊酵母木糖发酵乙醇高产突变株选育及其发酵特性
图 1 氮离子注入量对嗜鞣管囊酵母存活率的影响
Fig． 1 Effect of ion beam implantation on survival rate
of Pachysolen tannophilus
由图 1 可以看出，在 2. 5 × 1014 ～ 25 × 1014 ions / cm2
注量范围内，菌体存活率随着注量的增大先降后升，然
后又下降，呈马鞍型曲线。在 12. 5 × 1014 ～ 20 × 1014
ions / cm2 注量范围内，存活率在 11% ～ 20%之间。
表 1 突变菌株产乙醇的遗传稳定性
Table 1 Genetic stability of ethanol production of mutants (g /L)
菌株编号 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7
mut-31 10. 21 ± 0. 12 10. 29 ± 0. 06 10. 18 ± 0. 1 9. 86 ± 0. 13 10. 18 ± 0. 09 9. 94 ± 0. 11 9. 89 ± 0. 17
mut-34 10. 18 ± 0. 11 10. 02 ± 0. 09 10. 32 ± 0. 07 9. 63 ± 0. 15 10. 17 ± 0. 1 9. 73 ± 0. 05 9. 51 ± 0. 17
mut-54 10. 46 ± 0. 08 10. 37 ± 0. 07 10. 49 ± 0. 03 10. 39 ± 0. 1 10. 34 ± 0. 07 10. 51 ± 0. 06 10. 42 ± 0. 11
2. 2 氮离子注入对嗜鞣管囊酵母正突变率的影响
根据 1. 2. 4 的方法对氮离子注入法诱变后的嗜鞣
管囊酵母进行初筛及复筛，结果如图 2 所示。
图 2 离子注量对嗜鞣管囊酵母正突变率的影响
Fig． 2 Effect of ion beam implantation
on positive mutation rate of Pachysolen tannophilus
由图 2 可以看出，离子注入诱变具有正突变率高
的特点。在 12. 5 × 1014 ions / cm2 注量下，正突变率高
达 20. 6%，存活率为 15. 6% (图 1)。综合考虑，可选
取该注量为最佳诱变注量。
2. 3 高产菌株的筛选
在最佳诱变注量下反复诱变后的菌体，经 TTC 上
下层平板初筛，得到 65 株突变体，将它们一一进行发
酵比较乙醇产量，各株产量如图 3 所示。
图 3 突变株的乙醇产量
Fig． 3 Ethanol production of positive mutants
图 3 显示，31、34 和 54 号菌株的乙醇产量最高，
都高于 10g /L，因此选取这 3 株菌继续研究，并分别命
名为 mut-31、mut-34 和 mut-54。
2. 4 突变株遗传稳定性研究
选择乙醇产量最高的 3 株菌株，考察其产乙醇能
力的稳定性。将突变菌株每隔 1 周转接 1 次 PDA 斜
面，连续传代 7 次，摇瓶发酵测定各代乙醇产量，结果
见表 1。
由表 1 可以看出，突变株 mut-31 与 mut-34 产乙醇
能力逐渐下降，可能是因为随着传代次数的增加，菌体
发生自发突变(尤其是负突变)的概率越高，传代次数
越多，群体中个别衰退型细胞数量增加越快，致使群体
产乙醇能力下降。而突变株 mut-54 各代产乙醇能力
都较稳定，各代产乙醇产量均在 10. 44g /L 左右。表明
突变株 mut-54 产乙醇遗传稳定性最好。
2. 5 高产菌株发酵过程中乙醇的转化
将突变株 mut-54 与原始菌株接到发酵培养基中
摇瓶培养 96h，从 0h 开始，前 72h 每隔 6h 取样，后 24h
每隔 12h 取样，测定各时期样品中乙醇含量，结果如图
4 所示。
由图 4 可以看出，突变株 mut-54 与原始菌株的乙
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图 4 突变株 mut-54 与原始菌株发酵产乙醇量的比较
Fig． 4 Comparison of ethanol yield between
mut-54 and parent strain
醇产量在前 24h 内缓慢增长，这是因为此段时间菌体
以生长为主，合成产物较少。在 24 ～ 72h 之间，菌体开
始大量利用木糖生成乙醇，乙醇含量迅速提高。72h
后，由于还原糖耗尽，菌体开始利用乙醇生长，导致乙
醇含量下降。突变株 mut-54 的乙醇产量在整个发酵
过程中都高于原始菌株，72h 时发酵液中乙醇浓度为
10. 44g /L，较原始菌株(9. 26g /L)高出 12. 74%。
2. 6 高产菌株生物量的积累及对还原糖的利用
将突变株 mut-54 与原始菌株接到发酵培养基中
摇瓶培养 96h，从 0h 开始，前 72h 每隔 6h 取样，后 24h
每隔 12h 取样，测定样品中生物量与木糖含量，结果分
别如图 5 和图 6 所示。
图 5 突变株 mut-54 与原始菌株发酵中的生物量变化
Fig． 5 Biomass curves of mut-54 and
parent strain in fermentation process
由图 5 可以看出，在前 24h 内菌体生物量迅速上
升，24h 时突变株生物量略高于原始菌株。24 ～ 72h 之
图 6 突变株 mut-54 与原始菌株发酵中的木糖含量变化
Fig． 6 Changes of xylose concentration of mut-54
and parent strain in fermentation process
间，菌体大量利用木糖生成乙醇，二者菌体浓度缓慢上
升且突变株 mut-54 生物量始终高于原始菌株。发酵
72h 后，生物量仍缓慢增长，这是由于发酵液中含有较
多的乙醇，菌体可以利用乙醇进行生长。由图 6 可以
看出，在 0 ～ 18h 内，突变株 mut-54 与原始菌株的糖利
用率基本一致。在 18 ～ 66h 之间，其糖利用率高于原
始菌株。72h 后木糖都基本耗尽。
2. 7 高产菌株对乙醇的耐受力
原始菌株与突变株 mut-54 在含不同浓度乙醇
YEPX 培养基中培养 48h 后的生物量如图 7 所示。
图 7 乙醇添加量对突变株 mut-54 和原始菌株生物量的影响
Fig． 7 Effects of addition ethanol on biomass of
mut-54 and parent strain
由图 7 可以看出，在不添加乙醇时，培养 48h 后突
变株 mut-54 与原始菌株生物量基本一致。随着乙醇
添加量的增大，二者的生物量都逐渐减小，但在含同样
浓度乙醇的 YEPX 培养基中，突变株 mut-54 的生物量
高于原始菌株，说明突变株 mut-54 对乙醇的耐受能力
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较原始菌株高。
3 讨论
离子束注入诱变育种技术近年来发展迅速，在微
生物菌种改良中已得到了广泛的应用。它具有菌体存
活曲线呈马鞍型和高正突变率的特点。龚加顺等将
N +注入生产单宁酸酶的黑曲霉 Aspergillus niger 9701
中，发现菌体存活率曲线呈马鞍型，并获得了较紫外诱
变更高的正突变率和更大的变异幅度［16］。虞龙等利
用低能离子注入 Vc 生产菌株，正突变率最高可达
23. 36%，最后筛选出的高产菌株可将糖酸转化率由
80%提高到 94. 36%［17］。菌体存活率曲线呈马鞍型可
能是因为低注量的 N +注入后，微生物细胞 DNA 和生
物膜等大分子受损，存活率下降。较高注量 N + 注入
后，电荷积累激活了细胞的修复机制，存活率上升。更
高注量 N + 注入后，保护屏障消失，存活率继续下
降［18］。离子注入诱变能够引起菌体染色体结构发生
改变，导致 DNA 链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质
在基因水平或分子水平上发生改变或缺失，可以大幅
提高突变率［9］。
嗜鞣管囊酵母是为数不多的能利用木糖发酵产乙
醇的菌种之一，它也可以利用葡萄糖，对提高生物质利
用率有很大的作用。但由于其利用木糖产乙醇能力仍
较低，所以许多学者在提高其乙醇产量方面做了很多
的研究。Zhao 等利用嗜鞣管囊酵母 1771 发酵 2% 的
木糖溶液，乙醇最大产量为 2. 7g /L［19］。本研究利用
原始菌株嗜鞣管囊酵母 As2. 1585 发酵 5% 的木糖溶
液，乙醇最大产量为 9. 26g /L，说明嗜鞣管囊酵母 As
2. 1585 在利用木糖产乙醇方面有较大的应用前景。
突变株 mut-54 乙醇产量较原始菌株提高 12. 74%，但
仍不足理论产量的 50%。这可能是因为代谢中间产
物木糖醇的过量积累［20］。嗜鞣管囊酵母利用 D-木糖
转化乙醇的代谢主要涉及两步氧化还原反应，木糖还
原酶在 NADPH 存在条件下转化 D-木糖为木糖醇，木
糖醇脱氢酶在 NAD + 存在条件下转化木糖醇为木酮
糖。木酮糖进入磷酸戊糖途径以及糖酵解途径转化为
乙醇。在两步氧化还原反应过程中，第 1 步较易生成
的木糖醇不能及时被第 2 步反应利用，造成木糖醇过
量积累，最后导致乙醇产量不高，糖醇转化率较低。后
续的研究工作可从提高木糖醇利用率方面着手。
4 结论
采用氮离子束注入技术对嗜鞣管囊酵母 As
2. 1585 进行诱变，结果表明菌体存活率曲线呈马鞍
型，最佳诱变注量为 12. 5 × 1014 ions / cm2，经筛选得到
1 株高产菌株 mut-54，其乙醇产量为 10. 44g /L，较原始
菌株提高 12. 74%，传代 7 次后乙醇产量稳定，其木糖
利用速率、生物量积累以及耐乙醇能力均高于原始菌
株。表明突变株 mut-54 发酵木糖产乙醇能力优于原
始菌株。本研究为离子注入诱变育种提供了较为成功
的案例。
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(责任编辑 王媛媛)
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