全 文 ：　核 农 学 报　2010, 24 (1) : 0031～0035
Journal of N uclear Agricu ltura l Sciences
收稿日期 : 2009209212　接受日期 : 2009212209
基金项目 :山西高校高新技术产业化项目 (410130) ,省青年基金 (2009021031 - 1) ,校青年基金 (2009014)
作者简介 :温银元 (19742) ,男 ,山西石楼人 ,讲师 ,研究方向为植物逆境生理及组织培养。Tel: 035426286809; E2mail: wen_yinyuan@ hotmail. com
通讯作者 :王玉国 (19552) ,男 ,山西昔阳人 ,教授 ,研究方向为植物逆境生理及组织培养 , Tel: 035426286399; E2mail: tgwygn@1261com
文章编号 : 100028551 (2010) 0120031205
银杏试管苗的雌雄鉴别与调控
温银元　王玉国　尹美强　赵　娟　王计平
(山西农业大学农学院 , 山西 太谷　030801)
摘 　要 :用不同浓度的赤霉素和乙烯利调控银杏试管苗的性别分化 ,通过 SOD、POD及酯酶同工酶和
ATP含量对银杏的雌雄株进行早期鉴别。结果表明 :银杏雌雄株间 SOD同工酶、酯酶同工酶和 ATP含
量不存在差异 , POD同工酶谱带有明显而稳定的差异 ,可作为银杏试管苗性别鉴定的指标。离体培养
时 ,试管苗在 90d时性别已分化 ;赤霉素和乙烯利可改变银杏试管苗雌雄株数的比例 ,且与激素的浓度
有关 ,当 GA3 浓度为 10mg·L - 1时 ,雄株的比例最大 ,为 86167% ,乙烯利在浓度为 5 mg·L - 1时雌株比例
最大 ,达 90%。
关键词 :银杏 ;试管苗 ;性别调控 ;同工酶 ; ATP含量
SEX IDENT IF ICAT IO N AND REGULAT IO N O F
G inkgo PLANTL ETS in vitro CUL TURED
W EN Yin2yuan　WANG Yu2guo　YIN Mei2qiang　ZHAO Juan　WANG J i2p ing
( College of Agronom y, Shanxi A gricu lture U niversity, Taigu, Shanxi　030801 )
Abstract: Ginkgo biloba L. sex differentiation of tissue2cultured p lantlets was regulated with gibberellin ( GA3 ) and
ethephon, and itsmale and female were identified by superoxide dismutase ( SOD) isoenzyme, esterase ( ES) isoenzyme,
peroxidase ( POD ) isoenzyme and ATP content. Results indicated that there was no obvious difference in SOD
isoenzyme, ES isoenzyme and ATP content between male and female p lantlets. But POD isoenzyme had obvious and
steady difference and could be an indicator to identify the male and female of Ginkgo tissue2cultured p lantlets. GA3 and
ethephon used in tissue2cultured p lantlets could induce the variation of sexual ratio. GA3 could induce more male p lants
and the highest male rate was at 10 mg·L - 1 GA3 treatment. More female p lants were induced by ethephon and the
highest female rate was achieved at ethephon concentration of 5 mg·L - 1.
Key words: Ginkgo biloba L. ; tissue2cultured p lantlets; sex regulation; isoenzyme; ATP content
　　银杏 (Ginkgo biloba L. )起源于 3亿年前 ,是现存
裸子植物中与恐龙同时代的最古老的孑遗植物 ,被公
认为“活化石 ”。因其全身是宝 ,集食用、药用、材用、
保健、观赏、生态防护于一体 ,在中国被当作“宝树 ”,
是一个重要的多用途特种经济生态型树种。银杏为典
型的雌雄异株植物 ,实生苗定植后需 20～30年才能开
花结籽 ,分出雌雄。因种子在成熟时具有一种特殊的
臭味 ,故作为城市绿化树时 ,只需要雄株 ,而以生产白
果为目的的银杏栽培 ,主要需要雌株 [ 1 ]。因此 ,对银
杏幼苗的雌雄性别进行早期鉴定 ,并用激素进行性别
调控 ,为生产上定向提供雌株或雄株 ,不仅具有重要的
科学研究价值和理论意义 ,而且具有特殊的经济价值
和实用价值。本研究通过同工酶和 ATP含量鉴别银
杏试管苗的性别 ,并分析赤霉素和乙烯对试管苗早期
性别分化的影响 ,以满足市场对雌性或雄性植株的需
求 ,同时为银杏的定向育种提供理论依据和实践指导。
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核　农　学　报 24卷
1　材料与方法
111　材料
以银杏 (Ginkgo biloba L. )优良品种“佛手 ”的新
鲜种子和雌雄株的嫩芽为试验材料。5月中旬采集雌
株和雄株的嫩芽 , 10月初采集种子 ,所有材料均取自
山东省郯城县新村乡。
112　试管苗雌雄鉴别与调控
分别取银杏雌雄株当年抽生枝条的顶芽各 30个 ,
对其同工酶谱和 ATP含量进行分析 ,然后将此分析结
果作为参照对银杏试管苗的性别进行鉴别。
11211　试管苗雌雄鉴别 　取银杏种子 ,剥去骨质中种
皮及膜质内种皮 ,经 70%酒精浸泡 30 s, 011% HgCl2
浸泡 10m in,无菌水冲洗 3～5次 ,用无菌滤纸吸干种
子表面的水分 ,取出种胚接种在 1 /4MS培养基上进行
萌发。成熟胚萌发 10d后 ,选择生长基本一致的试管
苗 ,转接于 MS培养基上 ,分别在 30、60、90和 120d
时 ,对试管苗取样进行同工酶谱分析 ,确定试管苗性别
分化的时期。
11212　试管苗的激素调控 　将生长一致的 10d龄试
管苗接种在附加不同浓度赤霉素 ( GA3 )或乙烯利 (2 -
氯乙基膦酸 ,上海彭浦化工厂产品 )的 MS培养基上 ,
第 90天 时取样进行同工酶电泳分析 ,研究赤霉素和
乙烯利对银杏试管苗性别分化的影响。
113　ATP含量测定
11311　样品制备 　取叶片 016g,加入 5m l丙酮 ,在沸
水浴中煮沸至丙酮完全挥发 (约 8m in) ,加入超纯水
5m l,再在沸水浴中加热浸提 8m in, 4℃、5000g离心
10m in,取上清液 ,放冰箱待用。测定时取上清液 ,
0145μm滤膜过滤 ,色谱分析进样量 20μl。
11312　色谱条件 　日本岛津 LD - 10AD高效液相色
谱仪 , SPD - 6AV紫外检测器和 C - R6A数据处理器。
色谱柱为 Hypersil C18不锈钢柱 (319mm ×30cm ) ;柱
温 27℃±2℃,流动相 011 mol·L - 1 Na2 HPO4 溶液 (磷
酸调 pH 610) ;流速 018 m l·m in - 1 ,检测波长 254nm;
灵敏度 01005 AUFS, ATT - 5,记录纸速 1cm·m in - 1。
114　同工酶分析
11411　酶液的制备 　取雌雄株嫩芽、试管苗和愈伤组
织各 013g,加 1m l提取缓冲液 ( Tris - HCl 011 mol·
L - 1 , pH 810,蔗糖 0145mol·L - 1 ,抗坏血酸 01006mol·
L - 1 , EDTA 0102mol·L - 1 ,聚乙烯吡咯烷酮 10% )和少
许石英砂 ,在冰浴上研磨成匀浆 , 4000g离心 10m in
(4℃) ,上清液即为酶提取液 ,置于 - 20℃冰箱保存待
用。
11412　电泳 　采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,
4℃下进行。浓缩胶 3% ,分离胶 715% ～10% (因不同
的酶而异 ) ,电极缓冲液为 Tris - 甘氨酸系统 ( pH
813) ,电泳时的电流强度 (稳流 ) :浓缩胶 30mA ,分离
胶 40mA。染色参照胡能书的《同工酶技术及其应
用 》[ 2 ]。
图 1　银杏雌雄株超氧化物歧化酶 ( a)、
酯酶 ( b)、过氧化物酶 ( c)同工酶图谱
Fig. 1　The superoxide dismutase ( a) ,
esterase ( b) and peroxidase ( c) isoenzyme bands
of Ginkgo biloba male and female p lants
1～7:雄株 ; 8～14:雌株
1～7: male p lantlet; 8～14: female p lantlets
2　结果与分析
211　雌雄株的同工酶和 ATP含量分析
分别取银杏雌雄株当年抽生枝条的顶芽各 30个 ,
对其同工酶谱和 ATP含量进行分析。结果表明 ,超氧
化物歧化酶 ( SOD)同工酶谱在雌雄株间没有差异 ,都
出现 3条谱带 (图 12a)。酯酶 ( ES)同工酶在所有供试
植株个体间存在差异 ,有的是 5条谱带 ,有的是 6条谱
带 ,但是雌株和雄株间酯酶同工酶谱带差别不明显 ,如
图 12b所示 ,在雄株的泳道中 ,泳道 2和 5缺少谱带23
　1期 银杏试管苗的雌雄鉴别与调控
E1,而谱带 E2没有在雌株泳道的 8和 9中出现 ;除泳
道 2, 5, 8, 9外 ,其余泳道均为 6条谱带。因此 , SOD同
工酶和酯酶同工酶不能作为区分银杏雌雄的指标。图
12c表明 ,过氧化物酶 ( POD )同工酶在雌雄株间有稳
定而明显的差异 ,雄株有 3条谱带 ,雌株有 5条谱带 ,
并且有特征谱带的出现 ,条带 P1、P3、P4在雌雄株中
都出现 ,而条带 P2和 P5只出现在雌株中。这表明
POD同工酶可作为一种指标对银杏的性别进行鉴定。
ATP含量在雌雄株间存在差异 ,但不显著 (图 2) ,
雄株中 ATP的含量为 01214μmol·mg- 1 FW ,雌株中为
01206μmol·mg- 1 FW ,不能直接用于性别的鉴定。
图 2　银杏雌雄株中 ATP含量的 HPLC图谱
Fig. 2　HPLC Chromatogram s of ATP content in male
and female Ginkgo biloba
图 3　银杏试管苗不同时期 POD同工酶谱带
Fig. 3　Peroxidase isoenzyme bands of p lantlets
in vitro at different culture time
212　银杏试管苗性别分化时间的确定
为确定银杏试管苗性别分化时期 ,将萌发的幼苗
接种在不含任何激素的培养基中 ,在培养 30、60、90和
120d时 ,从中随机选取 30株试管苗 ,分析它们的过氧
化物酶同工酶图谱 ,结果发现 (图 3) ,银杏试管苗在培
养初期 (30d和 60d) , POD同工酶谱带没有差异 ,都是
4条谱带 ,但它们的谱带类型与雌雄株的谱带类型 (图
12c)不一致 ,且强弱不同 ,表明银杏试管苗在 60d前性
别未产生分化。在 90和 120d时 POD同工酶图谱相
同 ,其谱带类型明显分为 2种 ,一类为 3条谱带 ,另一
类为 5条谱带 ,这和银杏雌雄株的同工酶谱带类型完
全一致 ,说明 90d苗龄的银杏试管苗性别已分化 ,在此
时期能够通过 POD同工酶对其进行雌雄鉴定。
213　赤霉素 ( GA3 )和乙烯利对银杏试管苗性别分化
的影响
银杏成熟胚萌发 10d后 ,选择生长基本一致的试
管苗转接于含不同浓度赤霉素和乙烯利的 MS培养基
上 ,苗龄第 90天时取样进行同工酶分析。从图 4可以
看出 ,经 GA3 处理后 ,试管苗 POD同工酶谱带类型多
与雄株的相同 ,而乙烯利处理后其同工酶谱带类型多
与雌株的相同。表 1表明 ,在不加激素的 MS培养中 ,
雌株占 53133% ,雄株为 46167% ,雌雄株比例接近 1∶
1。GA3 和乙烯利能显著改变银杏试管苗的雌雄比例 ,
随着 GA3 浓度的增加 ,产生雄株的比例加大 , 1mg·L - 1
和 5 mg·L - 1 的 GA3使雄株数及其比例与对照相比分
别达显著和极显著水平 ,雄株的比例在 GA3 浓度为 10
mg·L - 1时达到最大 (86167% ) ,但与 5 mg·L - 1处理间
不显著 ;乙烯利在浓度为 5 mg·L - 1时诱雌率最大 ,达
90% ,与对照及 1 mg·L - 1乙烯利相比达极显著水平 ,
当培养基中乙烯利的浓度增加到 10mg·L - 1时 ,雌株的
比例显著降低 ,为 76167%。
3　讨论
同工酶是性别分化基因和其 mRNA在蛋白质水
平上的体现 ,是基因在各种水平调控下表达产生的直
接产物 ,因此其研究也就是以基因产物认识基因的存
在和表达 ,由表现型反映基因型 [ 3 ]。雌雄株同工酶图
谱的差异预示着性别分化基因已经开始表达 ,植株朝
着已定的性别分化方向生长发育。只有在性别分化基
因表达前 ,利用激素调控基因表达 ,调控性别分化方
向 ,才能达到理论和生产上预期的目标 [ 4 ]。植物性别
分化 (在形态上表现为花器官的分化 )经历了生理生
化水平、细胞组织水平和形态水平 3个阶段 ,其中生理
生化水平是基础。性别调控基因的表达在生理水平上
必然会出现雌雄株之间的差异 ,这种差异可以通过其
基因产物 —蛋白质 (同工酶 )显现出来。银杏是雌雄
异株的木本植物 ,其花器官的形成需要在 5～6年生的
植株上方可显现出来。而根据目前国内外研究 ,植物
性别分化的调控必须在植株的早期阶段 (即性别分化
尚未显现出来的阶段 )完成。国外研究者对大麻、黄
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核　农　学　报 24卷
瓜等进行试验 ,发现它们的性别分化在实生幼苗长出
第 1对真叶时即已完成 ,且不可通过激素调控逆转其
性别。而对于银杏这样的多年生木本植物来说 ,由于
其花器官形成较晚 ,故对其性别分化的调控及早期性
别鉴定存在着一定的困难。
图 4　赤霉素 ( GA3 )和乙烯利处理后 80d银杏试管苗的 POD同工酶图谱
Fig. 4　POD isoenzyme bands of p lantlets in vitro 80d after treated with GA3 and ethephon
表 1　赤霉素 ( GA3 )和乙烯利对银杏试管苗性别分化的影响
Table 1　Effect of GA3 and ethephon on sex differentiation of tissue2cultured p lantlets
激素
hormone
浓度
concentration
(mg·L - 1 )
雌株数
female p lants
(No. )
雌株比例
female per
cent ( % )
雄株数
male p lants
(No. )
雄株比例
male per cent
( % )
CK — 16 ±2116c CD 53133 ±7120 c CD 14 ±2116c BC 46167 ±7120 c BC
1 12 ±2. 66dD 40. 0 ±8. 82dD 18 ±2. 66bB 60. 0 ±8. 82bB
GA3 5 6 ±2. 00eE 20. 0 ±6. 67eE 24 ±2. 00aA 80. 0 ±6. 67aA
10 4 ±1. 73eE 13. 33 ±5. 77eE 26 ±1. 73aA 86. 67 ±5. 77aA
乙烯利 1 19 ±1. 00cBC 63. 33 ±3. 33cBC 11 ±1. 00cCD 36. 67 ±3. 33cCD
Ethephon 5 27 ±2. 65aA 90. 0 ±8. 82aA 3 ±2. 65eE 10. 0 ±8. 82eE
10 23 ±1. 73bAB 76. 67 ±5. 77bAB 7 ±1. 73dDE 23. 33 ±5. 77dDE
注 :表中数据后带有相同小写 /大写字母表示在 0105 /0101水平不显著。
Note: The data followed by common small and cap ital letters indicated no significant at 0105 and 0101 levels, respectively.
　　詹亚光等 [ 3 ]认为雌雄株鉴别技术的应用潜力更
主要在于苗木性别的早期鉴定 ,确定了 SOD、POD 活
性可作为水曲柳性别鉴定的依据 ,此雌雄株 5、10月的
SOD活性和 6月的 POD活性差异极显著 ,为雄株大于
雌株。范双喜等 [ 5 ]认为石刁柏雄株均比相应的雌株
少一条酶带 ,且雌雄植株组织培养获得的愈伤组织和
茎尖过氧化物酶同工酶酶谱也有类似的差异规律。
Dennis等 [ 6 ]用乙烯利和 AgNO3 改变了离体培养的桑
树雌雄株茎段再生苗的性别 ,且浓度不同诱导结果不
同 ,乙烯利在 210 mg·L - 1时效果最好。Kumar等 [ 7 ]用
乙烯利和氯甲丹处理番木瓜雄株 ,发现诱导产生的两
性花和雌花后来都能结果 ,这种性反转同时伴有可溶
性蛋白和 POD 质和量上的变化。 0104 ～4 mg·L - 1
GA3 对离体培养苦瓜两性花的性别分化有促雌作用 ,
0104～4 mg·L - 1 CCC则有促雄作用 ,高浓度的 CCC也
具有促雌作用 ,且与整体培养时的调控作用相同 [ 8 ]。
苎麻性别分化与内源乙烯密切相关 ,高水平乙烯释放
速率诱导雌性苎麻的产生。乙烯合成抑制剂 AVG和
作用抑制剂 AgNO3 ,均可以抑制雌性花的形成 ,其中以
AVG处理的效果较好 ,浓度以 300 mg·L - 1最佳 [ 9 ]。田
砚亭等 [ 4 ]用 GA3 和乙烯利处理 10d生银杏实生幼苗
以调控其性别逆转 ,发现实生苗在 90d龄时 ,即可确定
性别分化。在离体条件下 ,硫代硫酸银 ( STS)和 GA能
有效地改变瓠瓜的潜在雌花芽性别分化方向 ,在 IAA、
BA和 ACC各为 1μmol·L - 1的 MS培养基中 ,添加 GA
5～20μmol·L - 1可显著诱导瓠瓜侧芽上的潜在雌花芽
发育成为雄花 , STS 100～500μmol·L - 1诱导雄花的效
果最佳 ,且比 GA好 [ 10 ]。
本试验中 ,银杏雌雄株间 POD同工酶谱带存在差
异 ,而 SOD、酯酶同工酶谱带没有明显的差异。离体
培养时 ,试管苗在 90d龄时性别已分化 , GA3 和乙烯利
对银杏试管苗的性分化有调节作用 ,使 POD同工酶谱
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带产生 2种类型 ,一种与雌株的相同 ,另一种与雄株的
相同。同时发现诱导率与激素浓度有关 , GA3 10
mg·L - 1使雄株的比例为 86167% ;乙烯利 5 mg·L - 1使
雌株的比例达 90% ,当增加到 10 mg·L - 1时雌株的比
例下降为 76167%。这可能是由于银杏雄性决定基因
和雌性决定基因分别在 GA3 和乙烯利的作用下发生
去阻遏作用 ,使特异基因选择性地表达 ,实现性别分化
程序表达 ,从而起到性别调控的作用。因此可根据生
产实践的需要 ,用适当浓度的 GA3 和乙烯利调控银杏
的雌雄分化 ,并以 POD同工酶谱带为指标来鉴定试管
苗的性别 ,满足生产中对雌性或雄性植株的选择性需
求 ,为银杏的定向育种提供理论依据和实践指导。此
试验结果与钟诲文 [ 11 ]、田砚亭 [ 4 ]和陈学森 [ 12 ]的结果
有些差别 ,但银杏的雌株比雄株 POD同工酶谱带多一
点是相同的 ,其他差别可能是由于所用银杏品种及试
验中一些具体操作方法不同造成的。
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(责任编辑 　王媛媛 )
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