全 文 ： 核 农 学 报 2010, 24 (1) : 0041～0045
Journal of N uclear Agricu ltura l Sciences
文章编号 : 100028551 (2010) 0120041205
优良解磷菌株诱变选育与解磷培养基优化
孙剑秋 王 鹏 张 建 臧 威 王登宇 李 铁 王 红
(齐齐哈尔大学生命科学与工程学院 ,黑龙江 齐齐哈尔 161006)
摘 要 :对解磷菌枯草芽孢杆菌 X1055进行紫外线诱变选育 ,筛选到优良解磷突变株 1055Y1。该菌株摇
瓶培养 72h发酵液中有效磷含量最高达到 5122mg/L ,解磷能力比出发菌株提高 1718%。在单因子试验
筛选最适碳源、氮源基础上 ,通过 Plackett2Burman设计 ,确定接种量、pH、KCl浓度等因素对突变株
1055Y1解磷能力具有显著影响。应用爬坡试验和 Box2Behnken设计的响应面法 ,对突变株 1055Y1解
磷培养基进一步优化。结果表明 :在 250m l发酵培养基中 ,接种量 10121m l、pH 6175、KCl浓度 0112g/L
时 ,突变株 1055Y1解磷达到最佳水平 ,发酵液有效磷含量达到 7103mg/L。
关键词 :解磷细菌 ;紫外线诱变 ;解磷培养基 ;响应面法
M UTANT SCREENING AND M ED IUM O PTIM IZING O F A PHO SPHATE2D ISSOL VING BACTERIA STRA IN
SUN J ian2qiu WANG Peng ZHANG J ian ZANG W ei WANG Deng2yu L I Tie WANG Hong
( College of L ife Science and Engineering, Q iqihar U niversity, Q iqihar, Heilongjiang 161006)
Abstract:Mutant 1055Y1 was obtained from the phosphate2dissolving bacteria B acillus subtilis X1055 by UV mutation.
Compared with that of the original strain, the phosphate2dissolving ability of the mutant was increased by 1718% , and
the available phosphate content reached 5122mg/L in the broth liquid cultured for 72h. Based on two single2factor
experiments of the op timal carbon and nitrogen sources screening, the phosphate2dissolving ability of the mutant was
evidently affected by inoculum, pH, KCl concentration through the Plackett2Burman analysis. The phosphate2dissolving
medium of the mutant 1055Y1 was op tim ized by the steepest ascent p rocedures and Box2Behnken analysis. The results
showed that the available phosphate content in the mutant broth liquid came to 7103mg/L under the condition of
10121m l of inoculum, pH 6175, and 0112g /L of KCl in 250m l broth.
Key words: phosphate2dissolving bacteria; UV mutation; phosphate2dissolving medium; response surface methods
收稿日期 : 2009204218 接受日期 : 2009210216
基金项目 :黑龙江省普通高等学校骨干教师创新能力资助计划 (1055G063) ,齐齐哈尔市农业攻关及推广计划项目 (NG06244)
作者简介 :孙剑秋 (19692) ,男 ,黑龙江德都人 ,博士 ,教授 ,硕士生导师 ,主要研究方向为微生物资源生态学和遗传育种学。E2mail: jianqius@
163. com
解磷细菌在农田土壤中分布广泛 ,大部分存在于
作物根际 [ 1, 2 ]。磷是植物生长必需的重要元素 ,但土
壤中绝大部分磷素是植物不能吸收利用的无效磷 ,以
Ca、Fe、A l等化合物形式大量存在 [ 3 ]。与磷素转化和
供应直接相关的解磷细菌 ,可以提高土壤肥力 ,将作物
难于利用的磷转化为可吸收利用状态 ,使土壤中有效
磷含量提高 ,从而影响农作物的生物量和产量 [ 4 ] ;可
以改善土壤生态环境 ,将土壤中无效磷转化成有效磷 ,
在减少化肥大量使用、减轻环境富营养化压力、对土壤
进行微生物修复等方面具有重要潜力 [ 5 ]。为筛选优
良解磷细菌 ,更好地满足未来农业生产需要 ,在解磷细
菌选育、解磷条件优化方面的研究已经受到重视 [ 6, 7 ]。
本文以分离自小麦根际土壤的枯草芽孢杆菌
X1055为对象 ,通过紫外线诱变选育到高效解磷突变
株 1055Y1;利用 M initab软件中 Plackett2Burman设计
和 Box2Behnken设计 ,通过响应面分析优化解磷突变
株发酵培养基中的解磷条件 ,在菌种选育、解磷条件的
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核 农 学 报 24卷
基础研究方面进行尝试和探索。
1 材料与方法
111 出发菌株
X1055, 2007年春季分离自黑龙江省五大连池风
景区小麦 ( Triticum aestivum )根际土壤 ,鉴定为枯草芽
孢杆菌 (B acillus subtilis) ,保藏于齐齐哈尔大学微生物
遗传生态学研究室。
112 培养基
有机磷培养基 ( g /L ) [ 8 ] :葡萄糖 10, (NH4 ) 2 SO4
015, NaCl 013, KCl 013, MgSO4 ·7H2 O 013, FeSO4 ·
7H2O 0103,MnSO4 ·4H2 O 0103, CaCO3 5,卵磷脂 012,
pH 710～715。
牛肉膏蛋白胨培养基参照文献 [ 9 ]配制。
113 诱变处理
将解磷菌株 X1055用牛肉膏蛋白胨培养基活化 ,
制成 108 个 /m l菌悬液 ,紫外灯分别照射 (15W , 30cm )
30、60、90、120和 150 s,适当稀释后涂皿避光培养 ,根
据菌落长出情况绘制致死率曲线图 ;根据诱变存活菌
株在有机磷培养基上形成解磷透明圈直径与菌落直径
比观察诱变效应 ,并对突变株平板解磷能力稳定性进
行评价。
114 解磷能力测定
将充分活化的优良解磷菌株和出发菌株采用有机
磷培养基振荡培养 24h制成种子液 ,以 2%接种量接
于装液量为 250m l的 500m l三角瓶中 , 37℃、120 r/m in
振荡培养 96h,培养液离心 10m in ( 4000 r/m in) ,采用
钼蓝比色法测定上清液中有效磷含量 [ 10 ]。
115 解磷培养基优化
在单因子试验筛选最适碳源、氮源基础上 ,利用
M initab软件中 Plackett2Burman 设计和 Box2Behnken
设计 ,通过响应面分析优化解磷突变株解磷条件。
2 结果与讨论
211 X1055致死率曲线及诱变剂量选择
紫外线 (UV)诱变处理出发菌株 X1055,致死曲线
如图 1。通过致死率曲线可以找到诱变剂量 2致死率 2
突变率三者最佳结合点 ,致死率达到 75% ～85%时为
较合适的诱变剂量 [ 11 ]。根据图 1,菌株 X1055适宜诱
变剂量约为 15W、30cm、30 s。
212 解磷菌 X1055紫外诱变选育
对菌株 X1055紫外诱变 15 W、30cm、30 s,根据诱
变存活菌株在有机磷培养基上形成解磷透明圈直径与
菌落直径比 ,观察紫外线对解磷菌 X1055诱变效应
(表 1)。
图 1 枯草芽孢杆菌 X1055紫外线诱变致死曲线
Fig. 1 The death rate of B acillus subitilis
X1055 by UV
表 1 解磷菌 X1055的紫外诱变效应
Table 1 UV mutagenic effect of phosphate2
dissolving strain X1055
平板编号
No1 总菌落数totalcolony
number
正变菌落数
positive
mutation
colony
number
负变菌落数
negative
mutation
colony
number
正突变率
positive
mutation
rate ( % )
负突变率
negative
mutation
rate ( % )
1 64 18 9 2811 1411
2 72 20 14 2718 1914
3 120 16 6 1313 510
平均
average
2311 1218
以有机磷培养基上形成解磷透明圈直径与菌落直
径比为指标 ,选取正向突变优良解磷菌株 1055Y1、
1055Y2、1055Y3,连续传代 5次并观察有机磷培养基
上形成解磷透明圈直径与菌落直径比值 (表 2) ,根据
突变株平板解磷能力变化对遗传稳定性能进行评价。
从表 2可见突变株 1055Y1、1055Y2、1055Y3解磷能力
稳定遗传。
表 2 优良解磷突变菌株平板解磷能力稳定性
Table 2 Stability of the phosphate2dissolving ability
of the mutant on p lates
优良突变株
mutant
第 1代
first
generation
第 2代
second
generation
第 3代
third
generation
第 4代
fourth
generation
第 5代
fifth
generation
1055Y1 1139 1141 1128 1134 1132
1055Y2 1127 1121 1123 1121 1125
1055Y3 1125 1112 1124 1126 1113
213 突变株 1055Y1液体解磷能力
以出发菌株 X1055为对照 ,测定平板解磷表现最
好的突变株 1055Y1的液体解磷能力。结果发现 ,摇
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1期 优良解磷菌株诱变选育与解磷培养基优化
瓶培养 6h突变株 1055Y1 培养基中有效磷含量同
X1055相比有效磷增加 63% ;培养 12～96h,突变株
1055Y1培养基中有效磷含量比出发菌株有效磷增加
17% ～24% ;其中突变株 1055Y1和出发菌株 X1055
培养到 72h时 ,摇瓶培养基中有效磷含量达到最高 ,分
别为 5122mg/L和 4143mg/L ,这时 1055Y1液体解磷
能力较出发菌株高 1718% (图 2)。
图 2 突变株 1055Y1与出发菌株 X1055液体解磷能力比较
Fig. 2 The phosphate2dissolving ability of the mutant
1055Y1 and the original strain X1055 in liquid medium
214 突变株 1055Y1解磷培养基优化
21411 碳源种类对发酵液有效磷含量影响 分别以
1% (W /V )蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、甘油、甘露醇作
为碳源进行液体发酵培养基最适碳源筛选。试验结果
见图 3,可以看出突变株 1055Y1利用可溶性淀粉作为
碳源表现出更好的解磷能力。
21412氮源对有效磷含量的影响 以可溶性淀粉为碳
源 ,分别以 015% (W /V )蛋白胨、硫酸铵、亚硝酸钠、
硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、尿素、玉米浆、氯化铵为氮源
图 3 不同碳源对突变株 1055Y1解磷能力影响
Fig. 3 Effcets of carbon sources on the
phosphate2dissolving ability of the mutant 1055Y1
进行最适氮源筛选 ,研究表明以玉米浆作为氮源利于
突变株 1055Y1解磷 (图 4)。
21413 Plackett2Burman设计筛选影响解磷的显著因
子 在确定突变株 1055Y1解磷最适碳源、氮源基础
上 ,选用 N = 15 (设置 3 个空白误差分析项 ) 的
Plackett2Burman设计 ,研究碳源、氮源、温度、pH、转
速、接种量、NaCl等 12个因素对突变株 1055Y1解磷
能力的影响。每个因素取高低 2个水平 ,低水平为原
始培养条件 ,利用 M initab软件处理数据。结果表明 ,
接种量、pH、KCl对试验结果影响最为显著 (可信度达
95% ) ,其次为氮源和 CaCO3 ,其他试验因素效应值均
小于试验误差 (表 3)。
21414 最陡爬坡试验 根据 Plackett2Burman设计试
验结果 ,选取影响突变株 1055Y1解磷能力最显著的
接种量、pH、KCl 3个因素 ,在最陡爬坡试验中结合试
验需要对解磷影响因子变化和步长进行相应设计。从
表 4 可见 ,第 5 组试验中发酵液有效磷含量达到
7101mg/L ,所以接种量 11m l、pH 617、KCl含量 011g/L
为最佳坡度。
图 4 不同氮源对突变株 1055Y1解磷能力影响
Fig. 4 Effects of nitrogen sources on the phosphate2dissolving ability of the mutant 1055Y1
34
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表 3 Plachett2Burman试验设计各因素水平及效应值
Table 3 Factors level and effect estimate of Plachett2Burman
因素
factor
水平 level
低 low 高 high
效应
effect
系数
coefficient
显著性检验 test of significance
T值 value P值 value
碳源 carbon source 10g/L 12g/L - 010353 - 010177 - 011 01927
氮源 nitrogen source 015g/L 016g/L - 019302 - 014651 - 2158 01061
pH 710 810 - 114738 - 017369 - 4109 01015
温度 temperature 37℃ 39℃ 013272 011636 0191 01415
装液量 media volumn 200m l 250m l - 010868 - 010434 - 0124 01822
卵磷脂 lecithin 012g/L 0125g/L 015083 012541 1141 01231
NaCl 013g/L 0137g/L 012836 011418 0179 01475
KCl 013g/L 0137g/L - 111312 - 015656 - 3114 01035
MgSO4 013g/L 0137g/L - 013940 - 011970 - 1109 01336
CaCO3 5g/L 6g/L - 018001 - 014001 - 2122 01091
摇床转速 rotating speed 120 r/m in 150 r/m in 012839 011419 0179 01475
接种量 inoculation amount 5m l 7m l 216560 113280 7137 01002
误差项 error - 1 1 016188 013094 1172 01161
误差项 error - 1 1 - 011023 - 010512 - 0128 01791
误差项 error - 1 1 011420 010710 0139 01714
表 4 最陡爬坡试验设计及结果
Table 4 Experimental p lan and
results of steepest accent
编号
No1 接种量inoculation
amount (mL)
pH
KCl
( g/L)
有效磷含量
available phosphate
content (mg/L)
1 7 715 013 6144
2 8 713 0125 6170
3 9 711 012 6164
4 10 619 0115 6189
5 11 617 011 7101
6 12 615 0105 4143
21415 Box2Behnken优化试验 采用 Box2Behnken设
计对接种量、pH和 KCl等显著影响突变株 1055Y1解
磷能力的因素进一步优化 ,每个因素 3个水平的取值
根据最陡爬坡试验最佳坡度 (第 5组试验为中心点 )
进行 (表 5)。
表 5 响应面三因素三水平试验设计
Table 5 The experiment design of 3 factors and
3 levels of response surface method
因素
factor
编码
encode
水平 level
- 1 0 + 1
接种量 inoculation amount (m l) X1 9 11 12
pH X2 615 617 710
KCl ( g/L) X3 0105 011 0115
试验完成后应用 M initab软件对数据进行二次推
理回归拟合 ,得到包括一次项、平方项、交互相二次方
程 ,分析各因素主效应和交互效应 ,最后在一定水平范
围内求取最佳值 (表 6)。由表 6可知 3个因素影响有
效磷含量的回归系数为 6198, p值 < 0105的接种量
项、接种量二次方项、pH二次方项和接种量与 pH的
交互项为显著影响项 ,回归方程为 Y = 6198 - 0117A -
0132A2 - 0140B2 - 0132AB。
表 6 回归方程系数显著性检验
Table 6 Significance test of regression coefficient
模型项
model
回归系数
regression
coefficient
标准误
standard
error
T值
value
P值
value
常量 constant 61978 0110881 641129 01000
A - 0117488 0106663 - 21625 01047
B 0106404 0106663 01961 01381
C 0109606 0106663 11442 01209
A3 A - 0131609 0109808 - 31223 01023
B3 B - 0139984 0109808 - 41077 01010
C3 C - 011289 0109808 - 11314 01246
A3 B - 0131527 0109423 - 31346 01020
A3 C - 0103448 0109423 - 01366 01729
B3 C - 0115764 0109423 - 11673 01155
根据模型方程作响应曲面 (图 5) ,图 5显示了接
种量位于中心水平时 , pH和 KCl交互作用对突变株
1055Y1发酵液有效磷含量影响的曲面图。结果表明 ,
pH和 KCl两因素的交互作用不显著 ,这和回归分析结
果相一致。同样接种量与 pH、接种量与 KCl的交互作
用对突变株 1055Y1发酵液有效磷含量影响也不显著。
根据响应面分析 ,接种量为每 250m l发酵液接种
子液 10121m l、pH为 6175、KCl含量 0112g/L时 ,有效磷
含量达到 7103mg/L,突变株 1055Y1表现出最优解磷水
平。经过 3次验证试验 ,结果 (图 6)与预测结果基本一
致 ,进一步说明该模型可以较好预测实际发酵情况。
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图 5 pH与 KCl交互作用对 1055Y1发酵液
有效磷含量影响的响应曲面
Fig. 5 Surface layer the mutual affection of pH
and KCl on available phosphate content in the
mutant 1055Y1 fermentation liquid
图 6 突变株 1055Y1解磷水平的验证试验
Fig. 6 The verification test of the phosphate2
dissolving condition of the mutant
3 结论
解磷细菌在农业生产中可以提高土壤肥力、改善
土壤环境 ,但是欲真正用于生产必须选育抗逆性和解
磷能力强的菌株。以产芽孢并具有解磷能力的枯草芽
孢杆菌为材料 ,进行优良解磷细菌选育并优化解磷培
养条件具有重要实践意义。
采用单因子试验与 Plackett2Burman设计和响应
面分析相结合 ,研究优良解磷突变株 1055Y1的解磷
培养条件 ,可以从多种解磷影响因素中快速、有效地筛
选出主效因子并实现解磷培养基优化。优化结果与实
际情况基本吻合 ,解磷突变株 1055Y1在 pH 6175、KCl
含量 0112g/L的 250m l发酵液中 ,接入种子 10121m l,
有效磷含量可达到 7103mg/L。
参考文献 :
[ 1 ] 王 鹏 , 孙剑秋 , 臧 威 ,蒋本庆 ,王登宇 ,李 铁. 磷细菌研究
进展. 河南农业科学 , 2008, 9: 5 - 9
[ 2 ] Chen Y P, Rekha P D, A run A B, et al. Phosphate solubilizing
bacteria from subtrop ical soil and their tricalcium phosphate
solubilizing abilities[ J ]. App lied Soil Ecology, 2006, 34: 33 - 41
[ 3 ] Patel D K, A rchana G, Kumar G N. Variation in the nature of
organic acid secretion and m ineral phosphate solubilization by
Citrobacter sp. DHRSS in the p resence of different sugars[ J ]. Curr
M icrobiol, 2008, 56: 168 - 174
[ 4 ] Tilak K V B R, Ranganayaki N, Pal K K, et al. D iversity of p lant
growth and soil health supporting bacteria [ J ]. Current Science,
2005, 89 (1) : 136 - 150
[ 5 ] Thakuria D, Talukdar N C, Goswam i C, et al. Evaluation of rice2
legume2rice cropp ing system on grain yield, nutrient up take,
nitrogen fixation, and chem ical, physical, and biological p roperties
of soil[ J ]. B iol Fertil Soils, 2009, 45: 237 - 251
[ 6 ] 李 华 , 陈万仁 , 陈 欣. 磷细菌突变株的诱变选育 [ J ]. 土壤 ,
2002, 6: 3442347
[ 7 ] 郝 晶 , 洪坚平 , 谢英荷 , 刘 冰 ,张 健. 石灰性土壤磷细菌
的分离、筛选及解磷效果 [ J ]. 山西农业科学 , 2005, 33 ( 4) : 56
- 59
[ 8 ] 中国科学院南京土壤研究所微生物室. 土壤微生物研究法 [ J ].
北京 : 科学出版社 , 1985: 50
[ 9 ] 沈 萍 , 陈向东. 微生物学实验 (第 4版 ) . [M ] 北京 : 高等教育
出版社 , 2007, 241
[ 10 ] 吕英华 , 秦双月. 测土与施肥 [ J ]. 北京 : 中国农业出版社 ,
2002: 70 - 73
[ 11 ] 宋安东 , 苏丽娟 , 谢 慧 , 曲音波 ,杨 铭.γ射线对斜卧青霉的
诱变筛选及产酶条件优化 [ J ]. 核农学报 , 2008, 22 ( 3) : 280 -
285
(责任编辑 王媛媛 )
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