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EFFECTS OF X RAY ON CITRUS CALLUS AND PROTOPLASTS

软X射线对柑桔愈伤组织和原生质体的影响



全 文 :此文于 1997 年 9 月 30 日收到。
国家自然科学基金资助课题。
软 X 射线对柑桔愈伤组织和原生质体的影响
刘继红 邓秀新
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 武汉 430070)
研究了软 X射线对丹西红桔 ( Cit rus reticulata) 愈伤组织和原生质体的影响。
结果表明 ,辐照 1h 和 115h 都在不同程度上抑制了愈伤组织的生长 ,辐照 115h 表现
更为明显 ;原生质体经辐照 115h 后分裂的很少 ,在培养过程中发生质壁分离 ,辐射
1h 的原生质体受抑制的作用小一些。
关键词 :柑桔  原生质体  愈伤组织  X射线
前   言
柑桔是我国南方的一种重要水果 ,近年来全国柑桔业发展较快。由于柑桔自身的一些特
点 (如多胚性、部分品种雌雄生殖器官败育、童期长和遗传上高度杂合) ,使得通过有性杂交实
现基因重组具有一定的困难 ,其遗传研究的进程也很慢。原生质体融合是实现基因交流、克服
性器官不育的一条新途径。自 1985 年 Ohgawara 等人得到首例属间体细胞杂种[1 ]以来 ,已得
到很多柑桔种属间体细胞杂种[2 ] ,创造出自然界不存在的新种质 ,丰富了柑桔种质资源。但
现有研究表明 ,大多数情况下 ,融合导致得到的异源四倍体体细胞杂种倍性增加 ,难以直接成
为育种上有价值的接穗材料[3 ] 。原生质体非对称融合技术是从供体亲本转移部分遗传物质
到受体亲本的一种行之有效的方法 ,有可能解决倍性增加的问题。非对称融合是在融合前用
射线对融合亲本一方的原生质体进行照射 (目的是造成 DNA 断裂) ,再和另一方原生质体融
合。有关柑桔原生质体非对称融合研究还不多 ,仅 Vardi 等得到 5 例胞质杂种[4 ,5 ] 。本研究采
用 X射线对柑桔愈伤组织和原生质体进行处理 ,试图找出适合于柑桔原生质体非对称融合的
处理方法。
材 料 与 方 法
愈伤组织 丹西红桔 ( Cit rus reticulata) 愈伤组织悬浮于液体培养基中 ,培养基为 M T +
015g/ L 麦芽提取物 + 115g/ L 谷氨酰胺 + 5 %蔗糖。每 15d 继代 1 次 ,继代 3 次后 ,在第 7d 时
取愈伤组织用于辐照和分离原生质体。
原生质体的分离和纯化  取 1g 左右上述愈伤组织 ,放在加有 3ml 溶液 (1 %纤维素酶 +
2 %果胶酶共 115ml 和 115ml EME 培养基[6 ])的培养皿中 ,28 ℃时酶解 20h ,用不锈钢网过滤 ,
经 13 %甘露醇 - 25 %蔗糖界面法离心纯化原生质体。
713 核 农 学 报 1998 ,12 (5) :317~320Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
愈伤组织和原生质体辐照 辐射源是日本产的软 X射线光机 (SOFTX M280WE) ,愈伤组
织和原生质体放在离光源 15cm 处 ,在 80 KVp ,5mA 下分别辐照 1h 和 115h ,以未经辐照的愈
伤组织和原生质体作为对照。
愈伤组织和原生质体的培养 愈伤组织 :培养基为 M T + 5 %蔗糖 + 017 %琼脂 ,在光照培
养室里培养 ,在培养当天、第 15d 和第 30d 时测愈伤组织的干重。原生质体采用液体浅层培
养 ,培养基为 BH[6 ]3 ,在光照培养箱内培养 ,培养过程中通过倒置显微镜观察原生质体生长情
况。
结 果 与 分 析
(一)软 X射线对愈伤组织的影响
从表 1 中可以看出 ,随着辐照时间的延长 ,愈伤组织生长受抑制的作用也随之增强 ,在第
30d 时 ,辐照 115h 的愈伤组织的干重比对照下降 4717 % ,辐照 1h 的只下降 2412 % , 而对照的
干重却增加 119 %。辐照 115h 的愈伤组织在后 15d 时下降的幅度比前 15d 还大 ,表明 X 射线
作用具有一定的持久性。而辐照 1h 的愈伤组织在后 15d 重量又有所增加 ,可能是因为辐射的
作用已经失去 ,部分细胞恢复了原来的生长。从愈伤组织的颜色变化也可以看出 X 射线对愈
伤组织的抑制作用。在整个培养过程中 ,对照的颜色一直是乳白色 ,培养到第 15d 时 ,辐照 1h
的愈伤组织有一部分为乳白色 ,已经可以看到愈伤组织变褐 ,而辐照 115h 的愈伤组织变褐的
部分超过乳白色部分 ,到第 30d 时 ,辐照 1h 的愈伤组织变成褐色 ,而辐照 115h 的愈伤组织有
一部分变黑。从体积上也能看出这种作用 ,在培养当天 ,辐照 115h 的愈伤组织的体积比对照
大 ,辐照 1h 的与对照差不多 ,但在第 30d 时 ,经辐照 1h 和 115h 的愈伤组织的体积都小于对照
(图版 Ⅰ) 。
表 1  软 X射线对丹西红桔愈伤组织生长的影响
Table 1  Effects of X2ray on the growth of callus of Dancy tangerine
处理时间
Time of treatment
(h)
在培养过程中所测得的干重 (g)
Dry weight of callus
第 1d
The 1st day
第 15d
The 15th day
第 30d
The 30th day
干重增加或减少
Increase or decrease of
dry weight ( %)
增 加
Increase
减 少
Decrease
0 0136 0156 0179
1 0133 0122 0125 119 2412
115 0145 0135 0124 4717
(二)软 X射线对原生质体的影响
在培养过程中观察到 ,对照原生质体在第 7d 左右就能看到第 1 次分裂 (图版 Ⅱ21) ,以后
持续分裂 ,形成多细胞团 (图版 Ⅱ22) ,辐照 1h 的原生质体分裂要比对照晚 ,但一旦出现分裂
后 ,与对照没有多大差别 ,这也可以从另一个侧面说明辐照 1h 的愈伤组织为什么在后 15d 重
量有所增加的原因。经辐照 115h 的原生质体分裂少 ,有的培养皿中完全没有发现分裂的细
胞 ,在培养过程中观察到原生质体发生质壁分离 (图版 Ⅱ23) 。因此 ,辐照时间越长 ,原生质体
分裂受抑制的作用也就越明显。
813 核 农 学 报 12 卷
图版 Ⅰ 培养的丹西红桔愈伤组织
Plate Ⅰ Cultured callus
of Dancy tangerine
图版 Ⅱ 培养的丹西红桔原生质体
Plate Ⅱ Cultured protoplasts of Dancy tangerine
11 第 1 次分裂 2  形成多细胞团
3  原生质体发生质壁分离
1  The 1st division of the cultured protoplast
2  Formation of multicellular cluster from the cultured protoplast
3  Plasmolysis of the cultured protoplasts
讨   论
自 Zelcer 等通过非对称融合得到胞质杂种[7 ]以来 ,非对称融合技术发展很快 ,现在已经获
得很多作物非对称杂种或胞质杂种。在非对称融合中 ,常用的射线为 X、γ或紫外线 ( UV) ,
Vardi 等人用γ射线辐照原生质体再进行融合 ,而 X 射线还没有用于柑桔原生质体非对称融
合 ,故研究 X射线的作用是有必要的。X 和γ射线都是电离射线 ,辐照的目的都是造成染色
体的断裂 ,最终在杂种的再生过程中部分或全部丢失。辐照的对象有两种 ,一种是愈伤组织 ,
再用被辐照的愈伤组织分离原生质体 ;另一种是直接辐照原生质体。目前的研究大多数是采
用后者 ,可能是原生质体对射线的作用更为敏感的缘故。从本实验中也可以看出 ,辐照原生质
体作用比辐照愈伤组织好。关于辐照的时间 (也就是所用的剂量) ,本实验表明 ,辐照 115h 较
为适宜 ,可以用作本体系下非对称融合中原生质体预处理的时间。辐照 1h 虽然也有抑制作
913 5 期 X射线对柑桔愈伤组织和原生质体的影响
用 ,但效果要比 115h 差 (表现在干重的下降幅度和原生质体恢复分裂两个方面) 。
参 考 文 献
1  Ohgawara T , Kobayashi S , Ohgawara E , Unimiya H , Ishii S. Somatic hybird plants obtained by protoplast fusion between
Cit rus sinensis and Ponci rus t rif oliata. Theor Appl Genet , 1985 ,74 :1~4
2  邓秀新 ,刘继红. 果树遗传转化及基因组转移研究进展. 武汉植物学研究 ,1996 ,14 (4) :357~369
3  邓秀新 ,邓占鳌 ,叶新荣 ,甘 霖 ,章文才. 我国柑桔原生质体操作与育种研究进展. 农业科学集刊 ,1995 ,2 :129~137
4  Vardi A , Breman A , Galun E. Citrus cybrids :production by donor2recipient protoplast fusion and verification by mitochondrial
DNA restriction profiles. Theor Appl Genet , 1987 ,75 :51~58
5  Vardi A. Protoplast2fusion2mediated transfer of organelles from microcitrus into citrus and regenration of novel alloplasmic trees.
Theor Appl Genet , 1989 , 78 :741~747
6  Grosser J W , Gmitter FG. Protoplast fusion and citrus improvement . Plant Breed Rev , 1990 ,8 :339~374
7  Zelcer A , Aviv D , Galun E. Interspecific transfer of cytoplasmic male sterilit y by fusion between protoplasts of normal Nicotiana
sylvest ris and X2irradiated protoplasts of male sterile N . tabacum . Z Pflanzenphysiol ,1978 ,90 :397~407
EFFECTS OF X2RAY ON CITRUS CALL US AND PROTOPLASTS
Liu Jihong  Deng Xiuxin
( National Key L aboratory in Genetic I m provements of Crops ,
Huaz hong A gricult ural U niversity , W uhan , 430070)
Experiments were performed to investigate the effects of X2ray on callus and protoplasts of
Dancy tangerine ( Cit rus reticulata) . Irradiation for 1h or 115h , especially the latter , inhibited
the growth of callus. The protoplasts irradiated for 115h did not divide but plasmolysed during
the course of culture , whereas irradiation for 1h made minor inhibitory impacts on protoplasts.
Key words :Citrus , protoplast , callus , X2ray
023 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1998 ,12 (5) :317~320