全 文 ：此文于 1998 年 9 月 17 日收到。
小麦抗赤霉病突变体的选育
及 RAPD 分子验证
孙光祖　李忠杰　李希臣　王广金　唐凤兰
张月学　阎文义　孙德全　孙　岩
(黑龙江省农业科学院作物育种研究所　哈尔滨　150086)
利用辐射诱变、组织培养和细胞筛选相结合的方法选育出了抗赤霉病突变体
92k809。该突变体不仅抗赤霉病能力强 ,且抗性稳定 ,同时具有优良的农艺性状 ,比
原亲本增产 419 %。经 RAPD 技术检测 ,所用的 128 个引物中有 1 个引物 (OP Y15)在
抗病突变体 92k809 和赤霉病抗原苏麦 3 号中得到了相同的扩增产物。初步认为该
片段与赤霉病的抗性有关。
关键词 :小麦抗赤霉病突变体 　RAPD 技术 　辐射诱变 　细胞筛选 　组织培养
赤霉病是小麦的主要病害之一 ,在我国长江中下游和华北冬麦区以及东北春麦区危害日
益严重 ,它不仅使小麦大幅度减产 ,而且使小麦品质变坏、失去食用价值。抗赤霉病育种是当
今小麦育种的重要课题 ,缺乏理想的抗原材料是抗赤霉病育种难于获得突破性进展的关键所
在。许多研究表明 ,禾谷类作物的细胞和组织在离体培养过程中会产生许多体细胞无性系变
异 ,并可用于品种改良[1 ,2 ] 。离体诱变可以扩大体细胞无性系变异 ,为育种提供更多的变异来
源。在毒素压力下进行抗病性细胞筛选 ,可以培育出抗病品系[3 ,4 ] 。本文利用离体诱变、组织
培养和细胞筛选相结合的方法 ,进行了小麦抗赤霉病突变系的选育 ,并对选出的抗病突变系做
了 RAPD 技术的分子验证。
1 　材料与方法
111 　抗赤霉病突变体 92k809 的获得
用 15 Gy 的60Coγ射线照射新克旱 9 的风干种子 ,播于试验区内 ,常规管理。开花 15d 后
将 M1 植株幼胚接种在含赤霉病菌粗毒素的诱导培养基中进行暗培养 (室温 24 ±1 ℃) ;30d 后
将存活的愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养 ;25d 后将分化出的幼苗转入壮苗培养基
中继续培养。每天光照 16h ,光照强度 20klx。当再生苗高 10cm～15cm 时 ,炼苗 5～7d 后转入
小盆内 ,置于光照培养箱内培养 7d 左右 ,再移入大花盆中 ,精心管理 ,直至成熟。
翌年 ,将 S1 种子按穗行播在病圃内 ,开花时用赤霉病菌孢子悬浮液喷雾接种 (10 ×10 视
野不少于 30 个孢子) ,适当保湿。乳熟后期调查穗部发病情况 ,并进行初选 ,成熟后结合综合
202　 核 农 学 报　1999 ,13 (4) :202～205Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
图 1 　引物 OPY15的扩增产物
Fig. 1 　Amplified product of
the primer OPY15
A :亲本　B :92k809 　C :苏麦 3 号　M :DNA 分
子量标记 Ⅵ引物 OPY15的扩增物序列为 : 5′2
AGTCGCCCTT23′
A : Parent 　B :92k809 　C :Sumai No. 3
M :DNA molecular weight marker
(pBR3221Hinf I + pBR322·BstNI)
The sequence of the primer OPY15 is 5′2
AGTCGCCCTT23′
要求。
PAPD 扩增中共用随机引物 128 个 ,均购
买于北方同正公司 (按美国 Operon 公司的行物
序列合成) 。这 128 个引物分别是 OPA1～20 、
OPD1～20 、 OPE1～20 、 OPV1～20 、 OPX1～20 、
OP Y1～20 、OPF1～5 、OPC08 、OPC09 和 OPC12 ,其
中扩增物完全相同的引物有 122 个 , 占
9513 % ;扩增物存在差异的引物有 6 个 ,它们分
别是 OPE11 、OPE17 、OPE18 、OP Y15 、OP Y07 、
OP Y08 ,存在稳定差异的是 OP Y15 (图 1) 。在
OP Y15的扩增产物中 ,760bp 和 700bp 左右的两
条谱带是 92k 809 与苏麦 3 号共同具有的。实
验经 3 次重复 ,结果稳定。
3 　讨论
抗赤霉病突变体 92k809 是利用辐射诱变、
组织培养和细胞筛选相结合的方法选育而成
的。经多年抗病性鉴定 ,抗性是稳定遗传的。
可见 ,辐射与生物技术结合是选育抗病新品系
(种)的有效途径之一。抗病突变体 92k809 不
仅较亲本有很强的抗病能力 ,而且有较好的农
艺性状 ,因此 ,产量也较高。
RAPD 检测结果表明 ,在抗赤霉病突变体
92k809、亲本新克旱 9 和赤霉病抗原苏麦 3 号
上所用的 128 个引物中 ,有 122 个引物的扩增产物表现出高度一致性 ,说明做为普通小麦的这
3 份材料遗传基础相近 ,基因组 DNA 有高度的同源性 ,这些引物的结合位点与其相同 ,扩增产
物也就相同。扩增产物有差异的 6 个引物中 ,OP Y15重复性良好 ,它所扩增出的 2 个片段只有
在抗病突变体 92k809 和苏麦 3 号中被检测到。因此可以认为 ,这 2 个片段与赤霉病抗性有
关 ,使抗赤霉病突变体 92k809 的抗病性在 DNA 水平上初步得到了证实。
笔者曾在赤霉病菌毒素作用下对抗病突变体 92k809 防御酶系 (过氧化物同工酶、超氧化
歧化物)和细胞超微结构的变化以及在赤霉病菌作用下细胞糖蛋白层的变化进行了详细研究 ,
并从细胞和生化水平上探讨了其抗病机理 ,找到了一些蛋白质标志[4 ] 。RAPD 技术在小麦抗
性的分子验证上得到广泛应用 ,并取得了一些重要结果[5～7 ] 。本文在抗病突变体上得到的
RAPD 检测结果 ,可认为是在分子水平上使其抗病性得到了初步验证。对一个获得的抗病突
变体来说 ,应该从整体水平、细胞水平、生化水平和分子水平上进行深入研究 ,才能得到准确、
完整和系统的研究结果。
402 核　农　学　报 13 卷
参 考 文 献
1 　王敬三 ,等 1 体细胞无性系变异与突变体筛选 1 植物细胞工程与育种 ,北京 :北京工业大学出版社 ,19901209～213
2 　郭丽娟 1 离体筛选小麦抗赤霉病突变体的研究 1 植物体细胞无性系变异与育种 1 南京 :江苏科学出版社 ,19911112～
166.
3 　孙立华 ,等 1 抗水稻白叶枯病体细胞突变体筛选及其技术体系 1 植物体细胞无性系变异与育种 1 南京 :江苏科学出版
社 ,1991 ,237～240
4 　孙光祖 1 利用体细胞无性系变异选育小麦抗赤霉病新品系的研究 1 中国核科技报告 ,北京 :原子能出版社 , 1997 ,
CN &CO1201
5 　Schachermay G , et al. Identification and cocatization of molecular markers linked to Lr9 leaf resistance gene of wheat . Theor
Appl. Genet . 1994 ,88 :110～115
6 　Demeke T , et al. A DNA marker for the Bt210 common bunt resistance gene in wheat , Genome , 1966 ,39 :21～55
7 　Dweikat I , et al. Association of a DNA marker with Hessian fly resistance gene H9 in wheat . Theor Appl Genet , 1994 ,89 :964
～968
SEL ECTION OF WHEAT MUTANT WITH RESISTANCE TO
Fusa rium graminea rum AND RAPD TECHNIQUE
Sun Guangzu 　Li Zhongjie 　Wang Guangjin 　Tang Fenglan
Zhang Yuexue 　Yan Wenyi 　Sun Dequan 　Sun Yan
( Instit ute of Crops B reeding , Heilongjiang Academy of A gricult ural Sciences , Haerbin 　150086)
ABSTRACT
The wheat mutant 92k809 with resistance to Fusa rium graminea rum was selected by means
of induction mutation of irradiation , tissue culture and cell sreening. The mutant 92k809 has
stable resistance to the disease , good agronomical traits with increasing yield of 419 % when
compared with its parent. The specif ic D NA fragments , which both 92k809 and resistant mate2
rial Sumai No. 3 own , have been fond by RAPD technique. These fragments , which do not exist
in the parent , are related to scab of wheat.
Key words :Wheat mutants , resistance to Fusari um gram i nearum , RAPD , radiation in2
duced mutation , tissue culture , cell screening
502Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1999 ,13 (4) :202～205
农艺性状共选出了 15 个优良抗病单株。S3 代株行种植 ,开花时用赤霉病菌孢子悬浮液进行
定位单花接种 ,成熟前按 5 级标准调查发病情况 ,计算反应指数 ,结合农艺性状选出了 4 个优
良抗病单株。S4 代种成株系 ,经定位单花接种鉴定后 ,选出了抗赤霉病的优良突变体 92k809。
该突变体于 1995～1996 年参加了产量对比试验 ,并将种子送交黑龙江省农业科学院植保所纳
入全国小麦赤霉病鉴定圃 ,进行了抗病性鉴定。另外 ,1996～1997 年间还在黑龙江省赤霉病
易发区进行了异地抗病性鉴定。
112 　抗赤霉病突变体 92k809 的 RAPD 分析
11211 　供检测材料 　包括抗病突变体92 k809、新克旱 9 (原亲本) 和苏麦 3 号 (抗赤霉病抗
原) 。
11212 　模板 DNA 提取 　采取苯酚2氯仿2异戊醇2核糖核酸酶法 ,提取的 DNA 用 018 %琼脂糖
凝胶电泳检测其片数大小 ,用岛津 UV2160A 分光光度计检测其浓度和纯度。
11213 　RAPD 扩增 　92k809、新克旱 9 和苏麦 3 号同时扩增 ,反应体系为 :10 ×缓冲液 1μl ,
MgCl2 (25mM) 1μl , dN TPS ( dA TP、dTTP、dCTP、d GTP 各 215mmol/ L ) 1μl , TaqDNA 聚合酶
(4units/μl) 0125μl ,随机引物 1μl ,模板 DNA (25ng/μl) 1μl ,超纯水 4175μl。
11214 　RAPD 扩增程序 　反应仪为美国 PE 公司生产的 DNA Thermal Cyeler480 ,95 ℃变性
215min ,94 ℃1min ,35 ℃1min ,72 ℃2min ,进行 40 个循环 ,72 ℃保温 5min ,4 ℃保温。
11215 　电泳检测 　反应完成后向反应管中加入117μ的 l6 ×溴酚蓝 ,在 114 %的琼脂糖凝胶上
进行电泳 ,在紫外检测仪上观察 ,照相。
2 　试验结果
211 　抗病突变体 92k809 及其亲本的主要农艺性状及抗病性
将两年 (1995～1996 年) 产量和抗病性鉴定结果列于表 1。从调查结果看出 ,抗病突变体
92k809 植株高度比亲本高 315cm ,除千粒重外 ,穗长与小穗数也较亲本有不同程度的增加 ,平均
每 hm2 产量比亲本提高 419 % ,而且抗赤霉病能力较亲本有明显提高。在两年的异地抗病性鉴
定中抗病突变体 92k 809 都表现出较强的抗赤霉能力 ,并且活秆成熟 ,落黄好 ,秆有弹性 ,抗倒伏。
表 1 　抗病突变体 92k 809 及其亲本的主要农艺性状与抗病性
Table 1 　Disease resistance and agronomical t raits of mutant 92k809 and its parent
材料
Material
株高
Plant height
(cm)
穗长
Ear height
(cm)
主穗小穗数
Spikelet
number
千粒重
1000
Kernel weight
(g)
产量
Yield
(kg/ hm2)
±%
抗病性
Disease
resistance
92k809 10110 ±710 818 ±014 1710 ±114 3617 ±118 556815 419 R
新克旱 9
New kehan
No. 9
9715 ±614 813 ±014 1610 ±114 3715 ±211 531014 - MS
　　注 :R 表示抗病 ;MS 表示中度感染。
Note :R means resistant to disease ; Ms means medium susceptible.
212 　RAPD 的测定
提取植物样品 DNA 经紫外分光光度计检测 ,A260/ 280 ≥118 ,A260/ 230 ≥2 ,表明蛋白质
及其它杂质已除去。经琼脂糖凝胶电泳检测 ,DNA 片段整齐 ,接近 50kb ,符合 RAPD 的实验
302　4 期 小麦抗赤霉病突变体的选育及 RAPD 分子验证