全 文 ：此文于 1996 年 3 月 5 日收到。
国家自然基金资助项目。
离子注入法导入外源 DNA
引起陆地棉性状变异的研究
程备久 　田秋元 　李 　展 　周立人
(安徽农业大学生物工程系　合肥　230036)
通过 30keV 不同剂量的 Ar + 注入和 DNA 溶液浸滴法将比克氏棉和红麻 DNA
导入泗棉 2 号。结果表明 :离子注入可显著地促进外源 DNA 导入受体 ,增加受体后
代性状的变异频率和变异类型 ,而且多数变异可迅速趋于稳定。在供试剂量中 ,以 2
×1015Ar + / cm2 介导外源 DNA 引起受体性状变异的频率最高 ,达 16. 2 %。经选育
已获得了一批抗枯萎病、早熟、种子少腺体和优质等各具特色的陆地棉新种质系。
关键词 :离子注入 　外源 DNA 导入 　陆地棉 　变异
前 　　　言
　　外源 DNA 导入高等植物导致性状变异 ,是 80 年代新兴的一项生物技术。近几年来 ,国
内外学者利用这一技术创造新种质和改良作物品种获得突破性进展。1980 年 ,Hess〔13〕首先利
用萌发花粉吸收方法将种内或种间外源 DNA 导入矮牵牛中 ,获得了性状变异的子代。
Dewet〔14〕利用 Hess 创造的上述技术获得了抗玉米叶斑病的转化体。1986 年 Ohat〔15〕报道 ,应
用外源 DNA 与玉米花粉混合授粉 ,获得了当代胚乳基因高频率的转移。周光宇〔1〕、黄骏
麒〔2 ,3〕等在受体棉自花授粉 24h 后 ,将海岛棉、中棉和抗枯萎病棉的 DNA 注射到受体棉子房
中 ,在其后代获得了抗枯萎病等性状变异的棉株。万文举等〔7〕用 DNA 溶液浸胚法将外源
DNA 导入分生组织细胞 ,进而影响生殖细胞 ,使其后代发生变异获得变异种质。但用体细胞
和组织作为受体 ,细胞壁是限制外源 DNA 导入的重要因素。因此 ,寻找解决这一问题的合适
方法一直是生物技术工作者的研究课题。近年来 ,低能离子束被作为一种新的诱变源应用于
生物诱变育种 ,并且荷能离子注入的溅射作用对植物细胞壁有明显的刻蚀作用 ,其离子注入的
通道可形成许多微孔 ,从而增加细胞膜透性 ,促进处源 DNA 导入〔8〕。程备久〔10〕、杨剑波〔9〕等
用离子注入法成功地将 GUS 和 NPT Ⅱ基因导入水稻和棉花细胞。本文用离子注入法将野生
棉和红麻 DNA 导入棉花种胚 ,以研究离子注入法导入外源 DNA 和引起受体农艺性状变异的
效果。
材 料 与 方 法
　　试验材料 　受体为陆地棉 ( Gossypi um hi rsut um ) 泗棉 2 号。外源 DNA 供体有野生比克
氏棉 ( Gossypi um bickll P. ) 和红麻 ( Hibiscus cannabi nus) ,前者具有抗旱和种子无腺体特性 ,后
051 核 农 学 报　1996 ,10 (3) :150～154
Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
者对枯萎病、黄萎病免疫 ,抗虫性强。
D NA提取 　采用翁坚和陈永强等〔4 ,5〕的方法 ,从萌动的种子中提取 DNA ,用 UV2240 型
紫外分光光度计测定 DNA 纯度和浓度。将 DNA 用 0. 01 ×SSC 缓冲液稀释至终浓度 200μg/
ml ,置 4 ℃冰箱中备用。
处理方法 　选取受体品种泗棉 2 号 1 个单株的饱满种子 ,进行无菌消毒 ,烘干 ,在无菌条
件下剥去种壳和子叶 ,随机分成两份 ,一份不经离子束处理 ,另一份用能量为 30keV 的 Ar + 处
理胚芽 ,剂量分别为 1 ×1015Ar + / cm2 、2 ×1015Ar + / cm2 和 3 ×1015Ar + / cm2 。将 DNA 液过滤
灭菌 ,将未注入离子和注入离子去子叶的胚分别作 4 种处理 :
11 受体 + 重蒸水 　　　　　　21 受体 + 0. 01 ×SSC
31 受体 + 比克氏棉 DNA 41 受体 + 红麻 DNA
将受体在上述不同处理液中浸泡 10 小时 ,再放入无菌 MS 培养基上培养 ,然后每隔 3 天滴加 1
次 DNA 液于生长点上 ,共滴加 4 次。待 3 叶期后炼苗移栽大田。花粉用 30keV 的 2 ×1015
Ar + / cm2 处理后 ,立即用比克氏棉 DNA 混合授粉。
田间种植和性状测定 　种植处理的 D1 代 ,分单株收获 ,D2 代按株行种植 ,每 10 个株行设
一对照行 ,用标准方法调查各农艺性状 ,按〔11〕方法统计检测变异体 ,种子腺体数统计是用完
整的棉子仁 ,用解剖刀在其最大面积处纵切为二 ,在 15 倍双目解剖镜下 ,计算整个剖面的腺体
数目 ,以两个剖面的平均数作为该种子的腺体数目 ,以 5 粒种子平均数作为单株种子腺体数。
抗枯萎病鉴定 :采用兔血凝集测定〔12〕,根据凝集程度 ,以间接确定其抗病性强弱。
纤维品质测定 :采用分梳法测定纤维长度 ,细度和强度分别用 Y2145 型气流式细度仪和
Y2162 束强仪测定。D2 代每剂量随机取 30 株。
结 果 与 分 析
(一)离子注入诱发农艺性状的变异
受体经不同剂量的 Ar +注入后 ,对 D1 代成苗率有一定影响 ,在 3 ×1015Ar + / cm2 剂量下 ,
其成苗率仅为对照的 70 %。D2 代的农艺性状发生变异。从表 1 可见 ,离子注入后主要可诱发
生育期、铃形和株型性状变异 ,其变异率随剂量增加而增加 ,而受体经离子注入后再经 0. 01 ×
SSC 溶液浸泡 ,其 D2 代农艺性状的变异频率降低 ,这表明 ,0. 01 ×SSC 可削弱离子束的诱变效
果。
(二)离子注入对外源 D NA导入效果的影响
离子注入后再经外源 DNA 溶液浸滴 ,D1 代无明显的性状变异 ,D2 代显著地提高了受体
农艺性状的变异率 (表 1) 。用比克氏棉 DNA 为供体 ,未经离子束处理的受体 ,直接用 DNA 溶
液浸泡 ,可使 DNA 被导入而引起受体性状变异 ,但 D2 代变异率低 ,仅为 2. 7 %。而用离子束
处理后再用比克氏棉 DNA 浸滴 ,其受体 D2 代性状变异率较未处理的提高 8 %～11. 8 % ,而比
仅用离子束处理的提高 6. 7 %～9. 5 %。以红麻 DNA 为供体 ,则离子束处理的受体比未经处
理的受体 D2 代性状变异频率提高 8. 1 %～12. 4 %。由此可见 ,受体经离子注入后可显著促进
外源 DNA 的导入 ,引起受体较高频率的农艺性状变异。从变异谱可以看出 ,离子束介导外源
DNA 导入可引起受体农艺性状较广泛的变异 ,且在同一个体出现两种以上性状的变异频率较
高。尤其在变异类型中可观察到供体的某些特有的性状 ,如比克氏棉的叶形、铃形、种子腺体
1513 期 离子注入法导入外源 DNA 引起陆地棉性状变异的研究 　
数显著减少以及红麻的抗枯萎病性状等 ,这些都表明供体 DNA 进入受体细胞并使某些性状
得以表现。同时 ,用离子注入花粉再用外源 DNA 混合授粉 ,D2 代性状的变异频率高于胚芽 ,
这表明用花粉作为受体转化外源 DNA 可能较体细胞有利。
表 1 　离子注入法导入外源 DNA的泗棉 2 号 D2 代农艺性状的变异
　Table 1 　Variation on agronomic traits in D2 generation of cotton Si 2 introduced by exogenous
DNA with ion implantation
处　理
Treatment
剂　量
Dose
( ×1015Ar + / cm2)
总株数
Total
plants
变异株数
Variant
plants
生育期
Matura
- tion
period
抗性
Disease
resistan
- ce
铃形
Boll
shape
腺体数
Gland
number
株型
Plant
shape
纤维品质
Fiber
quality
总变异率
Rate of
total
variation ( %)
泗棉 2 号 + 0 65 0 0 0 0 0 0 0 0
重蒸水 1 83 3 2 1 2 3. 6
Si 2 + ddH2O 2 71 3 2 2 1 1 4. 2
3 86 4 1 2 1 2 4. 7
泗棉 2 号 + 0 71 0 0 0 0 0 0 0 0
0. 01 ×SSC 1 95 3 1 1 2 3. 2
Si 2 + 0. 01 ×SSC 2 101 4 2 2 2 1 4. 0
3 93 4 1 1 2 1 4. 3
泗棉 2 号 + 0 75 2 1 2 1 2. 7
比克氏棉 DNA 1 84 9 2 1 2 2 3 1 10. 7
Si 2 + G. bickll 2 96 13 4 1 4 3 4 2 13. 5
P. DNA 3 103 11 3 2 3 2 3 1 10. 7
泗棉 2 号 + 0 80 3 1 1 1 3. 8
红麻 DNA 1 96 13 2 3 3 1 1 1 14. 0
Si 2 + H. 2 111 18 3 4 3 1 1 3 16. 2
canabinus DNA 3 109 13 2 4 3 1 1 2 11. 9
泗棉 2 号花粉 + 0 60 3 2 2 1 5. 0
比克氏棉 DNA
Si 2 (pollen) +
G. bickll DNA 2 113 22 6 1 7 5 5 1 19. 5
　　另外 ,从表 1 可以看出 :不同剂量对外源 DNA 导入的效果不同 ,在供试的 3 种剂量中 ,以
2 ×1015Ar + / cm2 有利于外源 DNA 导入而引起受体较高频率的性状变异。
(三)不同种属 D NA导入对陆地棉性状变异的影响
不同种属间的远缘有性杂交是十分困难的 ,从而限制了遗传物质的交流。本文用离子束
介导比克氏棉和红麻 DNA 进入泗棉 2 号受体细胞 ,引起了较高频率的性状变异 ,比克氏棉
DNA 导入 ,除引起熟期、株型和铃型变异外 ,可引起抗枯萎病和种子腺体数目的变异 ,尤其是
使种子腺体数目降低的变异频率高。而红麻 DNA 导入泗棉 2 号 ,其抗枯萎病变异的频率高。
不同属的红麻比同属不同种的比克氏棉的 DNA 导入可引起泗棉 2 号较高的变异频率。在
DNA 导入的后代中 ,其供体某些特有性状往往能得到表达 ,这表明 ,在外源 DNA 导入中 ,根据
受体需要改良的性状来选择供体是必要的。
(四)外源 D NA导入引起性状变异的遗传
从表 2 可以看出 ,离子注入介导外源 DNA 引起受体性状变异绝大多数是可遗传的 ,而且
稳定速度较快。到 D4 代已有 75 %以上的株系趋于稳定 ,这与远缘杂种后代出现疯狂分离和
“杂种破落”不同 ,由此可见 ,外源 DNA 导入 ,尤其远缘种、属和科间的 DNA 直接导入是克服
远缘有性杂交和体细胞融合困难的一种简便易行的方法 ,也是创造新种质的一种有效途径。
251 　核　农　学　报 10 卷
表 2 　离子注入法导入外源 DNA引起农艺性状变异的遗传
　Table 2 　Inheritance of variation of agronomic traits induced by introduced exogenous DNA
with ion implantation
农艺性状
Agronomic traits
变异稳定性
Variation stability
D2 D3 SR 3 ( %) D4 SR( %)
生 育 期
Maturation
period
变异株 (行)数
Variation plants(rows) 33 28 15
稳定
Stable 10 36 12 80
分离
Unstable 18 3
枯萎病抗性
Resistance
to wilt
disease
变异株 (行)数
Variation plants(rows) 18 14 12
稳定
Stable 8 57 9 75
分离
Unstable 6 3
种子腺体
Seed gland
变异株 (行)数
Variation plants(rows) 15 12 10
稳定
Stable 7 58 9 90
分离
Unstable 5 1
纤维品质
Fiber
quality
变异株 (行)数
Variation plants(rows) 13 12 10
稳定
Stable 6 50 8 80
分离
Unstable 6 23 SR 为稳定株系占总变异株系的比率3 SR is rate of stable lines with total variant lines
讨 　　　论
　　11 外源 DNA 直接导入体细胞时 ,细胞壁是限制导入率的主要因素。因此 ,许多生物技术
工作者创造了基因枪法或利用原生质体为受体来摄取外源 DNA。低能离子束的溅射作用 ,可
用来刻蚀细胞壁〔8〕,且荷能离子注入还可改变细胞膜电性及形成离子微孔通道 ,从而改变细
胞膜透性 ,有利于细胞摄取和转化外源 DNA。就受体性状变异而言 ,离子注入首先对受体细
胞有诱变作用 ,而导入的外源 DNA 也具有生物诱变作用。离子注入可引起受体基因组 DNA
断裂 ,提高外源 DNA 进入受体的整合率 ,在外源总 DNA 中 ,包括 10 %左右顺序的结构基因 ,
80 %～90 %顺序的调控序列和重复序列〔1〕。在受体细胞内 ,外源 DNA 片段可能通过同源重
组、异源插入及遗传物质重排等不同途径整合到受体 DNA 中 ,从而引起某些性状变异。由此
可见 ,离子束介导外源 DNA 不同于一般的导入法 ,它除有增加导入率外 ,还兼有诱变和提高
转化率的多重作用。因此 ,离子注入作为一种外源 DNA 导入技术是可行的。
21 不同的离子注入剂量对外源 DNA 导入引起受体性状变异的效果不同。本试验 2 ×
1015Ar + / cm2 的处理 ,其外源 DNA 导入率和诱变率最高 ,过高的离子注入剂量对细胞的损伤
3513 期 离子注入法导入外源 DNA 引起陆地棉性状变异的研究 　
太大 ,细胞和转化子生活力反而下降。这表明 ,离子束介导外源 DNA 有其适宜的离子注入剂
量。不同种属的外源 DNA 导入陆地棉 ,其子代有较类似的变异类型和变异率 ,且往往可以获
得供体某些特有的性状 ,这说明 ,外源 DNA 导入可不必考虑在植物分类学上的限制 ,但应根
据受体改良的性状来选择互补的供体。
31 同一品种的不同材料作为受体 ,对 DNA 导入和引起性状变异的程度是不同的 ,用花粉
作为受体 ,其后代变异的频率高 ,这可能与花粉吸收外源 DNA ,通过受精直接参与有性过程有
关。对棉花种子来说 ,由于胚芽被深埋于子叶中间 ,加上离子束射程有限 ,因此必须去除子叶 ,
而禾本科 (如小麦、水稻)作物 ,则不必这样做 ,因而离子束介导法在禾本科作物上将有可能成
为一种新的提高外源 DNA 导入率和转化率的简单有效方法。
参 　考 　文 　献
1 　周光宇 1 授粉后外源 DNA 导入植物技术 1 中国农业科学 ,1988 ,21 (3) :1～4
2 　黄骏麒等 1 外源海岛棉 DNA 导致陆地棉性状的变异 1 遗传学报 ,1981 ,8 (1) :56～62
3 　黄骏麒等 1 外源抗枯萎病 DNA 导入感病棉的抗性转移 1 遗传学报 ,1986 , (3) :22～26
4 　陈永强 1 植物组织 DNA 提取的一种快速方法 1 遗传 ,1979 , (1) :39～40
5 　翁　坚等 1 海岛棉 DNA 的提纯 1 植物生理学报 ,1979 ,5 (4) :363～368
6 　龚蓁蓁等 1 授粉后外源 DNA 导入植物技术———DNA 通过花粉管通道进入胚囊 1 中国科学 (B) ,1988 ,6 :611～614
7 　万文举等 1 玉米 DNA 导入水稻获得种质变异 1 湖南农业科学 ,1992 ,3 :6～7
8 　余增亮等 1 低能离子束对植物细胞表面的刻蚀作用 1 安徽农业大学学报 ,1994 ,21 (3) :341～345
9 　杨剑波等 1 应用低能离子束介导法获得水稻转基因株 1 科学通报 ,1994 ,39 (6) :1530～1534
10 　程备久等 1 离子注入法导入棉花外源基因的研究 1 安徽农业大学学报 ,1993 ,20 (遗传学专辑) :19～22
11 　周松茂 1 诱变育种中突变频率的计算 1 原子能农业应用 ,1984 ,4 :57～59
12 　刘士庄等 1 棉花枯萎病抗性快速预测法 1 中国棉花 ,1984 ,6 :16～18
13 　Hess D. Investigations on the intra and interspecific transfer of anthocyanin genes using pollen as vecters. Z Pflaanzenphysiol ,
Bd 98s ,1980 ,323～327
14 　Dewet J M. The Experimental Manipulation of Ovules Tissue. GR Chapman et al. Published by Longman Inc N Y , 1983 ,97
15 　Ohta Y. High - efficiency genetic transformation of maize by a mixture of pollen and exogenous DNA. Proc Natl Acad Sci ,
1986 ,83 :715～719
STUDY ON CHARACTER VARIATION IND UCED BY INTROD UCING
EXOGENOUS D NA INTO UPLAND COTTON WITH ION IMPLANTATION
Cheng Beijiu 　Tian Qiuyuan 　Li Zhan 　Zhou Liren
( A nhui A gricult ural U niversity , Hef ei 230036)
ABSTRACT
　　The exogenous D NAs of G. bickll P. and H. Cannabinus were introduced into the upland
cotton Si 2 by Ar + implantation and D NA solution trickl ing method. The results showed that the
exogenous D NA introduction was promoted signif icantly and the types and frequencies of charac2
ter variation in progeny were increased by Ar + implantation. Furthermore , most of the varia2
tion tend to be stable. Among the Ar + implantation doses tested , 2 ×1015 Ar + / cm2 was the best
for introducing exogenous D NA and inducing character variation , the variation rate reached to
1612 %. Some new lines with character of resistance to wilt disease ,early maturity , few gland in
seed and f ine f iber qual ity have been obtained.
Key words :Ion implantation , exogenous DNA introduction , upland cotton , variation
451 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1996 ,10 (3) :150～154