全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032418205
秋水仙碱诱导栝楼四倍体
吴玉香1 　杨福红2 　赵晓明1 　何永波2 　李鹏飞2
(11 山西农业大学农学院 ,山西 太谷　030801 ;21 山西农业大学研究生院 ,山西 太谷　030801)
摘 　要 :采用改良L. D. Cua 法诱导短把栝楼获得四倍体 ,研究了 012 %浓度的秋水仙碱诱导短把栝楼染
色体倍性变异的最佳处理时间、四倍体栝楼与原栝楼的形态特征及其四倍体与二倍体的细胞学鉴定。
结果表明 :012 %秋水仙素的最佳处理时间为 72 h ,诱变率达 8211 %。与二倍体相比 ,四倍体表现为 :生
长变缓 ;叶片增大、皱缩和变厚、叶形指数减小 ;叶片保卫细胞增大 ,气孔密度降低 ,叶绿体数目增加 ,叶
色加深。根尖压片表明 :二倍体的染色体数目为 2 n = 66 ,大部分四倍体植株的染色体数目为 2 n = 132 ,
M2 代部分四倍体植株也存在嵌合现象。
关键词 :栝楼 ;四倍体 ;改良L. D. Cua 法
INDUCEMENT OF TETRAPLOID OF Trichosanthes kirilowii Maxim BY COLCHICINE
WU Yu2xiang1 　YANG Fu2hong2 　ZHAO Xiao2ming1 　HE Yong2bo2 　LI Peng2fei2
(11 College of Agronomy , Shanxi Agricultural University , Taigu , Shanxi 　030801 ;
21 College of Graduate , Shanxi Agricultural University , Taigu , Shanxi 　030801)
Abstract :The improved L. D. Cua method was used to induce tetraploid of Trichosanthes kirilowii Maxim. The suitable treating
time of 012 % colchicine , the morphology characters and cytology identification between plants of diploid and obtained
tetraploid were studied. The results showed that 72h treating time could obtain variant rate of 8211 %. Comparing with
diploid , the growing rate of tetraploid plants was slow and the leaves became bigger , thicker , dark green and crimpled. The
stomata density of tetraploid plants was reduced , but the guard cell of stomata became bigger and the chloroplast number in
guard cells was increased. By chromosome observation of root tip cells , the chromosome number of diploid was 2 n = 2 x = 66 ,
and the chromosome number of most tetraploid plants was 2 n = 4 x = 132. It was also found that some of tetraploid plants in
M2 were chimera.
Key words : Trichosanthes kirilowii Maxim ; tetraploid ; improved L. D. Cua method
收稿日期 :2008210223 　接受日期 :2009202201
基金项目 :山西农业大学科技创新基金 (200144) ,山西省高校高科技开发项目 (20081010)
作者简介 :吴玉香 (19672) ,女 ,山西神池人 ,副教授 ,博士 ,从事作物遗传育种研究。Tel :035426289102 ; E2mail :wuyuxiang89 @sina. com
通讯作者 :赵晓明 (19452) ,男 ,山西忻州人 ,教授 ,博导 ,研究方向为作物遗传育种药用植物染色体工程。E2mail :songyun0283 @1261com.　　栝楼又称瓜蒌、天瓜、苦瓜和药瓜 ,是葫芦科栝楼属一种多年生缠绕性藤本植物。全世界栝楼属植物有80 余种 ,我国就有 40 多种[1 ] ,是栝楼属的主要分布区域。目前 ,关于栝楼研究育种方面的研究报道较少 ,这可能与栝楼既可以有性繁殖又可以无性繁殖有关 ,也在于其雌雄异株。据调研 ,安徽省潜山县天柱山野葫芦开发有限公司通过60 Coγ辐照栝楼块根 ,筛选出 1 个突变品系 ,该品系第 2 年产量达 2250kgΠhm2 ,品系果实多为圆形 ,果皮常有花纹 ,容易鉴别。通过实地考察发现 ,辐照筛选的品系并没有达到完全的抗病虫效果 ,单个果实还不大 ,因此需要深入诱变筛选[2 ] 。传统的育种方法如系选、杂交和回交等由于周期长、效率低制约了新品种的选育。近年来 ,在生产中应用的栝楼产量低、抗病性差 ,
814　 核 农 学 报　2009 ,23 (3) :418～422Journal of Nuclear Agricultural Sciences
难以满足目前市场的需求。而多倍体植物具有营养器
官的巨大性 ,表现为能大幅提高营养器官的产量。如
同源四倍体丹参普遍比二倍体丹参生长势旺 ,茎杆粗
壮、植株高 ,根部药材比原植物粗大[3 ] ;崧蓝四倍体较
原植物叶子宽大而厚实、茎杆粗壮、花和果实也略显增
大[4 ] 。另外多倍体的抗性和相关的化学成分含量也高
于二倍体。吕世民[5 ] 等人研究表明 :人工诱导的怀牛
膝同源四倍体中蜕皮激素较原植物高出 10 倍多。乔
传卓[6 ]等人研究表明崧蓝四倍体中靛兰和靛玉红及根
中游离氨基酸含量均有显著提高。
本试验采用改良琼脂涂抹法 (即改良 L. D. Cua
法)处理栝楼幼芽顶端 ,以期获得多倍体栝楼 ,为药用
植物多倍体育种提供方法和理论依据 ,也为进一步培
育栝楼新品系提供原始材料。
1 　材料与方法
111 　材料
供试材料品种为短把栝楼 ( Trichosanthes kirilowii
Maxim) ,来源于山西天然药用生物研究所。
112 　方法
11211 　种子育苗 　将栝楼种子 60 ℃温汤浸种 24h 后
播种于营养钵中 ,覆土 6～8mm。
11212 　诱导处理 　配制 012 %秋水仙碱 + 1 %琼脂凝
胶涂于栝楼幼苗顶芽 ,使其充分包裹顶芽和子叶柄基
部 ,处理后用罩杯罩住。设 24、48 和 72h 三种处理 ,以
1 %琼脂凝胶直接涂于幼苗的处理为对照。诱导 35d
后将诱导植株和对照植株移栽于大田。
11213 　诱变后处理 　在幼苗恢复生长 1～2 周后 ,营
养液 (尿素 013g ,磷酸二氢钾 015g 溶于 1L 蒸馏水中)
和清水分别各喷 1d ,轮番进行 2 周 ,以促进幼苗生长。
113 　植株形态学调查与测定
11311 　株高的比较 　诱变 5d 后开始测量幼苗株高 ,
每隔 5d 测量 1 次 ,30d 共测量 6 次。每处理测量 11
株 ,将变异株和对照株进行比较并统计分析。
11312 　叶形调查 　诱导 60d 后 ,随机选择 10 株诱导
成功植株和 10 株对照株 ,选取每株主茎的第 11 片叶 ,
用卷尺测量叶片的叶长和叶宽 ;游标卡尺测量叶片厚
度 ,观察叶片颜色变化和皱缩情况 ,并统计分析。
11313 　气孔比较 　诱导 60d 后 ,待植株长势旺盛时 ,
取变异株和对照株相同节位叶片 (主茎第 11 片叶) ,变
异株和对照株各选 10 株 ,用尖嘴镊子轻轻撕下叶片下
表皮 ,在显微镜下 (10 ×40) 用显微测微尺测量气孔的
长、宽 ,统计叶绿体数目 ,随机选择 10 个视野 ,统计在
视野中的气孔数目 ,并照相和统计分析。
11314 　根尖有丝分裂的观察与比较 　栝楼根尖压片
参照细胞学基础[7 ] 和普通遗传学实验指导[8 ] ,第 2 年
秋季 ,收获第 1 年诱导成功M1 代变异株栝楼所结种子
(即 M2 )和二年生对照株的种子。分别选 20 株变异株
(M2 )和对照株的种子 ,温汤浸种 24h 后 ,在人工气候培
养箱中 26 ℃恒温下催芽 ,当胚根长到 015～1cm 时 ,用
对二氯苯饱和溶液预处理 3～4h ,然后转入卡诺固定
液固定 24h。将固定的材料转入 1molΠL 盐酸 ,60 ℃下
解离 315min ,取出用 70 %酒精冲洗 3 次后 ,用卡宝品
红染色 8～10h ,然后压片 ,选择染色体分散良好的片
子照相。变异株和对照株各统计 50 个细胞以上 ,对细
胞中的染色体数目计数分析。
2 　结果与分析
211 　处理时间对栝楼幼苗的诱导效果
在 M1 代苗期 ,生长受阻且形态学表现为叶色浓
绿、植株畸形或叶片皱缩判定为四倍体栝楼。依据此
标准 M1 代幼苗诱导效果如表 1 所示。
表 1 　处理时间对栝楼幼苗的诱导效果
Tabal 1 　Inducing effects of different treating time of
colchicines on Trichosanthes kirilowii Maxim
处理时间
treated
time (h)
处理株数
No. of
treated plant
死亡株数
No. of
death
成功株数
No. of
survial
诱导率
mutation
rate ( %)
CK 30 0 0 010 A
24 33 0 11 3313 B
48 21 1 14 6617 C
72 28 3 23 8211 D
注 :大写字母表示 0101 水平下差异极显著。所有表均同。
Note :Capital letters stand for significance at 0101 level . The same as in following
tables.
从表 1 可以看出 :在 012 %浓度秋水仙碱下不同处
理时间对栝楼的诱导率影响很大 ,时间越长 ,诱导的效
果越明显 ,获得四倍体的成功率越高 ,但死亡的植株数
也随之增加。诱导 24 和 48h 的诱导率分别为 3313 %
和 6617 %。获得四倍体栝楼的最佳诱导时间为 72h ,
其诱导率达 8211 %。统计分析表明 :不同处理时间下
的诱导率有极显著差异 (0101 水平下) 。
212 　四倍体和二倍体植株在幼苗期株高的比较
由于秋水仙碱对幼苗的生长有抑制作用 ,所以不
同秋水仙碱处理时间所获得的栝楼四倍体生长受到不
同程度的抑制。四倍体和二倍体栝楼幼苗株高变化如
914　3 期 秋水仙碱诱导栝楼四倍体
　　　 表 2 　幼苗生长期不同诱导天数的四倍体和二倍体株高的比较
Tabal 2 　Height comparison of Trichosanthes kirilowii Maxim seedling between diploid and tetraploid plants (cm)
项目
item
诱导后天数 days after inducing(d)
5 10 15 20 25 30
二倍体 diploid (cm) CK 917 ±317aA 1816 ±516aA 2611 ±813aA 3115 ±819aA 3416 ±916aA 3711 ± 916aA
四倍体 tetraploid (cm) 24h 619 ±215bB 1119 ±413bB 1514 ±518 bB 1714 ±618 bB 2113 ±814bB 2215 ±1012b B
48h 516 ±214cC 911 ±316 cC 1310 ±512 cBC 1618 ±712 bcBC 1916 ±515cC 2110 ± 918 bcBC
72h 510 ±211cC 812 ±411 dC 1019 ±517 d C 1518 ±716 c C 1719 ±714dD 1911 ± 712 c C
表 2 所示。
从表 2 可以看出 ,012 %浓度秋水仙碱不同处理时
间对获得四倍体栝楼幼苗期生长具有明显的抑制作
用 ,处理的时间越长 ,幼苗长势越缓慢。各处理的株高
表现为 :二倍体株高 > 处理 24h 诱导的四倍体 > 处理
48h 诱导的四倍体 > 处理 72h 诱导的四倍体。分析表
明 :四倍体栝楼与二倍体栝楼 (图 1) 株高的变化具有
极显著差异。
图 1 　四倍体 (左)和二倍体 (右)植株幼苗
Fig. 1 　Seedling of tetraploid (left)
and diploid (right) plant
213 　四倍体与二倍体植株叶片的比较
诱导 60d 后 ,比较变异株和对照株叶片的变化 ,结
果如表 3 所示。
图 2 　四倍体 (A) 、二倍体 (B)雄株叶片
和四倍体 (C) 、二倍体 (D)雌株叶片 (主茎第 11 片叶)
Fig. 2 　Leaf comparison of tetraploid (A) and diploid
(B) in male plant , tetraploid (C) and diploid (D)
in female plant (the eleventh leaf of stem)
表 3 表明 ,与二倍体相比 ,四倍体栝楼的叶片变
大 ,长和宽分别增加了 40145 %和 42147 % ;叶形指数
变小 ,减小了 1142 %(图 3) ;二倍体叶厚为 01031cm ,四
倍体为 01043cm ,较二倍体增加了 38171 % ;9514 %的二
倍体叶色为浅绿色 ,8213 %的四倍体叶色为深绿色。
分析表明 :四倍体与二倍体叶片的叶形指数存在显著
差异 (0105 水平下) ,叶长、叶宽和叶厚存在极显著差
异 (0101 水平下) 。
表 3 　诱导 60d 后四倍体与二倍体植株叶片的比较
Tabal 3 　Leaf comparison of Trichosanthes kirilowii Maxim between diploid and tetraploid plants after 60d inducement
项目
item
叶长
leaf length (cm)
叶宽
leaf width (cm)
叶形指数
leaf index
叶厚
leaf
thickness(cm)
叶色
leaf color
二倍体 diploid 12118 ±0199 A 13131 ±2134 A 01915 ±01006 aA 01031 ±01004 A 9514 %的浅绿 9514 %light green
四倍体 tetraploid 17110 ±1123 B 18196 ±2112 B 01902 ±01003 b A 01043 ±01007 B 8213 %的深绿 8213 %darkgreen
变化幅度 change rate 40145 % 42147 % - 1142 % 38171 % Π
214 　四倍体与二倍体植株叶片保卫细胞大小及叶绿
体数目的比较
经秋水仙素诱变后 ,叶片气孔的变化是植物多倍
化的一个很重要的细胞学现象。变异株气孔器的变化
主要表现为气孔增大、气孔频度减少和保卫细胞中叶
绿体的数目增加。四倍体及其二倍体的叶片下表皮的
气孔器的大小、保卫细胞中叶绿体数目及气孔频度的
观察结果如表 4 所示。
表 4 表明 ,相比二倍体栝楼 ,四倍体栝楼的气孔增
大 ,长和宽分别增加 25109 %和 24147 %。保卫细胞中
叶绿体数目由 13178 个增加到 23148 个 ,气孔频度减
小了 23113 %。分析表明 ,四倍体与二倍体 (图 4) 保卫
细胞的长、宽 ,保卫细胞中所含的叶绿体数目和气孔频
度在 0101 水平下存在极显著差异。
024 核　农　学　报 23 卷
图 3 　二倍体 (左)和四倍体 (右)保卫细胞 (400 ×)
Fig. 3 　Guard cell of diploid (left)
and tetraploid (right) plant
图 4 　二倍体 (2n = 66 ,左)和四倍体 (2n = 132 ,
右)染色体 (1000 ×)
Fig. 4 　Chromosome number of diploid (left)
and tetraploid (right) plant 2n = 132 (1000 ×)
表 4 　四倍体与二倍体植株叶片保卫细胞大小及叶绿体数目的比较
Tabal 2 　Guard cell and chloroplast comparison of Trichosanthes kirilowii Maxim between diploid and tetraploid plants
项目
item
保卫细胞长
length of guard cell (μm)
保卫细胞宽
width of guard cell (μm)
叶绿体数目 (个)
No. of chloroplasts
气孔频度 (104 个Πcm2)
stomata density
二倍体 diploid 11140 ±1103 A 7160 ±1117 A 13178 ±2134 A 21244 ±01098 A
四倍体 tetraploid 14126 ±0198 B 9146 ±1102 B 23148 ±3152 B 11725 ±01106 B
变化幅度 change rate 25109 % 24147 % 70139 % - 23113 %
215 　变异株和对照植株的染色体鉴定
通过对四倍体和二倍体栝楼的种子根尖染色体压
片 ,分别观察 50 个可准确计数染色体的根尖有丝分裂
中期细胞。结果表明 (图 2) ,二倍体的染色体数均为
2 n = 66 ,通过对 20 株变异株的根尖观察 ,有 14 株变异
株的染色体数为 2 n = 132 ,在部分变异株的根尖压片
中 ,同一根尖中既有四倍体细胞 ,也有少量二倍体细
胞 ,出现嵌合现象。
3 　讨论
311 　利用改良 L. D. Cua 法诱变栝楼幼苗成功的原因
栝楼是多年生雌雄异株的缠绕性藤本植物 ,当年
诱变的植株不结果实 ,利用常规的诱变方法很难使诱
导得到的多倍体保存下来。因此 ,本研究在诱导多倍
体栝楼的过程中采用改良 L. D. Cua 法 ,此方法是用含
012 %的秋水仙素的琼脂凝胶涂抹幼苗上胚轴生长点
和中胚轴 ,具有操作过程简便、处理时期较为集中、秋
水仙素浓度和处理时间可精确控制、药剂用量少等优
点。这是因为种子上胚轴发育成地上部分 ,中胚轴为
根茎转换区 ,下胚轴发育成根[9 ] ,由于栝楼第一年不结
实 ,诱变处理上胚轴所长成的地上部分在冬季死亡 ,第
二年长出的植株还是二倍体。这样虽然第一年处理成
功 ,第二年还是失败的。因此 ,要解决这一困难 ,必须
使中胚轴变成多倍体。而且应用该方法可获得大量的
栝楼多倍体植株 ,可为栝楼多倍体育种打下基础。
312 　多倍体植株的形态学判定
多倍体的判定依据主要是染色体数目的加倍和减
数分裂联会配对四价体的出现 ,但这两个条件在诱变
当代 (M1 ) 无法满足。故采用形态学特征作为多倍体
的判定条件 : (1) 生长受阻 :由于秋水仙碱是一种重要
的细胞毒物 ,会严重阻碍正常的生理代谢。细胞为了
消除这种毒害 ,不得不消耗大量的能量[10 ] 。因此 ,无
论该细胞是否会加倍成多倍体 ,只要吸收了秋水仙碱
就会发生生长受阻现象。但是多倍体细胞由于核染色
体加倍 ,90 %以上的 DNA 加倍 ,这种 DNA 的合成和染
色体的增加是非常消耗能量的过程 ,因此多倍体的分
裂速率显著缓慢于二倍体细胞 ,且毒害时间越长 ,生长
越缓慢。(2) 叶色浓绿 :因为叶绿体具有独立的 DNA
遗传系统 ,但它又受到核基因的控制。核染色体加倍
后所产生的基因剂量效应 ,使得叶绿体的数目增加 ,从
而造成多倍体的叶色较二倍体浓绿[11 ] 。(3) 叶片皱
缩 :是多倍体细胞和二倍体细胞的嵌合所造成[12 ,13 ] 。
由于中期细胞在总细胞分裂数目中占有极少数 ,而秋
水仙碱只对中期细胞起作用[11 ] 。在一个或长或短的
诱变时间内 ,只有部分中期细胞会转化成多倍体 ,其他
细胞还是二倍体。因此造成二倍体细胞和多倍体细胞
的嵌合。又由于多倍体与二倍体细胞生长速率不同、
细胞体积不同[14 ] 。故在生长中两种细胞的后代细胞
体积不一样 ,这就造成了叶片皱缩。(4) 植株畸形 :在
124　3 期 秋水仙碱诱导栝楼四倍体
化学诱变中 ,由于秋水仙碱破坏了纺锤体的形成 ,造成
了纺锤体的动物极和植物极紊乱 ,在它的后代中会出
现单极、三极和四极现象 ,所以会发生畸形现象。由于
多倍体物种中生长素、细胞分裂素、赤霉素绝对的量和
比值发生变化而畸形得到加强[15 ] 。因此在形态学上
经常看到多倍体植株当代发生叶片的扭曲、残缺等现
象。如艾建国等[3 ]在丹参同源四倍体研究中报道的叶
片皱缩、叶色加深、生育期延迟等现象。乔川卓[4 ] 在崧
蓝的多倍体育种研究中也发现多倍体植株畸形、叶片
皱缩、叶形指数减小及节间长度变短的现象。
313 　M2 种子中的嵌合现象
在部分栝楼变异株所结的种子的根尖压片中 ,同
一根尖中既有四倍体细胞 ,也有少量二倍体细胞 ,出现
嵌合现象。嵌合体是指含有 2 种或 2 种以上遗传型的
组织或个体[16 ] 。在多倍体诱变的 M2 代中 ,每个多倍
体植株都是 1 个精子和 1 个卵子产生的合子的有丝分
裂直系后代的细胞群。其染色体数目应是一致的 ,不
会出现不同染色体数细胞的嵌合。但在部分栝楼 M2
代根尖制片中发现同一根尖中既有四倍体细胞 ,也有
二倍体细胞的嵌合现象。究其原因是新诱成多倍体品
系的 M1 代 ,由于其加倍时纺锤体的合成受到了干扰 ,
其动物极和植物极的定位也相应地受到了干扰 ,这种
过程很可能会延续到 M2 代 ,使 M2 代中出现较大比例
(超过 20 %)的细胞偏离该个体正常的染色体数 ,这样
在制片时 ,就会看到不同染色体数的细胞产生一定程
度的嵌合。
参考文献 :
[ 1 ] 　宋振巧 ,王洪刚 ,王建华. 栝楼的研究进展 [J ] . 山东农业科学 ,
2005 ,5 :72～74
[ 2 ] 　张　洁 ,周立人 ,李德庆. 栝楼遗传育种及种质鉴定的研究进展
[J ] . 安徽农业科学 ,2006 ,34 (23) :6223～6224
[ 3 ] 　艾建国 ,高山林. 丹参同源四倍体的诱导鉴定及有效成分的含量
测定[J ] . 药物生物技术 ,2003 ,10 (6) :372
[ 4 ] 　乔传卓 ,吴美枢 ,戴富宝 ,崔 　熙 ,李 　玲. 菘蓝多倍体育种的研
究[J ] . 植物学报 ,1989 ,31 (9) :678～683
[ 5 ] 　吕世民 ,粱可钧 ,葛传吉 ,王继振 ,刘其民. 怀牛膝多倍体育种的
研究[J ] . 中药通报 ,1988 ,13 (7) :395～396
[ 6 ] 　乔传卓 ,李红方. 菘兰四倍体高产品系试种报告 [J ] . 中药材 ,
1994 ,17 (12) :678～679
[ 7 ] 　李贵全. 细胞学研究基础[M] . 北京 :中国林业出版社 ,2001 ,79～
99
[ 8 ] 　张贵友 ,吴　琼 ,林　琳. 普通遗传学实验指导[M] . 北京 :清华大
学出版社 ,2003 ,12～18
[ 9 ] 　周云龙. 植物生物学[M] . 北京 :高等教育出版社 ,1999 ,9180～86
[10 ] 　潘家驹. 作物遗传育种学总论[M] . 北京 :中国农业出版社 ,2005 ,
5 :137～140
[11 ] 　朱　军. 遗传学[M] . 北京 :中国农业出版社. 2001 ,1 ,278～280
[12 ] 　李正红 ,孙振元 ,彭镇华. 秋水仙素诱导地锦多倍体研究[J ] . 核农
学报 ,2005 ,19 (6) :430～435
[13 ] 　郑思乡. 芦笋多倍体诱导及其离体培养的研究 [J ] . 湖南农业科
学 ,1996 ,1122～23
[14 ] 　李天菲 ,蔡得田. 植物嵌合体机理及研究进展[J ] . 湖北大学学报 ,
2002 ,24 (1) :27～32
[15 ] 　罗向东 ,戴亮芳 ,钱春桃. 黄瓜属不同倍性异源多倍体的形态及
生理特性分析[J ] . 西北植物学报 ,2008 ,28 (3) :0542～0546
[16 ] 　李明银 ,何云晓. 植物遗传嵌合体及其在观赏植物育种中的应用
[J ] . 植物学通报 ,2005 ,22 (6) :641～647
224 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (3) :418～422