全 文 ：核 农 学 报 2010，24(3):522 ～ 526
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)03-0522-05
乌拉尔甘草胚状体的诱导及再生体系的建立
曹君迈 李 强 王 崇
(北方民族大学 生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021)
摘 要:用 L9(3
4)正交试验设计方法研究了乌拉尔甘草外植体、植物生长调节剂对胚状体诱导的影响，
并对胚状体诱导和成苗技术进行了探索。结果表明:适宜乌拉尔甘草胚状体诱导培养的最佳外植体为
芽，优化培养基为 MS +甘氨酸 0. 3g /L +蔗糖 30g /L +琼脂 5g /L + 2，4-D 0. 2mg /L;2，4-D 对胚状体诱
导具有促进作用。适宜胚状体诱导成苗的最佳外植体为芽，培养基为 MS，成苗率达到 66. 67%，外源激
素对胚状体诱导成苗具有抑制作用。
关键词:乌拉尔甘草;胚状体;再生
SOMATIC EMBRYOID GENESIS INDUCTION AND PLANT REGENERATION
in vitro IN Glycyrrhiza uralensis Fisch
CAO Jun-mai LI Qiang WANG Chong
(College of Biologcial Science＆Engineering，The North University for Ethnics，Yinchuan，Ningxia 750021)
Abstract:Using the orthogonal experiment design of L9(3
4)，the effects of explants uralensis，hormone types and
combinations on inducing embryoids，embryoids induced seedling cultivation and cultivation techniques were researched.
The results showed that the best explant was the shoot of Glycyrrhiza uralensis cultured by embryoid induction and the
optimal induction medium was MS + glycine 0. 3g /L + sucrose 30g /L + agar 5g /L + 2，4-D 0. 2mg /L. The obvious
promotion of 2，4-D to embryoid induction was observed. The shoot was the best explant which could induce the seedling
from the embryoid and the plantlet regeneration rate was 66. 67% with the medium of MS. The exogenous hormone
inhibited the induction of plantlet from embryoid.
Key words:Glycyrrhiza uralensis Fisch;embryoid;regeneration
收稿日期:2009-09-05 接受日期:2009-12-04
基金项目:宁夏自然科学基金(NZ0953)
作者简介:曹君迈(1964-)，女，宁夏银川，教授，硕士生导师，植物资源的利用及开发。E-mail:junmaicao@ 163. com
甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是豆科多年生草
本植物，以干燥的根及根状茎入药，素有“十方九草”
之称，为我国著名的大宗药材之一［1］，既是国家重点
保护的野生固沙植物、钙质土壤的指示植物，又是抗盐
性很强的盐生植物和饲用植物，在保护生态环境和草
原资源，防止土地沙漠化等方面起着重要的作用并广
泛用于食品、饮料、卷烟业和化妆品工业，具备生态和
经济的双重价值［2］。分布于北纬 30° ～ 55°之间的北
半球，集中分布于北纬 40°左右的干旱、半干旱区域
(谓之“甘草分布带)。我国约有甘草 10 ～ 16 种，主要
分布在西北、东北、华北等各省区沙地和沙质灰钙土
上，以新疆、内蒙古、宁夏和甘肃为中心产区［1，3］。我
国是世界上唯一的甘草生产大国，出口 30 多个国家和
地区，国内年需求量在 3 万 t 左右，年出口量约为 5 万
t［4］。近年来，由于人们过度采挖野生甘草、放牧等导
致草原生态环境，特别是甘草资源遭到严重破坏，为
此，国务院颁布了《关于禁止采集销售发菜制止滥挖
甘草麻黄草有关问题的通知》(国发［2000］13 号文
件)，使甘草的掠夺性采挖在一定程度上得到了控制。
近年来，国内外主要对甘草甜素及其衍生物、甘草
多糖、甘草黄酮类化合物的抗病毒、甘草药理、甘草新
品种选育、人工栽培及组培快繁技术等方面开展了大
225
3 期 乌拉尔甘草胚状体的诱导及再生体系的建立
量研究工作［5 ～ 12］。其他甘草的胚状体诱导及再生植
株的建立等已有大量文献报道［13 ～ 20］，而乌拉尔甘草胚
状体的诱导及再生体系建立的研究目前尚未见文献报
道。为此，我们开展了本项研究，旨在为甘草工业化生
产提供新途径和新方法，以缓解甘草资源的压力，达到
对天然甘草资源的保护和合理利用。
1 材料与方法
1. 1 材料
试验材料乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)
于 2008 年 5 月采自北方民族大学实验教学基地，经宁
夏大学生态中心李吉宁副教授鉴定。
1. 2 方法
1. 2. 1 愈伤组织的获得 取新鲜无病虫危害的甘草
根状茎、芽和叶，用自来水冲刷干净，洗洁精漂洗 1 遍，
再用流水冲洗 0. 5h，将根状茎和芽剪成长短为 0. 5 ～
1cm 的小段，将叶切成 0. 5cm2 小片，然后将其带入接
种室，在超净工作台上进行灭菌。用 75%的乙醇灭菌
20s，再用无菌水冲洗 3 ～ 5 次，然后用 5%的次氯酸钠
溶液灭菌 8 ～ 15min，再用无菌水冲洗 3 ～ 5 次，最后用
青霉素钠 200mg /L(W /V)灭菌 10min，用无菌水冲洗 3
～ 5 次，在无菌纸上吸干水分。分别将 3 种甘草外植
体接种到诱导愈伤组织培养基(MS + 6-BA 2mg /L + 2，
4-D 0. 5mg /L + 蔗糖 30g /L + 琼脂5g /L)上，每瓶接 4
个外植体，每种外植体接 30 瓶。在(25 ± 1)℃、黑暗
条件下培养 30d，诱导愈伤组织。
1. 2. 2 胚状体的诱导 在(25 ± 1)℃，光照 0 lx / d 的
条件下，将愈伤组织接种在 9 种(表 1)不同处理的培
养基上进行胚状体诱导，35d 后统计。
1. 2. 3 正交试验设计 对乌拉尔甘草不同外植体诱
导的愈伤组织采用 4 因素(2，4-D、ABA、NAA、6-BA)3
水平(0、0. 1、0. 2)的 L9(3
4)有重复正交试验设计，见
表 1。基本培养基为 MS + 甘氨酸 0. 3g /L + 蔗糖 30g /
L +琼脂 5g /L +激素(pH5. 8 ～ 6. 0)，每处理接 4 个外
植体，重复 4 次。
1. 3 结果统计
利用植物解剖镜和显微照像技术对胚状体发育过
程进行跟踪观察，并拍照及记录胚状体的发生情况
(每隔 2d 观察 1 次)，对统计的试验数据进行统计学
分析。
表 1 正交试验设计表
Table 1 Orthogonal experimental design table
处理
item
2，4-D
(mg /L)
ABA
(mg /L)
6-BA
(mg /L)
NAA
(mg /L)
1 1(0. 0) 1(0. 0) 1(0. 0) 1(0. 0)
2 1(0. 0) 2(0. 1) 2(0. 1) 2(0. 1)
3 1(0. 0) 3(0. 2) 3(0. 2) 3(0. 2)
4 2(0. 1) 1(0. 0) 2(0. 1) 3(0. 2)
5 2(0. 1) 2(0. 1) 3(0. 2) 1(0. 0)
6 2(0. 1) 3(0. 2) 1(0. 0) 2(0. 1)
7 3(0. 2) 1(0. 0) 3(0. 2) 2(0. 1)
8 3(0. 2) 2(0. 1) 1(0. 0) 3(0. 2)
9 3(0. 2) 3(0. 2) 2(0. 1) 1(0. 0)
2 结果与分析
2. 1 甘草愈伤组织的诱导
2. 1. 1 不同外植体对甘草愈伤组织诱导的影响 将
根状茎、芽、叶接种在 MS + 6-BA 2mg /L + 2，4-D
0. 5mg /L +蔗糖 30g /L + 琼脂 5g /L 的培养基上，诱导
愈伤组织。在相同培养基上，不同外植体形成愈伤组
织的时间不同，其时间顺序为:叶 < 芽 < 根状茎;愈伤
组织诱导率也不同，其顺序为:芽 >根状茎 >叶(见表
1)。由此说明外植体所处位置不同，脱分化形成时间
不同，愈伤组织诱导效果也各异。
表 2 甘草外植体愈伤组织发生及其特征
Table 2 Induced callus and its character from different explant of Glycyrrhiza uralensis
外植体
explant
接种块数
inoculation number
愈伤组织形成时间
callus formed
time(d)
愈伤组织
发生块数
callus number
愈伤组织颜色
callus colour
愈伤组织紧密程度
tight degree
of callus
愈伤组织诱导率
induction rate
of callus(%)
根状茎 rhizome 120 38 116 黄白 yellow white 较紧密 tighter 91
芽 bud 120 25 120 黄白 yellow white 较疏松 looser 100
叶 leaf 120 23 97 黄绿色 yellow green 较紧密 tighter 80
2. 2 甘草胚状体的诱导
2. 2. 1 不同外植体、激素组合及激素种类对甘草胚状
体诱导的影响 由表 2 和图版Ⅰ可看出在相同培养条
件下，3 种外植体即根状茎、芽、叶形成胚状体的能力
大小顺序为:芽 >根状茎 >叶。
由表 3 可知，3 种外植体经 9 种激素组合处理后，
325
核 农 学 报 24 卷
诱导胚状体的规律基本相同，其中 8、9 号处理对芽、根
状茎和叶的胚状体发生数与愈伤组织的比值均较高，
分别为 11. 00、12. 44;9. 00、9. 00 和 9. 63、10. 06，均与
其他处理差异达极显著水平，其次为 4 号处理，再次为
1 号处理，最差为 2、3 号处理。说明胚状体诱导的最
佳激素组合为:2，4-D 0. 2mg /L + ABA 0. 1mg /L + NAA
0. 2mg /L 或 2，4-D 0. 2mg /L + ABA 0. 2mg /L + 6-BA
0. 1mg /L。
不同激素处理对不同外植体胚状体的诱导效果均
有差异。不同激素种类对愈伤组织胚状体诱导率的极
差、F 检验和多重比较见表 3。4 种激素对根来源的愈
伤组织胚状体诱导的影响不同，其影响顺序是:2，4-
表 3 甘草不同外植体胚状体诱导及统计分析
Table 3 Induce embryoid from different explant of
G. uralensis and statistical analysis
外植体
explant
处理编号
No. of
treatment
接种愈
伤块数
inoculation
callus
number
胚状体
发生数
embryoid
number
胚状体发生
数 /愈伤组织块数
embryoid number /
callus number
1 16 119 7. 44bB
2 16 32 2. 00eD
3 16 34 2. 13eD
根状茎 4 16 131 8. 19abAB
rhizome 5 16 70 4. 38dC
6 16 70 4. 38dC
7 16 90 5. 63cC
8 16 144 9. 00aA
9 16 144 9. 00aA
平均数
average
92. 7 5. 79
1 16 99 6. 19efC
2 16 30 1. 88gD
3 16 33 2. 06gD
芽 4 16 155 9. 69cB
bud 5 16 115 7. 19deC
6 16 117 7. 31dC
7 16 93 5. 81fC
8 16 176 11. 00bAB
9 16 199 12. 44aA
平均数
average
113. 0 7. 06
1 16 80 5. 00deCD
2 16 8 0. 50fE
3 16 9 0. 56fE
叶 4 16 125 7. 81bB
leaf 5 16 67 4. 19eD
6 16 100 6. 25cBC
7 16 86 5. 38cdCD
8 16 154 9. 63aA
9 16 161 10. 06aA
平均数
average
87. 8 5. 49
注:新复极差法。
Note:Duncan’s new multiple range test.
表 4 植物生长调节剂对不同来源愈伤组织
胚状体诱导率的影响
Table 4 Effects of plant growth regulators on induction
rate of callus-derived embryoid
激素种类
hormones
激素水平
hormones
concentration
(mg /L)
胚状体诱导率
induction rate of callus-derived embryoid(%)
根状茎
愈伤组织
rhizome callus
芽愈伤组织
bud callus
叶愈伤组织
leaf callus
2，4 － D 0. 0 15. 4bB 13. 50bB 8. 08cC
0. 1 22. 58bB 32. 25aA 24. 33bB
0. 2 31. 50aA 39. 00aA 33. 42aA
p < 0. 01 < 0. 01 < 0. 01
R 16. 10 25. 50 25. 34
ABA 0. 0 28. 33 28. 92 24. 25
0. 1 20. 50 26. 75 19. 08
0. 2 20. 67 29. 08 22. 50
p > 0. 05 > 0. 05 > 0. 05
R 7. 83 2. 33 5. 17
6 － BA 0. 0 27. 75a 32. 67aA 27. 83aA
0. 1 25. 58a 32. 00aA 24. 50aA
0. 2 16. 17b 20. 08bB 13. 50bB
p < 0. 05 < 0. 01 < 0. 01
R 11. 58 12. 59 14. 33
NAA 0. 0 27. 75aA 34. 42aA 25. 67aA
0. 1 16. 00bB 20. 00bB 16. 17bB
0. 2 25. 75aA 30. 33aA 24. 00aAB
p < 0. 01 < 0. 01 < 0. 01
R 11. 75 14. 42 9. 50
注:同一列同一因素处理内，不同小写字母表示差异显著(P < 0.
05) ，大写字母表示差异极显著(P < 0. 01) ，R 代表极差。
Note:In the same column of the same factor treatment ，different small
letters mean significant difference (P < 0. 05) ，different capital letters
mean extremely significant difference (P < 0. 01) ，and R means range.
D > NAA > 6-BA > ABA;对芽来源的愈伤组织胚状体
诱导的影响顺序是:2，4-D > NAA > 6-BA > ABA;对叶
来源的愈伤组织胚状体诱导的影响顺序是:2，4-D > R
6-BA > NAA > ABA。经 F 检验和多重比较，外源激素
对不同来源的愈伤组织胚状体诱导均具有极显著影
响。在胚状体诱导中无论选用哪种外植体，ABA、6-BA
和 NAA 均对胚状体诱导不产生直接影响，只有 2，4-D
对胚状体诱导起关键作用。因此，胚状体诱导的最佳
激素水平为只添加 2，4-D 0. 2mg /L。由此得出 3 种外
植体胚状体诱导的最优方案为:MS + 2，4-D 0. 2mg /L
+ ABA 0mg /L + NAA 0mg /L + 6-BA 0mg /L。
2. 3 植株再生的研究
将 3 种不同来源的愈伤组织接种到 9 种处理的胚
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3 期 乌拉尔甘草胚状体的诱导及再生体系的建立
图版Ⅰ 不同外植体对胚状体诱导的影响
Plate I Effects of different explants on induction rate of embryoid
A:芽愈组在 9 号培养上诱导胚状体;A:induced embryoid with bud callus in No. 9 media;
B:叶愈组在 9 号培养上诱导的胚状体;B:induced embryoid with leaf callus in No. 9 media;
C:根状茎愈组在 9 号培养上诱导的胚状体;E:胚状体;C:induced the embryoid with rhizome callus in No. 9 media;E:embrgoid
状体诱导培养基上，待其发育成子叶胚时，转接到不添
加外源激素的 MS 培养基中，发现不同来源的愈伤组
织诱导的胚状体出苗率不同，其中芽来源的出苗率最
高，根状茎来源的次之，叶来源的最差。在不添加任何
外源激素的 1 号培养基中诱导出的胚状体出苗率最
高，达 66. 67%，其他处理诱导的胚状体转接到 MS 培
养基上后出苗率均不如 1 号处理的培养基，因此，适合
胚状体成苗的培养基为 MS 培养基(见图 1)。由此可
推断，2，4-D、ABA、6-BA 和 NAA 对胚状体的出苗起不
同程度的抑制作用(胚状体发育过程见图版Ⅱ:A-E)。
图 1 不同植物生长调节剂对不同来源外
植体胚状体成苗率的影响
Fig. 1 Effects of different plant growth regulators
on regeneration rate of plants from embryoids
图版Ⅱ 甘草不同时期的胚状体和再生苗
Plate Ⅱ Embryoid and regeneration plant of Glycyrrhiza uralensis at defferent development stages
A:球形胚;B:心形胚;C:鱼雷胚;D:子叶胚;E:再生苗
A:globular embryoid;B:heart- shape embryoid;C:torpedo-shape embryoid;D:cotyledonary embryoid;E:regenerated plantlet
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3 讨论
3. 1 外植体对诱导胚状体的影响
目前，国内对甘草的研究仅限于人工栽培技术、新
品种选育、生物化学、药理、组培快繁技术等方面，对乌
拉尔甘草进行胚状体诱导及再生体系建立方面的研究
尚未见报道。根据细胞全能性理论，植物任何器官都
可以用作外植体，但不同组织器官培养成功的难易程
度是不同的。同一种植物不同的组织和器官再生能力
也有很大差异，接种材料的组织部位、植株年龄、取材
季节以及植株的生理状态等都会直接影响培养效
果［14］。本试验采用甘草的根状茎、叶、芽作为外植体
进行愈伤组织和胚状体的诱导，其愈伤组织诱导效果
与曹君迈等的结论相一致，即芽的效果最好，根状茎次
之，叶最差。
3. 2 激素对胚状体诱导的影响
本试验在甘草组织培养过程中，不同激素种类、组
合和不同外植体对诱导胚状体和植株再生的影响差异
十分显著。本试验采用正交设计试验方式，在传统的
单因子比较方法的基础上容纳更多的因素和水平，极
大地减少了试验次数，提高了准确率［14］。以诱导率和
出苗率为指标，通过多重比较发现，2，4-D 是影响甘草
胚状体诱导的关键因素，无激素培养基有利于胚状体
的成苗。这与冯大领的统计结果即认为 2，4-D 对大部
分植物体细胞胚诱导有重要作用的观点相一致［21］。
3. 3 胚状体诱导成苗影响因素的探讨
本试验发现，甘草 3 种不同外植体所诱导出来的
胚状体须及时转接至不含任何外源激素的 MS 培养基
上，才能够培育成苗，过早或过晚转接都对胚状体成苗
不利。
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(责任编辑 王媛媛)
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