全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 042548207
超低温保存小麦种子和幼苗的遗传变异分析
陈　芳　王子成　何艳霞　曲　先
(河南大学生命科学学院农业生物技术研究所 ,河南 开封　475004)
摘 　要 :以小麦 ( Triticum aestivum L. )品种周 98165 和开 18 的种子与幼苗为材料 ,对它们超低温 (液氮中)
保存前后的发芽和成活率及田间生长指标进行了研究 ,并采用 AFLP 和 MSAP 技术对其遗传稳定性作了
初步探讨。结果表明 ,小麦种子经超低温保存后 ,其发芽率和成活率与对照相比有一定的差异 ,但田间
生长 ,除分蘖数稍低于对照外 ,其他生长指标与对照相比没有明显区别。而超低温保存后的幼苗 ,各项
生长指标与对照均有显著差异。AFLP 技术分析了超低温保存前后的样品 ,同一品种不同处理间的
AFLP带型一致 ,统计的 1500 多条带中未见明显差异带型 ,表明在超低温保存前后无论是种子还是幼
苗 ,其基因组 DNA 序列均没有发生变异。进一步用 MSAP 技术分析了超低温保存后的样品的甲基化水
平 ,13 对引物共扩增出 590 多条清晰的带 ,与对照相比 ,超低温保存后的材料均产生了不同程度的甲基
化变化 ,其中变异带最多的达 83 条 ,变异率高达 13167 % ,且脱甲基化变化是主要趋势。
关键词 :小麦 ;超低温保存 ;遗传变异 ;AFLP ;MSAP
ANALYSIS OF GENETIC VARIATION OF WHEAT SEEDS AND SEEDLINGS
CAUSED BY ULTRA2LOW2TEMPRATURE PRESERVATION
CHEN Fang 　WANG Zi2cheng 　HE Yan2xia 　QU Xian
( Institute of Agricultural Biotechnology , College of Life Science , Henan University , Henan Kaifeng 　475004)
Abstract :The germination , survival rate and growth indexes in the field after cryopreservation (in liquid N , LN) of wheat
cultivars Zhou 98165 and Kai 18 were studied. The genetic stability of the samples was analyzed by AFLP and MSAP. The
results showed that the germination and survival rate of wheat seeds were different to the control after cryopreservation. When
grown in the field , the growth indexes had no significant difference except the tiller number was slightly lower than that of the
controls. However , the growth parameters of seedlings after cryopreservation were significantly different from controls. No
polymorphic bands were found among different samples within one cultivar in more than 1 ,500 bands by AFLP analysis. The
results revealed that no nucleotide sequence had altered during cryopreservation. Analysis of the DNA methylation level by
MSAP showed that thirteen pairs of primers amplified more than 590 bands , and some methylation alterations were found in the
samples after cryopreservation. The maximum of variation bands were up to 83 , and the variation rate was as high as 13167 % ,
meanwhile , the main trend was demethylation.
Key words :wheat ( Triticum aestivum L. ) ; cryopreservation ; genetic variation ; AFLP ; MSAP
收稿日期 :2008211212 　接受日期 :2009201215
基金项目 :河南大学校内基金重点项目 (06ZDZR011) ,河南省青年骨干教师项目 (河南省教育厅教高 200733529)
作者简介 :陈　芳 (19752) ,女 ,河南开封人 ,硕士研究生 ,研究方向为植物表观遗传学。E2mail :ljbcf325 @1631com
通讯作者 :王子成 (19742) ,男 ,河南邓州人 ,博士 ,副教授 ,主要从事植物遗传学及生物技术研究。E2mail :wzc @henu. edu. cn　　一般认为储藏干种子是植物种质资源保存最经济实用的方法 ,但这种方法只能保存正常性的种子 (种子 耐脱水和干燥 ,如小麦、玉米等大部分种子) 而不能保存顽拗性种子 (种子对脱水敏感 ,储藏中忌低温和干
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燥 ,如芒果、苦瓜等种子) ,且受保存年限的限制。近年
超低温保存的研究发展迅速 ,自液氮 (LN) 作冷源对植
物材料进行超低温保存试验成功[1 ] 以来 ,国内外已用
不同的技术对 200 多种植物材料进行了超低温保存研
究。其中玻璃化超低温保存[2 ]和包埋 - 脱水超低温保
存[3 ]技术以种子成活率高、效果好等优点应用较广。
DNA 甲基化是基因组遗传信息的重要组成部分 ,
是物种遗传多样性形成和体细胞无性系变异的因素之
一[4 ] 。DNA 甲基化在高等生物的生命活动中具有维
持基因组稳定及调节生长发育等重要功能 ,在植物发
育和分化过程中 ,其水平不足或过高 ,都会导致生长发
育的不正常和形态异常[5 ,6 ] 。一些生物和非生物逆境
因素常可导致 DNA 甲基化的变化 ,从而产生表观遗传
变异[7 ] 。Labra 等报告植物体内基因组甲基化水平的
变化与不同环境胁迫有关[8 ] 。低温及超低温处理过
程 ,是一个干旱和低温逆境胁迫的过程 ,有研究表明在
这些胁迫下植物体内会产生大量的自由基 ,可能会使
细胞遗传物质发生变化[9 ] 。郝玉金等的研究表明苹
果、草莓等植物超低温保存后再生能力提高 ,并认为这
可能与 DNA 去甲基化有关[10 ] 。
小麦 ( Triticum aestivum L. ) 是我国重要的农作物 ,
其产量和种植面积均居于栽培谷物的前列。目前 ,有
关小麦超低温保存的研究多用于干种子[11～13 ] ,也有花
粉母细胞[14 ]和合子胚[15 ]等 ,对小麦超低温保存后的生
长发育及遗传变异的研究却很少 ,只有石思信等对超
低温保存后小麦种子的农艺性状、根尖染色体和醇溶
蛋白等方面进行过分析[13 ] ,而从分子水平上对超低温
保存后小麦种子和幼苗的遗传变异的研究还未见报
道。本试验对小麦种子和幼苗进行超低温保存 ,并运
用 AFLP 和 MSAP 技术检测和分析小麦基因组 DNA 甲
基化变化情况 ,以探讨种子及幼苗保存后的生长及遗
传变异情况 ,为从 DNA 分子水平上揭示超低温保存对
植物遗传变异机理的影响提供一定理论依据。
1 　材料和方法
111 　材料
供试材料为本研究所当年采收后 4 个多月的小麦
种子周 98165 和开 18 ,经适当晾晒 ,测定其含水量为
12 %左右 ,幼苗来源于萌发的种子。
112 　方法
11211 　种子的萌发　小麦种子经 011 %升汞消毒后接
种于 MS 培养基上 ,分别萌发 1、2 和 3d ,温室条件 :
24 ℃±1 ℃,白炽灯 50μmolΠms ,16h 光照。
11212 　干种子超低温保存　干种子用纱布包好 ,直接
投入液氮 (LN)中 ,24h 后在 40 ℃水浴中快速解冻。
11213 　干种子和幼苗玻璃化法超低温保存　保存方
法参照王子成[2 ]的程序。将小麦种子、萌发 1、2 和 3d
的小麦幼苗置于冷冻管中 ,加入预处理液 (2molΠL 甘油
+ 014molΠL 蔗糖) 处理 20min ,用无菌胶头滴管将预处
理液小心移除后 ,再用玻璃化溶液 PVS2 {30 %(WΠV) 甘
油 + 15 % (WΠV) 乙二醇 + 15 % (WΠV) DMSO + 014molΠL
蔗糖}0 ℃处理 50min。把装有新鲜 PVS2 和材料的冷冻
管直接投入LN 中 ,24 h 后取出冷冻管 ,在 40 ℃水浴中
迅速化冻 3min 后 ,用洗涤液 (MS 液体培养基 + 112molΠ
L 蔗糖)将化冻后的材料洗涤 3 次。
对照 (不经过任何处理的小麦种子) 、干种子直接
超低温保存、干种子及萌发 1、2、和 3 d 的小麦幼苗玻
璃化法超低温保存的处理编号分别设为 0、1、2、3、4、5。
11214 　恢复培养 　对照和 2 种超低温方法保存解冻
后的小麦种子采用培养皿籽粒发芽法 ,每皿 50 粒 ,3
个重复 ,温室发芽 ,3d 测发芽势 (发芽势 = 3d 发芽的种
子数Π处理的种子数 ×100 %) ,7d 测发芽率 (发芽率 =
7d 发芽的种子数Π处理的种子数 ×100 %) 。小麦幼苗
长到三叶一心期时 ,随机取 10 株麦苗嫩叶混合提取
DNA ,并将麦苗移载大田 ,观察田间生长情况。
经超低温保存处理 ,解冻并洗涤后的幼苗立即转
移到 MS 培养基上 ,温室培养 ,7d 或 10d 后统计成活率
(以芽泛绿为准) 。成活率 ( %) = 成活的苗Π处理的苗
×100 %。待幼苗长至三叶一心期 ,取嫩叶混合提取
DNA ,将麦苗移载大田并观察田间生长情况。
11215 　分子标记检测遗传变异情况 　采用 CTAB 法
提取小麦嫩叶DNA ,参照Micheli 等[16 ]的方法并略作改
动。
AFLP 分析参照 Hao Y J 等[17 ] 的方法 ,略有改动。
酶切 :20μl 体系中加入 3U EcoRI ,3U MseI ,200ng 基因
组 DNA ;连接 : EcoR I接头 , MseI 接头 ,T4 连接酶 ,25 ℃
连接 215h ;预扩 :预扩引物为 E2A、M2C , Taq 酶 ,扩增
2h ;7 对引物组合用于 AFLP 选扩。选扩产物 94 ℃变性
5min 后上样于 6 % PAGE ,恒功率 55 W 电泳 215 h ,电
泳结束后经固定、银染漂洗与显色后分析结果并拍照。
MSAP 分析参照略修改的 Cervera 等[18 ] 方法。与
本文 AFLP 方法类似 ,其中内切酶组合为 EcoRIΠHapII
和 EcoRIΠMspI ,接头为 EcoRI 接头和 H2M 接头 ,预扩
引物为 E2A 和 HapII2MspI ,选扩引物组合 13 对。2 种
分子标记检测所用的接头及引物来自上海生工公司 ,
详见表 1。
945　4 期 超低温保存小麦种子和幼苗的遗传变异分析
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表 1 　AFLP和 MSAP分析的接头及引物序列
Table 1 　Sequences of adapters and primers for AFLP and MSAP
接头Π引物 adaptersΠprimers 序列 sequences
接头 adapter EcoRI2adapterI 5’2CTCGTAGACTGCGTACC23’
EcoRI2adapterII 5’2AATTGGTACGCAGTC23’
MseI2adapterI 5’2GACGATGAGTCCTGAG23’
MseI2adapterII 5’2TACTCAGGACTCAT23’
HpaII2MspI2adapterI 5’2GATCATGAGTCCTGCT23’
HpaII2MspI2adapterII 5’2TCATGATCCTGCTCG23’
预扩引物 preselective primers E2A 5’2GACTGCGTACCAATTCA23’
M2C 5’2GATGAGTCCTGAGTAAC23’
HpaII2MspI 5’2ATCATGAGTCCTGCTCGG23’
选扩引物 selective primers EcoRI2AAC 5’2GACTGCGTACCAATTCAAC23’
EcoRI2ACT 5’2GACTGCGTACCAATTCACT23’
EcoRI2AGG 5’2GACTGCGTACCAATTCAGG23’
EcoRI2ACA 5’2GACTGCGTACCAATTCACA23’
EcoRI2ACT 5’2GACTGCGTACCAATTCACT23’
EcoRI2AGC 5’2GACTGCGTACCAATTCAGC23’
EcoRI2ACC 5’2GACTGCGTACCAATTCACC23’
EcoRI2AAG 5’2GACTGCGTACCAATTCAAG23’
MseI2CAA 5’2GATGAGTCCTGAGTAACAA23’
MseI2CTG 5’2GATGAGTCCTGAGTAACTG23’
MseI2CTC 5’2GATGAGTCCTGAGTAACTC23’
MseI2CTA 5’2GATGAGTCCTGAGTAACTA23’
MseI2CAT 5’2GATGAGTCCTGAGTAACAT23’
HpaII2MspI2TCAA 5’2ATCATGAGTCCTGCTCGGTCAA23’
HpaII2MspI2TCCA 5’2ATCATGAGTCCTGCTCGGTCCA23’
113 　数据分析
采用 SPSS 1010 软件中的 One2Way ANOVA 进行多
重比较 ;采用 Origin 715 软件作图。
2 　结果与分析
211 　超低温保存对小麦种子发芽和幼苗成活率的影
响
2 个品种的小麦种子经超低温保存后都有一定的
发芽能力。从图 1 (左图) 可以看出 ,周 98165 和开 18
超低温保存后种子 (处理 1、2) 的发芽势、发芽率 ,与对
照 (0)相比均有明显降低。玻璃化法超低温保存后 ,萌
发 1、2 和 3d 幼苗 (处理 3、4、5)的成活率随萌发天数的
增加而明显下降 (图 1 ,右图) 。与萌发 2、3d 幼苗相
比 ,萌发 1d 的小麦幼苗经超低温保存后培养 10d 的成
活率较高 ,为 5015 %(周 98165) 、6817 %(开 18) 。干种
子直接液氮处理 (处理 1) 后 ,10d 的成活率明显较低 ,
而玻璃化法超低温保存的种子 (处理 2) 10d 的成活率
与对照没有显著差异 ;相对处理 1 ,处理 2 的发芽势和
10d 成活率稍高。玻璃化法超低温保存的材料的成活
率 10d 时比 7d 时高 10 %左右 ,且小麦品种不同 ,超低
温保存前后材料的成活率开 18 明显大于周 98165。
观察统计发现 ,超低温保存的幼苗恢复培养后其
生长发育比对照都滞后 3～4d ,成活率明显较低。萌
发 2～3d 后的小麦幼苗经超低温处理后恢复培养 5d ,
部分幼苗开始泛绿 ,但其根逐渐转为褐色 ,不再生长 ,
14d 后仅 20 %左右的成活幼苗有愈伤组织形成 ,从愈
伤组织到根生成至少需要两周时间。没有形成愈伤组
织的幼苗叶子开始变黄 ,30d 后枯萎死亡。因此萌发
2、3d 的小麦幼苗 (处理 4、处理 5)超低温保存后无法与
其他处理一样移栽大田做进一步的观测。
212 　超低温保存对小麦田间生长指标的影响
同遗传性状有关的主要生长指标有分蘖数、开花
时间、株高、穗长、穗粒数、千粒重等。田间观察表明 ,
在整个生长周期 ,各处理组与对照都能正常生长发育 ,
其叶形、叶色、穗形、籽粒颜色等农艺性状基本一致。2
个品种的小麦处理 1 和处理 2 的生长指标与对照相
比 ,没有明显变化 ,仅处理 1 118 个 (周 98165) 、218 个
(开 18)的平均分蘖数低于对照的平均分蘖数 212 个
(周 98165) 、311 (开 18) 个 ,且有显著性差异 ;而处理 3
在分蘖数、株高、穗长、穗粒数、千粒重指标上均明显低
于对照 ,且开花日期也相对延迟 1～2d (表 2) 。结果表
明 ,超低温保存后的种子和对照之间没有明显差异 ,但
超低温保存对幼苗的影响较大。
055 核　农　学　报 23 卷
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图 1 　超低温保存对小麦种子的发芽和成活率 (左)及幼苗成活率 (右)的影响
Fig. 1 　Effect of cryopreservation on germination statues and survival
rate of wheat seeds(L) and survival rate of seedlings(R)
0 :对照 ,不作任何处理的种子 ;1 :直接超低温保存干种子 ;2 :玻璃化法超低温保存的种子 ;
3、4、5 :玻璃化法超低温保存的萌发 1、2 和 3d 的小麦幼苗。下图表同
0 :controls ,seeds without treatment ; 1 :dry seeds after cryopreservation ; 2 :seeds after cryopreservation by vitrification ;
3 ,4 ,5 :wheat seedlings which germinated 1 , 2 and 3 d , respectively with cryopreservation by vitrification. The same as following tables and figures
表 2 　对照与超低温保存后的小麦田间生长指标
Table 2 　Growth indexes of wheat from cryopreservation and control in the field
品种
cultivar
处理
treatment
分蘖数
tiller number
开花期
flowering time
(monthΠday) 株高plant height(cm) 穗长panicle length(cm) 穗粒数grains per panicle 千粒重1000 grainweight (g)
周 98165 Zhou 98165 0 2. 2 4Π26 57. 10 7. 18 39. 4 46. 8
1 1. 8 3 4Π26 56. 35 7. 32 39. 1 46. 2
2 2. 2 4Π27 55. 12 6. 84 37. 8 46. 7
3 1. 1 3 4Π28 41. 71 3 5. 17 3 22. 8 3 42. 2 3
开 18 Kai 18 0 3. 1 4Π27 61. 64 10. 28 67. 6 40. 05
1 2. 8 3 4Π23 58. 56 10. 25 66. 9 39. 83
2 3. 0 4Π27 61. 56 10. 16 66. 4 39. 04
3 1. 9 3 4Π28 45. 00 3 8. 33 3 33. 0 3 34. 2 3
注 : 3 表示与对照相比有显著性差异α= 0105。
Note : 3 indicate significant change compared to controls ,α= 0105.
213 　基因组序列的 AFLP检测结果
所选用的 7 对引物组合对 2 个品种的 8 个样品进
行扩增 ,均能扩增出清晰的条带 ,分别扩增出 1520 (周
98165)和 1548 (开 18)条带 ,平均每对引物扩增 50 多条
带。每对引物对 2 个品种各 4 个样品扩增的多态性位
置基本相同 ,2 个品种之间的差异带有 3～6 条 ,2 个品
种在分子水平上虽有差异 ,但同一品种不同处理之间
未见明显差异带 (如图 2A) 。说明对照与处理的基因
组序列保持一致 ,未发生遗传变异。
214 　MSAP检测甲基化水平变化
HapII和 MspI 是具有不同甲基化敏感性的同裂
酶 ,常用来检测胞嘧啶甲基化 ,二者均识别并切割
CCGG位点。HapII 不能切割双链中 1 个或 2 个胞嘧
啶甲基化位点 ( CmCGGΠGGmCC、mCmCGGΠGGmCmC) ,
MspI 不 能 切 割 外 侧 胞 嘧 啶 甲 基 化 ( mCCGGΠ
GGCC) [19 ,20 ] ,因此 ,利用这 2 种酶的差异性就可检测出
CCGG序列的甲基化状态。本研究将 MSAP 方法测出
的限制带型分为 a、b、c、d 4 种 (见表 3) 。a 表示 H、M
都有带 ( + 、+ ) (如图 2B - a) ,b 表示 H 有带、M 没带
( + 、- ) (如图 2B - b) ,c 表示 H 没带、M 有带 ( - 、+ )
(如图 2B - c) ,一般认为 ,MSAP 不能检测到 DNA 外侧
或内、外侧胞嘧啶完全甲基化位点 (mCCGGΠGGCmC
或mCmCGGΠGGmCmC) [21 ,22 ] ,即 H、M 在此酶切位点无带 ,
如果对照有而超低温保存的材料无带或对照无而超低
温保存材料有带 ,则说明超低温保存的材料在此位点
发生了甲基化变化 ,将这种情况下的带型用 d 表示
155　4 期 超低温保存小麦种子和幼苗的遗传变异分析
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(
- 、- ) 。
图 2 　基因组 DNA 的 AFLP(A)和 MSAP(B)
分析电泳谱带
Fig. 2 　DNA2AFLP finger2printing (A)
and DNA methylation MSAP finger2printing map (B)
H: EcoRIΠHapII , M: EcoRIΠMspI。
箭头所指为变异带 ,引物组合分别为 EcoRI2AAGΠMseI2CTC
和 EcoRI2AGGΠHpaII2MspI2TCAA ,B 图中小麦品种为周 98165
H: EcoRIΠHapII , M: EcoRIΠMspI. The arrows indicate
polymorphic. Primer combination : EcoRI2AAGΠMseI2CTC and
EcoRI2AGGΠ HpaII2MspI2TCAA respectively ,
Wheat variety :Zhou 98165 in figure B
表 3 　HapII和 MspI的甲基化敏感性、
扩增带型和带型分类
Table 3 　The methylation sensitive and restriction bands
of HapII and MspI and the classify of the bands pattern
甲基化状态
methylation status
内切酶活性
activity of
thermophiles
扩增带型
amplified
banding
patterns
带型分类
classify
of the
bands
pattern
HapII MspI H M
CCGGΠGGCC CmCGGΠGGCC 有 有 + + a
mCCGGΠGGCC mCmCGGΠGGCC 有 无 + - b
CmCGGΠGGmCC mCmCGGΠGGmCC 无 有 - + c
mCCGGΠGGCmC 无 无 - - d
注 :H : EcoRIΠHapII ;M: EcoRIΠMspI ; + 表示有带 , - 表示无带。
Note :H: EcoRIΠHapII ;M: EcoRIΠMspI ; + means the band presents in the page ,
- means the band is not present in the page.
DNA 甲基化增加的带型变化可总结为 (a →b、a →
c、a →d ,b →c、b →d 、c →d) ,相反 ,去甲基化变化的带型
为 (d →c、d →b、d →a、c →b ,c →a、b →a) 。13 对引物组
合共扩出 600 条左右清晰条带 ,其中 ,a 型带最多 ,有
300 多条 ,c 型带 100 条左右 ,比 b 型带略少 (表 4) 。与
对照相比 ,超低温保存后的材料均存在甲基化变异带 ,
并且 2 个品种的统计结果相似 ,说明超低温保存对材
料的 DNA 甲基化状态有一定的影响。其中干种子直
接超低温保存后的变异带最多 ,达 80 多条 ,变异率达
13 %以上 ;经玻璃化法超低温保存后的种子变异带最
少 ,仅 20 多条 ,变异率不到 5 % ;萌发 1d 的幼苗保存后
的变异带和变异率虽然相对较高 ,但比直接液氮处理
的干种子的变异带少一半 ,变异率减少一半多。表 4
表明 ,玻璃化法超低温保存比直接超低温处理材料的
变异率小得多 ,说明玻璃化法在超低温保存过程中对
减少材料的变异有一定的作用。
对 2 个品种的带型变化做进一步统计分析 (表
5) ,发现处理和对照比较的 12 种带型变化中 ,甲基化
增加的带型处理 1 都有 ,以 b →d 型最多 ,2 个品种均
达 14 条 ,处理 2 a →b 型仅有 1 条、a →c 型 3 条 (周
98165) 、4 条 (开 18) ;甲基化减少的带型处理 1、处理 2、
处理 3 基本都有 ,其中 b →a 最多 ,说明去甲基化的带
型变化较一致。表 4、表 5 中 2 个小麦品种各个处理的
甲基化增加条带数比甲基化减少条带数少 ,周 98165
和开 18 的处理样 1、2、3 的甲基化增加总条带数分别
有 25、4、12 条和 26、5、12 条 ,而甲基化减少的条带总
数分别为 56、22、28 条和 57、22、29 条。结果表明超低
温保存后的材料中既有甲基化增加现象 ,又有脱甲基
化变化 ,总的来看脱甲基化变化是主要趋势。
3 　讨论
超低温保存技术在植物种质保存中的潜在应用价
值 ,越来越得到人们的重视 ,原理是在超低温条件下 ,
细胞的全部代谢活动近乎停止 ,大大减慢甚至终止代
谢和衰老过程 ,保持了生物材料的稳定性 ,从而减少遗
传变异的发生 ,达到长期保存的目的[23 ] 。本试验对小
麦干种子直接LN( - 196 ℃)处理和用玻璃化法对小麦
种子和幼苗进行了超低温保存。结果表明 ,超低温保
存后的材料在发芽势、发芽率及成活率上 ,均受到了不
同程度的影响 ,尤其是超低温保存的幼苗 (萌发 1 d)虽
然在外形上与对照差别不大 ,但其各项生长指标都明
显低于对照。而萌发 2 和 3 d 的幼苗由于根苗太大 ,
超低温保存后的成活率明显较低 ,即使成活的苗 ,也需
要重新生根 ,否则在培养过程中将会逐渐枯萎死亡 ,因
此萌发的小麦幼苗不利于进行超低温保存研究。此
外 ,玻璃化法超低温保存的材料都出现一定程度的生
长迟滞期 (3～4 d) ,而直接超低温处理的材料没有发
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现这种情况 ,形成这个迟滞期的原因可能是预处理液
或冰冻保护剂的脱水作用对材料造成了伤害。本实验
室在对拟南芥的超低温保存研究中也发现预处液处理
的时间过短或过长都会对材料造成伤害而降低成活
率。本研究还发现玻璃化法超低温保存在抑制材料的
DNA 甲基化变异方面有一定的积极作用 ,它比直接超低
温处理材料的甲基化变异率低 50 %以上。可能是玻璃
化法保存过程中 ,冰冻保护液和保存材料同时进入了玻
璃化状态 ,使细胞免受因冰晶的形成对其造成的机械伤
害[24] 。Kaity 等对超低温保存后木瓜的遗传和表观遗传
变异研究表明 ,超低温技术中的快速冻融过程是影响植
物成活率和基因组甲基化变化主要原因[25] 。
表 4 　超低温保存前后材料的 MSAP带型统计及甲基化变化情况
Table 4 　MSAP2banding patterns and DNA methylation variational status of samples
处理 treatment
扩增带型及带数
the pattern and number
of bands amplified
aΠbΠcΠtotal number 3 总变异带数total mutationfragments 变异率mutation rate( %) 甲基化增加条带数de novo methylationfragments 甲基化减少条带数demethylationfragments
周 98165 Zhou 98165
0 306Π177Π108Π591
1 344Π157Π098Π599 81 13. 52 25 56
2 313Π167Π110Π590 26 4. 41 4 22
3 322Π166Π102Π590 40 6. 78 12 28
开 18 Kai 18
0 309Π176Π109Π594
1 346Π158Π100Π604 83 13. 67 26 57
2 315Π167Π111Π593 27 4. 53 5 22
3 324Π167Π103Π5941 41 6. 89 12 29
注 : 3 中 a、b、c 分别表示扩增的带型。下表同。
Note : 3 a、b、c represent the bands pattern of amplification , respectively. The same as following table
表 5 　超低温保存前后材料的带型变异情况
Table 5 　Banding patterns variational status of samples compared to control
处理 treatment
甲基化增加带型
de novo methylation banding patterns
甲基化减少带型
demethylation banding patterns
a →b a →c a →d , b →c b →d c →d d →c d →b d →a c →b , c →a b →a
周 98165 Zhou 98165
1 3 1 1 1 14 5 2 10 16 1 8 19
2 1 3 0 0 0 0 4 0 1 1 4 12
3 2 1 2 0 3 4 5 2 1 0 8 12
开 18 Kai 18
1 4 1 1 1 14 5 2 11 16 1 8 19
2 1 4 0 0 0 0 4 0 1 1 4 12
3 2 1 2 0 3 4 5 2 1 0 9 12
　　近年来研究表明 ,表观遗传信息 ,尤其是 DNA 甲
基化对于植物的生长发育具有重要的调控作用 ,基因
组的甲基化对于维持基因组的稳定性和基因的表达都
起重要作用 ,其异常有时会影响到植物的表型性状。
对于这方面的研究 ,近年越来越受到关注。有研究表
明环境因素能不断增加基因组的灵活度和适应能力 ,
环境改变引起的表观遗传变异可以遗传给后代[26 ,27 ] 。
Akimoto 等已从基因水平上证明了水稻的一些表观变
异性状能稳定遗传[28 ] 。MSAP 技术为植物表观遗传研
究提供了一种有效工具 ,已在许多研究领域得到广泛
应用 ,但也存在局限性 :不能有效检测外胞嘧啶的甲基
化 ,同一种甲基化模式 ,如 H 有带而M 无带的情况 ,无
法辨别是单链 DNA 外部胞嘧啶甲基化或是内外胞嘧
啶都甲基化[29 ] ;无法检测非 CCGG位点的胞嘧啶甲基
化 , 且在任何给定的 DNA 序列中大概只有小于 5 %的
被甲基化的胞嘧啶能被鉴定出来[30 ] ,因此这种方法检
测出来的甲基化位点必然低于实际甲基化位点的值。
本研究发现 ,AFLP 分析对照与处理的 DNA 序列没有
明显差异条带 ;但 MSAP 检测到超低温保存后的材料
在甲基化变化上与对照有很大差异 (图 2B) ,甲基化增
355　4 期 超低温保存小麦种子和幼苗的遗传变异分析
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加和减少的条带都有 ,其中脱甲基化占的比率较大 ,说
明超低温保存后材料甲基化变化的主要方向为脱甲基
化。而在前人的研究中也发现超低温保存对植物材料
具有脱甲基化作用[17 ] ,一些研究表明低温可引起材料
的 DNA 发生甲基化变化[31 ,32 ] 。我们近期的研究也表
明 ,超低温保存后的拟南芥[33 ] 、欧李 (待发表) 再生材
料均发生了 DNA 甲基化变异 ,而且这种变异可以通过
有性生殖 (在拟南芥上)和无性繁殖 (在欧李上)进行遗
传传递。这些发生 DNA 甲基化变化的位点是编码序
列还是非编码序列 ,如果是编码序列 ,又涉及哪些基
因 ,还需要进一步的深入研究。另外 ,小麦基因组中有
大量的转座因子 (包括反转录转座子) 的存在 ,这些转
座子多数是高度甲基化的 ,从而保证了基因组的遗传
稳定性。而超低温保存发生的脱甲基化作用 ,是否对
甲基化转座子的活性产生影响 ,也需要关注。
DNA 甲基化水平在植物的不同组织和生长的不
同时期都有差异[21 ,34 ] ,其高低都会影响植物生长发育。
为了减少试验误差 ,本研究的取材都选择在同一生理
期即小麦幼苗三叶一心期的幼嫩叶片为材料提取
DNA ,为了保证酶切充分 ,在酶量充足的条件下 DNA
浓度都控制在 20ngΠμl 以内。本试验中 ,玻璃化法超低
温保存的种子的 DNA 甲基化变化明显小于直接超低
温保存的种子 (即不经玻璃化溶液处理) ,这是由于玻
璃化溶液的保护作用还是其他方面的原因还需要深入
探讨 ,另外保存后材料的后代能否将这些甲基化变化
在其子代中通过有性遗传传递下去以及子代的表型如
何 ,都有待进一步研究。
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