全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032380205
糯玉米离体培养获取耐盐变异体
陆瑞菊1 ,2 ,3 　何　婷1 ,2 　王亦菲1 ,2 　陈志伟1 ,2 　杜志钊1 ,2
张燕敏1 ,2 　黄剑华1 ,2 　陈佩度3 　沈雪芳4 　王义发4
(1. 上海市农业科学研究院生物技术研究所 ,上海　201106 ; 2. 上海市农业遗传育种重点实验室 ,上海　201106 ;
3. 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 ,江苏 南京　210095 ;4. 上海市农业科学研究院作物育种栽培研究所 ,上海　201106)
摘 　要 :为获取糯玉米耐盐变异体 ,以 120mgΠL 的平阳霉素预处理糯玉米自交系 (S1、S2)种子 20h ,萌发后
用茎尖诱导胚性愈伤组织 ,比较了激素组合对胚性愈伤组织诱导、继代和分化的影响。结果表明 ,
2 , 42D 210mgΠL 和 62BA 0125mgΠL 组合诱导胚性愈伤的效果最好 ;在添加 100mgΠL CH、62BA 0125mgΠL 和
2 , 42D 210mgΠL 的继代培养基上愈伤组织生长良好。将胚性愈伤组织依次在含 10、15 和 20gΠL NaCl 培
养基中进行筛选 ,获得耐盐变异体 ,转入分化培养基中诱导再生植株 ,自交 1 代种子在含 15 和 20gΠL
NaCl 的培养基上萌发率较对照种子高数倍 ,在 20gΠL NaCl 的胁迫下 ,变异体自交 1 代种子幼苗叶片中脯
氨酸含量及 K+ ΠNa + 比例明显高于对照。
关键词 :糯玉米 ;平阳霉素 ;离体培养 ;胚性愈伤组织 ;耐盐 ;变异体
SELECTION OF SALT2TOLERANT VARIANTS THROUGH
CULTURE OF WAXY MAIZE in vitro
LU Rui2ju1 ,2 ,3 　HE Ting1 ,2 　WANG Yi2fei1 ,2 　CHEN Zhi2wei1 ,2 　DU Zhi2zhao1 ,2
ZHANG Yan2min1 ,2 　HUANGJian2hua1 ,2 　CHEN Pei2du3 　SHEN Xue2fang4 　WANG Yi2fa4
(1. Biotech Research Institute , Shanghai Academy of Agricultural Sciences , Shanghai 　201106 ;
2. Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding , Shanghai 　201106 ;
3. National Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement , Nanjing Agricultural University , Nanjing , Jiangsu 　210095 ;
4. Crop Breeding and Cultivation Research Institute , Shanghai Academy of Agricultural Sciences , Shanghai 　201106)
Abstract : For selecting salt2tolerant variants , seeds from two waxy maize inbred lines ( S1 and S2 , respectively) were
pretreated by 120mgΠL pingyangmycin for 20h , then germinated , and the shoot apical meristem was induced to embryogenic
calli. The effects of different hormone combinations on embryogenic callus induction , subculture and differentiation were
investigated in shoot2tip culture. Results showed that the combination of 2. 0mgΠL 2 ,42D and 0125mgΠL 62BA was the best for
embryogenic callus induction , the calli grew well in subculture medium adding 100mgΠL CH , 0125mgΠL 62BA and 2mgΠL 2 ,
42D1 Variants with salt tolerance were screened by medium of different concentrations of NaCl (10gΠL , 15gΠL and 20gΠL ,
respectively) , then regenerated. We found that the inbred seeds from the variants had higher germination rates compared to the
control under 15gΠL and 20gΠL NaCl , respectively. And the contents of proline and K+ ΠNa + values of seedlings of inbred were
also higher than control under 20gΠL NaCl.
Key words :waxy maize ; pingyangmycine ; in vitro culture ; embryogenic calli ; salt tolerance ; variants
收稿日期 :2008210220 　接受日期 :2009201216
基金项目 :上海市科委重大项目 (06DZ19101)
作者简介 :陆瑞菊 (19622) ,女 ,上海人 ,硕士 ,研究员 ,主要从事作物组织Π小孢子培养研究。Tel :02126220866023201 ; E2mail : cs7 @saas. sh. cn
通讯作者 :黄剑华 (19532) ,男 ,上海人 ,博士 ,研究员 ,从事生物技术育种研究。Tel :021262201032 ; E2mail : sw1 @saas. sh. cn
083　 核 农 学 报　2009 ,23 (3) :380～384Journal of Nuclear Agricultural Sciences
　　茎尖组织培养是植物组织培养的常规技术 ,已被
广泛应用[1 ,2 ] 。作为重要的经济作物 ,玉米的遗传转化
工作一直备受重视 ,因而其再生体系的建立是个研究
热点 ,很多研究者以玉米茎尖分生组织为材料进行了
诱导愈伤组织的研究[3～6 ] 。土壤盐渍化是限制农林业
生产的世界性问题 ,在农业占地越来越少的情况下 ,人
们开始日益重视盐碱荒地的利用[7 ,8 ] 。根据植物耐盐
的差异性和遗传性 ,选育耐盐品种可以较好地解决盐
渍土地的利用问题[9 ,10 ] 。植物细胞工程中 ,特别是植
物离体培养过程中存在广泛的体细胞变异[11～13 ] ,充分
利用该变异有可能培育出耐盐突变体[14～17 ] 。1972 年 ,
Melcher[18 ]首次专门讨论了植物组织培养技术用于筛
选耐盐突变体的优越性 ,紧接着 Zenk[19 ] 又利用该技术
获得耐盐细胞系。随后人们对离体培养筛选耐盐突变
体的研究逐年增加 ,研究种类已近 40 种[20 ] 。诱变育
种是近 40 年来兴起的一门现代育种技术 ,它的迅速发
展对离体筛选耐盐突变体产生了重大影响。研究表
明 ,离体培养与诱变育种技术结合 ,能大大丰富突变类
型 ,提高突变频率和育种效率[21 ] 。
本试验用平阳霉素浸泡糯玉米种子发芽后 ,以茎
尖为外植体诱导胚性愈伤组织 ,经耐盐筛选后获得再
生植株 ,旨在获取糯玉米耐盐变异体 ,为利用细胞工程
技术改良玉米种质奠定了基础。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　供试材料
以糯玉米自交系 S1、S2 的成熟种子为供试材料。
112 　培养基
发芽培养基为不含任何激素的 MS 培养基 ;诱导
培养基以 2Π3MS 为基本培养基 ,添加 100mgΠL CH、62BA
0mgΠL、0125mgΠL、015mgΠL 和 2 , 42D 110mgΠL、115mgΠL、
210mgΠL ;继代培养基以 2Π3MS 为基本培养基 ,添加水
解酪蛋白 (CH) 100mgΠL、62BA 0125mgΠL、2 , 42D 2mgΠL。
筛选培养基为分别添加 10gΠL、15gΠL 和 20gΠL NaCl 的
继代培养基 ;分化培养基以 2Π3MS 为基本培养基 ,添加
1000mgΠL CH、62BA 210mgΠL 和 IBA 014mgΠL。生根培
养基以 1Π2MS 为基本培养基 ,添加 IBA 018mgΠL。所有
培养基均添加 6gΠL 琼脂粉和 30gΠL 蔗糖 , pH518 ,
121 ℃、20min 高温高压灭菌。
113 　方法
选取糯玉米自交系 S1、S2 成熟饱满的种子 ,012 %
HgCl2 消毒 10min ,无菌水冲洗 5～ 6 次 , 用浓度为
120mgΠL 的平阳霉素作为预处理液 ,以无菌水处理作
为对照 ,22 ℃浸泡 20h。预处理结束后用无菌水冲洗 ,
接种至发芽培养基 , 27 ℃±1 ℃发芽。胚芽伸长至 3～
5cm时 ,剥离胚芽鞘及 2～3 片幼叶 ,切取长约 2mm 的
茎尖 ,接种到愈伤诱导培养基中 ,将外植体置于 25 ℃
±1 ℃下进行愈伤组织诱导。出愈后 ,愈伤组织 2～3
周继代1 次。
选择长势良好的胚性愈伤组织 ,称量接种到含
NaCl 的筛选培养基上 ,每处理 4 次重复 ,对照培养基
每个重复称量 5g 左右 ,筛选培养基每个重复称量 12g
左右。在含不同浓度 NaCl 的培养基上对玉米愈伤组
织进行筛选 ,分 3 个筛选梯度 ,分别为 10、15 和20gΠL。
每次继代时间为 20d ,共继代 3 次 ,通过 3 次逐步提高
盐浓度的继代 ,耐盐的愈伤组织存活下来 ,并可能产生
突变 ,而不耐盐的愈伤组织死亡淘汰。
将经过筛选的耐盐愈伤组织 ,在 MS 分化培养基
上进行分化 ,分化出具有抗盐性的变异体植株。分化
出苗后 ,转移到生根培养基上培养 28d ,炼苗 3～5d 转
入盆栽 ,待小苗长至 4～5 片叶 ,植株比较健壮且外界
气温较适宜时 ,带土移栽大田中。套袋自交结实后收
获种子。将自交 1 代种子与原自交系种子在含 NaCl
(0、10、15 和 20gΠL) 的发芽培养基上比较发芽率。另
取自交 1 代种子与原自交系种子播入培养基质 (蛭石∶
珍珠岩 = 1∶1)中以清水浇灌 ,苗龄 12d 后以 NaCl 溶液
(20gΠL)浇灌 ,以清水浇灌作对照 ,观察幼苗受盐害情
况 ,并于 NaCl 溶液 (20gΠL) 浇灌 6d 后以印三酮[22 ] 法测
定幼苗叶片中脯氨酸含量 ,按照 GBΠT5009191 标准测
定叶片中 Na + 和 K+ 的含量比例。
2 　结果与分析
211 　胚性愈伤组织的诱导
在本试验中 2 个自交系 S1 和 S2 的发芽率都比较
低 ,S1 为 48 % ,S2 为 50 % ,经过 120mgΠL 平阳霉素浸种
后 2 个材料的发芽率均为 49 %。表明 120mgΠL 平阳霉
素 22 ℃浸泡 20h 对供试材料的发芽率没有明显影响。
从无菌苗剥取的茎尖接种至诱导培养基上 2～3d
后 ,多数茎尖开始膨大 ,部分茎尖伸长 ,还有一些茎尖
产生愈伤组织。随着愈伤组织的不断产生 ,茎尖及其
周围部分体积增加 ,上胚轴则没有明显的愈伤组织形
成。在愈伤诱导培养初期 ,茎尖生长点周围的部分叶
原基会长成幼叶 ,需及时剥去 ,否则将抑制愈伤组织生
长。诱导产生的愈伤组织呈黄色或黄白色 ,表面光滑 ,
比较坚硬 ,继代 1～2 次后会形成淡黄色、结构松散的
183　3 期 糯玉米离体培养获取耐盐变异体
颗粒状愈伤组织。
212 　诱导培养基中 62BA 和 2 , 42D 浓度对愈伤组织诱
导的影响
诱导培养基中添加适量的 62BA 有利于玉米茎尖
愈伤组织的诱导 ,不仅能提高愈伤组织的产量 ,更能提
高愈伤组织的质量。从图 12A 可以看出 ,在不添加 62
BA 的诱导培养基上 ,S1 和 S2 的出愈率分别为 4516 %
和 3819 % ;在添加 62BA 0125mgΠL 的诱导培养基上 ,S1
和 S2 愈伤诱导率迅速提高到 8313 %和 7819 % ,较不添
加 62BA 的提高了 0183 倍和 1103 倍 ;将 62BA 浓度提高 至 015mgΠL , S1 和 S2 的愈伤诱导率分别为 6516 %和7414 % ,与 62BA 0125mgΠL 相比 ,愈伤组织产量反而有所下降。在培养基中添加 2 ,42D ,从图 12B 可以看出 ,随着 2 , 42D 浓度的增加 ,愈伤组织的诱导率也随之上升 ,当 2 , 42D 浓度从 1mgΠL 上升至 2mgΠL 时 ,S1 的愈伤诱导率从 5313 %上升至 7111 % ,S2 的愈伤诱导率从5111 %上升至 7212 % ,上升幅度都比较大。因而诱导培养基中 62BA 的浓度要根据供试材料的不同而有所选择 ,2 , 42D 对于玉米茎尖愈伤的诱导是必需的 ,所需浓度同样因供试材料不同而有差异。
图 1 　62BA 和 2 , 42D 浓度对胚性愈伤组织诱导率的影响
Fig. 1 　Effects of 62BA and 2 , 42D concentration on percentage of callus induction
213 　诱导培养基中不同浓度激素组合对茎尖愈伤组
织诱导的影响
从表 1 可以看出 ,茎尖具有较强的出愈能力 ,愈伤
组织诱导率受诱导培养基中激素浓度及比例的影响较
大。对 S1 而言 , 2 , 42D 115mgΠL 或 210mgΠL 和 62BA
0125mgΠL 组合诱导效果最好 ,诱导率达 9010 % ;而在
2 , 42D 为 115mgΠL 的培养基上诱导率只有 4617 % ,两
者相差近一倍 ;2 , 42D 115mgΠL 和 62BA 015mgΠL 组合
的愈伤诱导率为 7313 % ; 2 , 42D 210mgΠL 和 62BA
015mgΠL 组合的愈伤诱导率则为 6313 %。S2 的结果与
S1 有些相似 ,2 , 42D 210mgΠL 和 62BA 0125mgΠL 组合诱
导效果最好 ,诱导率达 8617 % ;在培养基中只有 2 , 42D
210mgΠL 时诱导率只有 5010 %。表明在一定浓度范围
内 ,合适的 2 , 42D 和 62BA 比例是影响玉米茎尖愈伤
组织诱导的重要因素 ,激素之间存在相互协调作用。
214 　耐盐愈伤组织变异体的筛选
挑选颜色淡黄、质地较硬、具有分化能力的胚性愈
伤组织接种到继代培养基上 ,继代 1～2 次后即可诱导
出结构松散、颗粒状的胚性愈伤组织 ,将这些愈伤组织
转入含盐的筛选培养基中 ,筛选耐盐变异体。
从表 2 可以看出 ,随着继代培养基中盐浓度的增
加 ,继代时间的延长 ,愈伤组织的生长速度明显减慢 ,
表 1 　诱导培养基中激素浓度对茎尖愈伤组织诱导的影响
Table 1 　Effects of different hormone combinations
on callus induction
62BA
(mgΠL) 2 , 42D(mgΠL) 接种外殖体数No. of explants 出愈外殖体数No. of explantsproducing callus 诱导率percentage ofcallus( %)
S1 S2 S1 S2
110 30 9 7 3010 2313
0 115 30 14 13 4617 4313
210 30 18 15 6010 5010
110 30 21 20 7010 6617
0125 115 30 27 25 9010 8313
210 30 27 26 9010 8617
110 30 18 19 6010 6313
015 115 30 22 24 7313 8010
210 30 19 24 6313 8010
增殖倍数下降明显 ,愈伤组织的质量也有所下降 ,并有
一大部分受伤致死的愈伤组织 ,但部分存活下来的愈
伤组织的质量、颜色仍然很好 ,为乳白色、坚硬的胚性
愈伤组织 ,而且从原愈伤组织上能分生出许多新的愈
伤组织颗粒 ,这些组织经过长时间的继代 ,经过高达
20gΠL NaCl 培养基的筛选 ,即得到了突变的抗盐愈伤
组织。
试验中观察到 ,在连续的愈伤组织筛选培养中 ,存
283 核　农　学　报 23 卷
　　　 表 2 　愈伤组织在筛选培养基上的生长量及增殖倍数
Table 2 　The proliferation multiples and the growth of callus on selection mediums
材料
materials
统计项目
statistical item
第一次筛选
first selection
第二次筛选
second selection
第三次筛选
third selection
CK1 10gΠL NaCl CK2 15gΠL NaCl CK3 20gΠL NaCl
愈伤组织质量
callus weight (g) 4198 12 5143 5169 5121 2158
S1
20d 后质量
callus weight after 20 days growing(g) 8165 5169 10158 2158 10138 1114
增殖倍数
proliferation multiples
1174 ±0. 48A 0147 ±0. 18B 1195 ±0. 75A 0145 ±0. 13B 1199 ±0. 89A 0144 ±0. 09B
愈伤组织质量
callus weight (g) 4183 12161 4158 6188 5158 3156
S2
20d 后质量
callus weight after 20 days growing(g) 715 6188 7138 3156 11102 1171
增殖倍数
proliferation multiples
1155 ±0. 95A 0155 ±0. 20B 1161 ±0. 67A 0152 ±0. 16B 1198 ±0. 84A 0148 ±0. 20B
注 :不同字母表示 0101 水平差异显著。
Note : Data with different letters showed significant difference at P = 0101 level .
活的愈伤组织由原愈伤组织一个或几个区域产生。继
代培养过程中挑选长势好的愈伤组织再进行培养 ,逐
步淘汰耐盐性差的细胞。细胞学观察表明 ,玉米胚性
愈伤组织转入高浓度 NaCl 培养基上筛选后 ,大多数细
胞进入坏死状态 ,只有少数细胞持续增殖 ,产生耐盐愈
伤组织。耐盐愈伤组织在筛选培养基上生长时 ,形态
结构与对照细胞有明显差异 ,对照愈伤组织的生长速
率下降 ,一开始愈伤组织周围出现粘液 ,最后整块愈伤
组织变粘死亡 ,而耐盐愈伤组织仍然生长。筛选时 ,即
使在低浓度的 NaCl 培养基中 ,愈伤组织的存活率也较
低 ,随着筛选时间的延长 ,愈伤组织有了一定的耐盐
性 ,即使 NaCl 浓度升高 ,愈伤组织存活率下降也不
明显。
215 　耐盐愈伤组织的分化
采用逐步提高 NaCl 浓度的方法 ,即在含 10gΠL
NaCl 培养基上培养 2 次的愈伤组织 ,移入含 15gΠL
NaCl 培养基上选择培养 2 代 ,再从中选择部分生长良
好的愈伤组织移入含 20gΠL NaCl 培养基中选择培养 2
代。筛选结束后 ,将愈伤组织转移至不含盐的分化培
养基上诱导再生植株。用这种方法 ,分别获得了耐
20gΠL NaCl 的愈伤组织及其再生植株。胚性愈伤组织
接入分化培养基 5～7d 后开始发绿 ,很快就分化出绿
色芽点 , 15d 左右就有植株形成。筛选后 S1 得到
71169g 胚性愈伤组织 ,分化后得到 25 株绿苗 ,产量为
3149 株Πg ;S2 筛选后得到 61069g 的愈伤组织 ,分化后
获得 19 株绿苗 ,产量为 3112 株Πg。
216 　再生植株自交 1 代种子的耐盐性鉴定
比较再生植株自交 1 代种子在不同盐胁迫下的发
芽率 ,2 种材料的对照和耐盐变异体再生植株后代种
子在无盐胁迫时发芽率相同 ,随着盐浓度的增加 ,发芽
率下降 ,但对照发芽率下降幅度大于耐盐变异体后代
种子。当培养基中盐浓度 10gΠL 时 ,对照的发芽率已
降至大约 20 % ,而耐盐变异体种子的发芽率仍高于
80 % ;当培养基中盐浓度增至 15gΠL 时 ,对照仅有极少
数种子发芽 ,而耐盐变异体种子发芽率仍保持在 20 %
以上 ,甚至在 20gΠL 的 NaCl 胁迫下仍有一定数量的种
子可以发芽 ,这与愈伤组织水平及再生植株水平的耐
性是一致的。玉米种子对盐极其敏感 ,由此可以认为
得到的是耐盐变异体种子 ,但这种耐盐性的遗传稳定
性还需作多代的田间鉴定。
表 3 　自交 1 代种子在盐胁迫培养基上的发芽率
Table 3 　The percentage of the germination of
the inbred seeds on the stress medium ( %)
材料
materials
培养基中 NaCl 浓度
the concentrations of NaCl in stress medium(gΠL)
0 10 15 20
S1 CK 80 20 5 1
S1 R 82 80 21 10
S2 CK 81 21 6 1
S2 R 80 80 20 9
注 :R2耐盐变异体。下表同。
Note :R2 salt2tolerant variants. The same as following table.
217 　变异体自交 1 代种子幼苗期耐盐生理指标的
检测
盐胁迫对玉米幼苗的生长影响很大 ,在 20gΠL 的
NaCl 胁迫下 ,形态上表现为叶片狭窄、基部黄叶多、叶
色黄绿、叶梢呈紫红色 , 随着时间的延长叶片失水萎
383　3 期 糯玉米离体培养获取耐盐变异体
蔫进而卷曲枯萎。与耐盐变异体相比 ,对照的盐害症
状更为明显 ,植株生长更为瘦弱。而以清水灌溉的植
株则生长正常。从表 4 可以看出 ,2 个变异体再生植
株自交 1 代种子幼苗叶片中的脯氨酸含量较接近 ,较
它们的对照 S1 种子幼苗的含量有明显提高。变异体体
内积聚较多的脯氨酸可缓解 NaCl 的胁迫作用 ,从而提
高植株的耐盐性。同时 ,在 NaCl 的胁迫下 ,变异体叶片
中 K+ 的含量均高于对照 ,而 Na + 的含量均低于对照 ,即
在相同胁迫条件下 ,变异体幼苗叶片的 K+ ΠNa + 均明显
高于对照 ,说明变异体材料通过降低细胞膜对离子的透
性 ,减少 K+ 的流失 ,降低 Na + 的进入 ,保持相对稳定的
K+ ΠNa + 比例 ,从而提高对 NaCl 胁迫的耐受性。
表 4 　NaCl 胁迫对种子幼苗期叶片中脯氨酸
及 K+ ΠNa + 含量的影响
Table 4 　Effects of NaCl stress on contents of proline
and K+ ΠNa + in leaf of inbred seedlings
材料
materials
脯氨酸含量 (mgΠg·FW)
content of proline
K+
(mgΠg·FW) Na +(mgΠg·FW) K+ ΠNa +(mgΠg·FW)
S1 CK 0109 5156 1198 2181
S1 R 0121 6146 1135 4178
S2 CK 0112 6163 1176 3177
S2 R 0122 7164 1153 5107
3 　结论
以茎尖为外植体诱导胚性愈伤组织 ,经耐盐筛选
后获得再生植株 ,其自交 1 代种子在含盐培养基上的
发芽率明显高于对照 ,在 20gΠL NaCl 的胁迫下 ,自交 1
代种子幼苗叶片中脯氨酸含量及 K+ ΠNa + 比例也明显
高于对照。表明本试验建立的糯玉米离体培养获取耐
盐变异体的技术程序是可行的 ,可以获得耐盐性提高
的再生植株。
相比以成熟胚为外植体诱导的愈伤组织 ,茎尖的
愈伤组织质量明显较好[23 ,24 ] 。茎尖可诱导出结构松
散、颗粒状并可长期继代的愈伤组织。利用玉米茎尖
培养再生植株 ,具有不受季节限制、取材方便、植株再
生所需时间短、植株再生率高等优点。但和成熟胚、幼
胚相比存在一些不足 ,比如操作难度大 ,接种时要找准
芽尖部位 ,诱导培养初期还应及时去除生长点周围叶
原基长出的幼叶 ,且不损伤生长点。在玉米的组织培
养中关键仍在优良的基因型及合适的激素种类与浓度
的配比基础上 ,选用合适外植体 ,保障愈伤组织质量 ,
从而获得高再生率[25 ,26 ] 。糯玉米茎尖再生培养实验体
系的初步建立 ,为利用细胞工程技术改良玉米种质奠
定了基础 ,并可进一步推动玉米的遗传改良研究。
植物体在离体培养条件下可产生无性系变异 ,加
入诱变剂后离体培养的变异率可明显提高[11 ,12 ] 。本试
验中耐盐变异体分化植株的自交 1 代种子在 15～
20gΠL盐浓度培养基中的发芽率均高于对照 ,自交 1 代
种子幼苗叶片中脯氨酸含量及 K+ ΠNa + 比例较对照也
明显提高 ,表现了对盐有较强的耐受能力 ,说明具有一
定的抗盐稳定性。
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培养条件下 182599 自交系生根率较低 ,而 416051 则分
化率稍低 ,不利于转基因苗的获得 ,为了在以后的转基
因研究中能更好地利用这两个自交系 ,需要分别对其
生根和分化培养基进一步探索 ,以期提高外源基因的
转化效率。
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