全 文 ：辐射与花药培养相结合筛选
烟草抗黄瓜花叶病毒病突变体
王万军　王文芳　曹建军　白守信
(陕西省中国科学院西北植物研究所　杨陵　712100)
用60Coγ射线辐射处理小孢子处于单核靠边期的烟草 K326、NC89、8611 花蕾并
进行花药培养 ,获得的单倍体植株移栽成活后接种黄瓜花叶病毒病 (CMV) 汁液。结
果表明 ,NC89、8611 单倍体植株的抗病性变异与60 Coγ射线辐射剂量之间存在一定
范围的定向性 ,剂量 ≥4krad 时 ,植株叶片变异与 CMV 症状相似 ,不利于选择 ;剂量
< 2krad 时 ,植株的抗病性与对照之间没有差异 ;剂量 = 2krad 时 ,植株的抗病性与对
照之间的差异可达到显著水平 ,并在 2krad 处理的 NC89、8611 单倍体植株群体中筛
选到了抗 CMV 突变体。
关键词 :烟草 　60Coγ射线 　花药培养 　抗 CMV 变体
此文于 1998 年 3 月 12 日收到
本研究得到陕西省自然科学基金及陕西省科学院培养优秀青年人才计划资助
利用已知抗源进行抗病育种 ,在各种作物上都取得了成功。但对于尚未发现抗源的病害 ,
利用基因工程技术可获得作物对病害的抗性[5 ,6 ] ,然而这一方法除了安全因素外 ,需要有较大
的投入 ,获得的抗病转基因植株能否作为抗源使用尚未进行过试验。突变育种可以创造新的
抗病基因 ,尤其是应用诱变与生物技术相结合 ,并在选择剂的作用下 ,已在多种作物上选育出
了抗病突变体品种或品系[3 ,4 ,7 ] 。
黄瓜花叶病毒病 (CMV)是一种非常严重的病毒病害 ,能侵染烟草、蕃茄等许多种植物 ,在
烟草属中迄今尚未发现抗病种质 ,同时也无合适的选择剂用以快速筛选抗病突变体 ,故至今还
未育成能在生产上使用的抗病品种。我们试图用不同的诱变剂量诱发变异植株的抗病性 ,增
强诱变的定向性 ,同时在筛选过程中引入优选法来提高突变体的选择效率。本文报道用诱变
与生物技术相结合筛选烟草抗 CMV 突变体的结果。
1 　材料与方法
111 　材料
K326、NC89、8611 烟草花蕾系采自本所试验地 ;60 Coγ射线辐照处理在中国科学院西北
水土保持研究所同位素室进行 ;CMV 毒源由西北农业大学植保系病毒室提供 ,寄主为心叶烟。
112 　方法
11211 　60Coγ射线辐射花蕾 　从 K326、NC89、8611 无病植株上采取花冠与花等长的花蕾 (经
镱检 ,此时花药里的多数小孢子处于单核靠边期 ,适于花药培养) ,在 4 ℃下预处理 48h ,再分别
用 0、110krad、210krad、410krad、810krad 60Coγ射线辐照花蕾 ,剂量率为 :9717rad/ min。
57　核 农 学 报　1999 ,13 (2) :75～80Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
11212 　花药培养 　(1)诱导培养基 ( H) :Nitsch H + 013mg/ L IAA + 300mg/ L CA + 3 %蔗糖 +
1 %活性炭 + 016 %琼脂 ; (2) 壮苗培养基 (MRO) :1/ 2 MS 大量元素 + MS 微量元素 + MS 铁盐
+ N6 有机物质 + 50mg/ L KH2 PO4 + 1mg/ L IAA + 3 %蔗糖 + 016 %琼脂 ; H、MRO 均用 1N
KOH 调 p H 至 518。经γ射线辐照处理后的花蕾 ,灭菌后取花药接种于 H 培养基上 ,放在
28 ℃、12h/ d 光照的培养室中培养 ,15d 后花药陆续裂开 ,在裂开的花药里出现密集的黄白胚状
体 ,以后逐渐变绿 ,25d 后长成密集的有 2 片子叶的小植株 ,然后将这些小植株转接于 MRO 培
养基中进行壮苗培养 ,待幼苗长到有 5～6 片真叶时 ,移栽到温室中 ,覆盖塑料薄膜 ,8～10d 后
95 %以上试管苗移栽成活 ,揭开塑料薄膜。
11213 　CMV 接种及其症状 　称取一定量的 CMV 毒叶 ,加适量石英砂一起研磨后用磷酸缓
冲液 (p H710)稀释制成 CMV 汁液 ,在幼苗新叶上进行摩擦接种 ,稍后用蒸馏水冲洗接种叶片。
然后定期观察统计植株的发病情况。在调查统计过程中 ,将 CMV 的症状表现分为 5 级 ,分别
为 : (0)全株无病 ; (1)心叶明脉或轻微花叶 ; (2) 1/ 2 的叶片花叶 ,少数病叶变型 ; (3) 2/ 3 的叶片
花叶 ,叶片狭长 ,叶缘上卷 ,叶尖细长 ,叶面革质无光泽 ,较健株矮 1/ 2 左右 ; (4)全株叶片花叶 ,
叶片呈蕨叶 ,植株严重矮化 ,坏死。
2 　结果与分析
211 　60Coγ射线对烟草花药出苗的影响
花药培养 50d 时 ,各处理的烟草花药出苗已经稳定 ,这时统计各处理花药的出苗情况 ,并
按下式计算烟草花药的相对出苗率。
花药相对出苗百分率 ( %) = 某剂量处理的烟草花药出苗率未照射处理的烟草花药出苗率 ×100
结果如表 1 所示。
表 1 　60Coγ射线对烟草花药相对出苗百分率的影响
Table 1 　The effect of 60Coγ ray on the relative percentage of anther germination of tabacco
品　种
Sepecies
60Coγ射线剂量　Dose of 60Coγ ray (krad)
0 015 110 210 410 810
K326 100 89158 59103 17136 0 0
NC89 100 101138 80169 69166 23145 2107
8611 100 102105 86130 69186 31150 0
从表 1 看出 ,各品种花药相对出苗率的半致死剂量分别为 : K326 = 1125krad , NC89 =
2175krad ,8611 = 311krad。由此可以看出 : (1) 60Coγ射线对不同基因型烟草品种的花药出苗
率的抑制程度不同 ,其抑制程度按由强到弱的顺序为 : K326、NC89、8611 ; (2) 花药对不同剂量
的60Coγ射线辐照有不同的反应 ,低剂量的辐照对一些品种的花药出苗在一定程度上有促进
作用 ,而高剂量的辐照可完全抑制所有品种花药的出苗。在整个试验的剂量范围内 ,射线对花
药出苗力的抑制程度随着60Coγ射线剂量的增加而增强。
212 　60Coγ射线对烟草花药单倍体植株的抗病力的影响
21211 　60Coγ射线辐照剂量 ≥410krad 　花药出苗受到很大抑制 , K326 烟草品种的花药受到
完全抑制 ,无诱变单倍体植株 ,NC89、8611 烟草品种的花药也受到很大抑制 ,诱变单倍体植株
67 核　农　学　报 13 卷
群体很小且有一些其他的性状变异。CMV 接种后 ,有两种情况 ,一是一部分植株的症状的严
重度与对照无差异 ,在 8611 中甚至还有一些植株的症状的发展速度快于对照 ;二是一部分植
株的叶片变异与 CMV 症状相似 ,在病症调查中不易快速区分。因此我们认为 ,高剂量的60 Co
γ辐射不适于用以诱变筛选烟草抗病突变体。
21212 　60Coγ辐照剂量 < 410krad 　对不同的基因型品种有不同的影响效果 ,对 K326 ,当
60Coγ射线剂量 ≥210krad 时 ,单倍体植株接种 CMV 后的症状表现与 NC89、8611 在60 Coγ射
线剂量 ≥4krad 时的情况相似。其余单倍体植株接种 CMV 后的情况如表 2 所示。
表 2 　单倍体植株幼苗接种 CMV4 周后的病症情况
Table 2 　The symptom of haploid plants inoculated with CMV for 4 weeks
品种
Species
辐射剂量
Dose of
irradiation
(krad)
接种株数
No. of plants
inoculated
with CMV
各病级株数
No. of plants in each
disease grade
0 1 2 3 4
病情指数
Disease index
( %)
差异检验
Test of
difference
K326
NC89
8611
0 140 0 4 31 58 47 76143
015 122 0 4 29 53 36 74180 -
110 84 0 1 18 37 28 77138 -
0 141 0 8 50 61 22 67120
015 144 0 6 54 63 21 67119 -
110 113 0 6 48 58 1 61195 -
210 99 2 42 48 7 0 40115 + + +
0 146 0 35 73 29 9 52105
015 144 0 41 70 31 2 48196 -
110 125 0 31 65 28 1 49180 -
210 101 5 48 37 11 0 38137 + +
　　注 :11 病情指数 = ∑4i = 0i ×i 级植株数总株数×4 ; 21 - :表示与对照无差异 ; 31 + + 、+ + + :分别表示达到 a = 0105 及 a = 0101 的显
著水平 ;
Note :11Disease index = ∑4i = 0i ×No. of plants in grade iNo. of plants in all ×4 ;21 - :No difference compared with CK;31 + + 、+ + + : Significantly
different at a = 0105 and a = 0101 levels , respectively
从表 2 看出 ,低剂量的60 Coγ辐射诱导出的单倍体植株在接种 CMV 后 ,其症状表现与对
照无明显差异 ,而当60Coγ辐照剂量 = 210krad 时 ,在 NC89、8611 花药中诱导出的单倍体植株
在接种 CMV 后的症状表现与对照之间存在明显差异 ,且其症状比对照轻。
213 　烟草抗 CMV突变体植株的筛选
根据前面的试验结果 ,用 210krad 的60Coγ辐照烟草品种 NC89、8611 的花蕾并诱导单倍
体植株 ,移栽成活后接种 CMV ,然后筛选抗 CMV 突变体 ,其筛选群体分别为 :NC89 :对照 147
株 ,辐射诱变 207 株 ;8611 :对照 100 株 ,辐射诱变 125 株。当植株的 CMV 症状达到 2 级时开
始筛选 ,定期 (苗期为 1 周 ,大田期为 20d)在各群体中淘汰 3812 %的症状严重的植株 ,最后在
77　2 期 辐射与花药培养相结合筛选烟草抗黄瓜花叶病毒病突变体
各群体剩余植株症状都保持稳定后停止筛选 ,这时如果诱变群体的剩余植株的病症级别比对
照群体的剩余植株的病症级别小且存在病症级别 < 2 ,则可以认为选择到了抗病突变体。经过
3 个多月的多次分级淘汰 ,最后获得了 3 株抗 CMV 的突变体植株 ,其中 NC89 2 株 (图版 Ⅰ22 ,
3) ,8611 1 株 (图版 Ⅰ25) ,用 012 %秋水仙碱加倍 ,开花时套袋让其自交 ,最后收获种子供进一
步试验。
图版 Ⅰ
1 —5 :都经 CMV 汁液摩擦接种 ;1、2、3 :NC89 单倍体植株 ;4、5 :8611 单倍体植株 ;1、4 :对照植株 ;2、3、
5 :经 2krad 60Coγ射线处理后的抗 CMV 的花药单倍植株。
Plate Ⅰ
1～5 :All plants were inoculated with CMV fluid through rub ; 1 ,2 ,3 : Haploid plants of NC89 ;4 ,5 : Haploid
plants of 8611 ;1 ,4 :Control ;2 ,3 ,5 : Haploid CMV —resistant plants from anthers treated with 2krad 60Coγ2ray.
3 　讨 　论
60Coγ射线对烟草花药出苗率的影响 ,结果与前人[2 ]相同 ,低剂量时对花药出苗有促进作
用 ,而高剂量时又对其有明显的抑制 ;同时这种影响还与基因型有关 ,基因型不同 ,半致死剂量
也有较大差异。
87 核　农　学　报 13 卷
花药培养与辐射诱变结合有利于选择烟草抗 CMV 突变体 ,作者曾用60 Coγ射线、EMS、
NaN3 处理过烟草的种子、茎尖、叶片、腋芽 ,然后结合细胞培养选择抗 CMV 突变体 ,均未能成
功。在诱变剂量的选择上 ,作者认为不宜大于半致死剂量 ,因为诱变本身就具有变异方向不定
及不可预见的特点 ,加大剂量虽然可提高突变率 ,然而变异范围必然增加 ,存活率亦将急剧下
降 ,相对降低了所需变异 ,同时这些变异可能会干扰对所需性状的选择。本试验用 410krad 和
810 krad 60Coγ射线处理花药后获得的一些单倍体植株的叶片变异与 CMV 症状完全相似 ,这
给突变体的早期选择增加了困难。
定向诱变可快速选择突变体 ,有人对此定向作过定义 ,一种是通过诱变处理出现某种需要
的特异变异性状 ,另一种是指提高某些变异性状在总变异中的相对频率[1 ] 。根据诱发突变的
特点 ,作者认为第一种定义不可能 ,而第二种定义在一定条件下是可以做到的。我们用
210krad 60Coγ射线处理烟草品种 NC89、8611 的花蕾 ,经花药培养获得的单倍体植株的抗病
性比对照轻且其差异分别达到了α= 0101 和α= 0105 的显著水平 ,而植株的其他性状没有明
显变化 ,从而在这两个基因型品种的单倍体植株的抗病性与60 Coγ射线的诱变剂量之间建立
了一种相关性 ,最终为突变体的成功选择奠定了基础。
参 　考 　文 　献
1 　许耀奎 ,等 1 作物诱变育种 1 上海 :上海科学技术出版社 ,1985 :41～43
2 　佟道儒 ,等 1γ射线诱变烟草花药培养的突变体 1 核农学报 ,1991 ,5 (4) :193～198
3 　周嘉平 ,等 1 烟草抗黑胫病突变体的细胞筛选 1 遗传学报 ,1990 ,17 (3) :180～188
4 　陈晖 ,等 1 甘蔗抗羟脯氨酸细胞变异系筛选及其特性的研究 1 植物学报 ,1991 ,33 (10) :738～743
5 　叶寅 ,等 1 表达卫星 RNA 和外壳蛋白的高抗 CMV 的转基因植株 1 科学通报 ,1991 ,36 (22) :1759～1769
6 　David C Baucombe , et al. Expression of biological active viral satellite RNA from the nuclear genome of transformed plants.
Nature , 1986 , (321) :446～449
7 　Wakasa K , et al. A 5 - methyltryptophan resistant rice mutant , MTR1. selected in tissue culture. Theor Appl Genet , 1987 ,
74 :49～54
97　2 期 辐射与花药培养相结合筛选烟草抗黄瓜花叶病毒病突变体
CUCUMBER MOSAIC VIRUS RESISTANT MUTANT FROM
TOBACCO’S ANTHERS TREATED WITHγ RAY
THROUGH ANTHER CULTURE
Wang Wanjun 　Wang Wenfang 　Cao Jianjun 　Bai Shouxin
( North Western Instit ute of Botany , Chinese Academy of Sciences , Yangli ng 　712100)
ABSTRACT
Flower buds of Nicotiana tabacum cv. K326 , NC89 and 8611 , in which the microspore is
in the phase of single nucleus and the nucleus is on the side , were irradiated with 60 Coγ2ray.
Plantlets from anther culture were transplanted and inoculated with poisonous fluid of CMV.
The results showed that there was an orientation relation bet ween the variation of disease resis2
tance of plants of NC89 , 8611 and the dose of 60Coγ2ray. The variation of leaves of plants was
analogous to symptom of CMV when the dose was equal to or more than 4 , which caused diff i2
culty for selection. When dose was less than 2krad , there was no difference in disease resistance
bet ween the plants induced from irradiation of 60Coγ2ray and the control . However , when dose
was equal to 2krad , the difference of disease resistance was at the level of signif icance. CMV2re2
sistant mutants were selected from the population of haploid plant of NC89 and 8611 induced by
210krad of 60Coγray.
Key words :Tobacco , 60Coγ2ray , anther culture , CMV2resistant mutant
08 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1999 ,13 (2) :75～80