全 文 ：此文于 1996 年 10 月 24 日收到。
苹果离体叶片特定部位体细胞
胚胎发生和人工种子研究
达克东　李雅志　束怀瑞
(山东农业大学　泰安　271018)
王　斌
(中国科学院遗传所　北京　100101)
以苹果品种嘎拉试管苗顶部前 3 片展开叶为试材 ,将叶片由叶尖至叶基分为上、
中、下 3 个区 ,每区又由叶脉分隔为左、右两个亚区 ,共 6 个亚区。每一叶片在 1 个亚
区中心部位用解剖针刺伤 1 点后接种于 MS + BA 1mg/ L + NAA 4mg/ L + 2 ,42D
015mg/ L + 蔗糖 20g/ L 的培养基上 ,暗培养 7d 后 ,转接到 MS + BA 1mg/ L + 蔗糖
20g/ L 的培养基上继续暗培养 ,40d 后 ,85 %的叶片在刺伤口周围发生直接类型体细
胞胚胎。用 4 %海藻酸钠和 2 %氯化钙对体细胞胚胎进行人工种皮包裹后制成人工
种子 ,在无菌条件下 ,人工种子转变为绿苗。
关键词 :苹果 　离体叶片 　体细胞胚胎 　刺伤 　人工种子
前 言
植物体细胞通过组织培养产生体细胞胚胎在很多作物上都有报道[7 ] 。建立可以人工控
制的高频率体细胞胚胎发生体系 ,对于快速繁殖优良品种[8 ] 、制造人工种子[2 ] 、进行遗传转化
研究[9 ]和诱变育种研究、以及与体细胞胚胎发生有关的生理生化研究[6 ]和种质资源的保
存[10 ] ,均具有重要意义。以往在苹果叶片体细胞胚胎发生中 ,直接类型体细胞胚胎发生频率
和产量还不很高[1 ] ,由体细胞胚胎制造苹果人工种子还未见报道。本文报道人工控制下苹果
叶片特定部位的直接体细胞胚胎发生以及由体细胞胚胎制造的人工种子。
材 料 与 方 法
试验材料为试管培养两年的苹果 ( M al us domestica Borkh. )栽培品种嘎拉试管苗顶部前 3
片展开叶。接种前将叶片在电脑中由叶尖至叶基分为上、中、下 3 个区 ,每区又由叶脉分隔为
左 (1) 、右 (2)两个亚区 ,共 6 个亚区。接种时 ,每一叶片选 1 个亚区中心部位用解剖针点状刺
穿后接种 (图版 Ⅰ21～6) ,培养基、接种方式和培养条件采用参考文献 [ 1 ]的方法 ,每一处理接
种叶片 30 片 ,重复 3 次。制造人工种子时 ,体细胞胚胎的包裹基质为 4 %海藻酸钠 (加入 MS
+ BA 014mg/ L + IAA 011mg/ L 培养基和 3 %蔗糖作为人工胚乳) ,络合电解质为 2 % CaCl2 ,
使用前经高温高压灭菌。在无菌条件下 ,于小烧杯中将体细胞胚胎与包裹介质充分混合 ,浸泡
3～4min ,然后用玻璃棒将包裹体逐粒拨入 CaCl2 溶液中反应 10～15min ,倒掉 CaCl2 溶液 ,用
61 核 农 学 报　1998 ,12 (1) :16～20
Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
无菌水冲洗 3～4 次以终止反应 ,这样制成的人工种子即可播种。
结 果 与 分 析
(一)苹果特定部位体细胞胚胎发生
　　表 1 结果显示 ,叶片亚区中心刺伤后 ,其体细胞胚胎发生率明显增高 ,处理的平均为
85 % ,对照只有 65 % ;再生体细胞胚胎数 ,对照为 168 ,处理的平均为 314。刺伤部位发生的体
细胞胚胎属于直接类型体细胞胚胎 ,因为刺伤而使伤口发生的愈伤组织上没有体细胞胚胎发
生 (图版 Ⅰ28) 。观察各亚区体细胞胚胎发生的部位时发现 ,距离伤口越近 ,体细胞胚胎发生量
越大 ,越远则发生量越少 (图版 Ⅰ27) 。说明刺伤有刺激其附近普通细胞转变为具有胚胎发生
潜力的细胞的作用 ,且这种刺激作用具有距离效应。
表 1 　刺伤苹果叶片特定部位对其体细胞胚胎发生的作用
Table 1 　Effect of pricking on regional somatic embryogenesis f rom apple leaf
处理部位
Treated
part
分化率
Regeneration rate
( %)
再生体细胞胚胎数
No. of somatic embryo
regenerated
体细胞胚胎发生部位
Somatic embryo region
刺伤口部位
Pricking region
其它部位
Other region
上 (1) 　Upper (1) 85 318 301 17
上 (2) 　Upper (2) 83 307 293 14
中 (1) 　Middle (1) 87 332 319 13
中 (2) 　Middle (2) 87 326 311 15
下 (1) 　Lower (1) 82 291 282 9
下 (2) 　Lower (2) 85 321 308 13
CK 65 168 0 168
(二)人工种子的包裹与播种
作为包裹用的体细胞胚胎 ,从理论上讲 ,对于各发育阶段的体细胞胚胎都是适用的 ,但只
有那些体积较大、子叶肥厚 ,具有发育成完整植株能力的高质量胚才能制造出健壮的人工种
子 ,所以本试验选用子叶期至成熟期的体细胞胚胎作为包裹中心体。两种胚乳包裹试验表明 ,
MS + BA 014mg/ L + IAA 011mg/ L + 3 %蔗糖比 MS + 3 %蔗糖更适合作苹果人工种子的胚乳 ,
前者 100 %萌发且生长健壮 ,后者只有 30 %萌发且生长细弱。人工种皮一般是人工种子中体
细胞胚胎和人工胚乳以外的部分。体细胞胚胎经过与海藻酸钠、人工胚乳充分混合后 ,在 2 %
CaCl2 溶液中与 CaCl2 发生离子交换反应 ,形成具有一定硬度的人工种皮 ———海藻酸钙 (图版
Ⅱ21) 。苹果人工种子于无菌条件下可在无激素 MS 培养基和有激素培养基 ( MS + BA 014
mg/ L)中萌发 ,但以有激素培养基为好 ,萌发率高达 100 % (图版 Ⅱ22) ,在无激素培养基中 ,人
工种子尽管也能萌发 ,但继续生长受阻 ,这与苹果大部分体细胞胚胎根端发育不完全有关 (图
版 Ⅰ29) 。萌发的人工种子在适宜培养基上生根 ,长成正常植株 (图版 Ⅱ23) 。
讨 论
　　11 苹果离体叶片特定部位体细胞胚胎发生在育种中的应用 :嵌合体是植物诱变育种中的
71　1 期 苹果离体叶片特定部位体细胞胚胎发生和人工种子研究
图版 Ⅰ
1～6. 刺伤处理后的叶片 (MS + BA 1mg/ L + NAA 4mg/ L + 2 ,42D 015mg/ L 暗培养 5d) 。　71 伤口周围直接体细胞胚胎
发生 (MS + BA 1mg/ L 暗培养 40d) 。　81 伤口周围直接体细胞胚胎发生的解剖镜观察。　91 组织切片显示直接体细胞
胚胎根端发育不完全。
Plate Ⅰ
1～6. Pricked leaves(5 days dark treatment on MS + BA 1mg/ L + NAA 4mg/ L + 2 ,42D 015mg/ L) 　71Direct somatic embryo2
genesis around the prick (40 days dark treatment on MS + BA 1mg/ L) 　81Observation of direct somatic embryogenesis around
the prick under dissecting2microscope 　91Histology of direct somatic embryo with partially developed rootpart
81 核　农　学　报 12 卷
图版 Ⅱ
11 人工种皮包裹后的体细胞胚胎人工种子。　21 人工种子萌发。　31 来自人工种子的小植株。
Plate Ⅱ
11Artificial seeds of somatic embryo with artificial seed coat 　21Germination of artificial seeds 　31Plantlets from artificial seeds
一种常见现象 ,诱变后代叶嵌合或花嵌合在很多植物上都有报道[4 ] 。如何使嵌合体尽快同质
化 ,一直是困扰诱变育种的一个难题 ,分离嵌合体的传统方法一般是采用多代切割分离 ,该法
不仅费时费工 ,而且有可能因二倍体选择而失败。植物原生质体培养植株再生是分离嵌合突
变体的最佳方法[5 ] ,通过分离嵌合突变细胞的原生质体进行培养再生 ,可得到同质突变体 ,但
在目前此法还不很普遍的情况下 ,将叶片特定部位体细胞胚胎发生技术应用于叶嵌合突变体
的分离 ,不失为一种简便可行的方法 ,同样是嵌合突变细胞起源 ,而可操作性比原生质体培养
91　1 期 苹果离体叶片特定部位体细胞胚胎发生和人工种子研究
强 ,只需在嵌合部位刺点后进行普通的器官培养 ,直接体细胞胚胎即可发生。另外 ,该技术也
可应用于与苹果直接体细胞胚胎发生有关的理论和应用研究。
　　21 苹果人工种子存在的问题和解决途径 : (1) 人工种子储藏难。人工种子的营养泄漏和
体细胞胚失水是储藏难的关键。Sakai 等[10 ]通过甘油、乙二醇、二甲亚酚和蔗糖处理包裹中心
体 ,经液氮冷冻后储藏 ,提高了人工种子的储藏时间。(2) 木本植物人工种子生根难。目前还
没有很好的解决办法 ,我们认为 ,改进培养条件 ,培养出高质量的、根芽发育良好的体细胞胚
胎 ,就可得到解决。(3)组织培养会使再生后代产生体细胞无性系变异。特别是经过较长期培
养的愈伤组织常常会分化出变异植株[3 ] ,减少原始材料继代次数和由培养器官直接发生体细
胞胚胎 ,可以降低体细胞无性系变异率。
参 考 文 献
1 　达克东 ,张　松 ,李雅志 ,亓增军 1 苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎发生研究 1 园艺学报 ,1996 ,23 (3) :241～245
2 　郭仲琛 ,桂耀林 1 植物体细胞胚胎发生和人工种子 1 北京 :科学出版社 ,1990
3 　孙敬三 ,朱至清 1 植物细胞工程与育种 1 北京 :北京工业大学出版社 ,1990 ,209～213
4 　徐冠仁主编 1 植物诱变育种学 1 北京 :中国农业出版社 ,1996
5 　许　耀 1 原生质体在分离和鉴定生化突变体中的作用 1 植物生理学通讯 ,1987 , (2) :1～8
6 　郑小峰 ,黄百渠 1 几种植物体细胞胚胎发生标记蛋白的研究 1 植物学报 ,1994 ,36 (3) :175～180
7 　周俊彦 1 植物体细胞在组织培养中产生的胚状体Ⅰ1 植物生理学报 ,1981 ,7 (4) :389～397
8 　周丽侬 ,马雪筠 ,陈俊秋 ,林健良 ,邝哲师 1 香蕉通过胚状体途径的快速繁殖研究 1 广东农业科学 ,1991 ,3 :22～26
9 　Mc Granahan G H et al. Agrobacterium mediated transformation of walnut somatic embryos and regeneration of transgenic
plants. Bio/ Technology ,1988 ,6 :800～804
10 　Sakai A , Kobayashi S A. Simple and efficient procedure for cryopreservation of nuceller cells of navel orange by vitrification.
Cryobiology ,1990 ,27 :657
REGIONAL SOMATIC EMBRYOGENESIS FROM IN VI TRO APPL E
L EAF AND ARTIFICIAL SEED OF APPL E
Da Kedong 　　Li Yazhi 　　Shu Huairui
( S hangdong A gricult ural U niversity , Taian 　271018)
Wang Bin
( Instit ute of Genetics , Acadmia Sinica , Beiji ng 　100101)
ABSTRACT
First three open leaves of in vit ro apple( Malus domastica Borkh. ) shoots were used as ex2
plants. Each leaf was divided into three regions( upper , middle and lower) from tip to base and
each region was composed of t wo sub2regions( leaf and right) along the main vain. Every explant
was pricked with a dissector at the center of one sub2region before inoculated on MS + BA 1mg/
L + NAA 4mg/ L + 2 , 42D 015mg/ L medium and incubated in darkness for 7 days , then trans2
fered to MS + BA 1mg/ L medium. 85 % of the explants regenerated somatic embryos directly
around the prick after 40 days. The embryos were encapsulated in 4 % sodium alginate and 2 %
CaCl2 as artif icial seeds , which could germinate and grow into plantlets under aseptic condition.
Key words :Apple , i n vit ro leaves ,somatic embryos ,prick ,aritificial seeds
02 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1998 ,12 (1) :16～20