全 文 ：热带亚热带植物学报 2005，13(2)：149—153
Jo ofTropical and Subtropical Botany
·
． A-·
旦
目 马拉雅 一横断山区钟花报春居群
遗传多样性及遗传分化
王凤英，葛学军，郝 刚 ，胡启明
f中国科学院华南植物园，广州 510650)
摘要：应用简单序列重复区间(ISSR,Inter-simple sequence repeat)分子标记，对喜马拉雅 ．横断山区钟花报春(Pr／mu／a
sikkimensis)进行居群遗传分析。用 10个 ISSR引物对 13个居群的254个个体进行扩增，共检出91条扩增片段，全部
为多态带，总的多态位点百分率为 100％。Shannon多样性指数 (no)从 0．2293到0．4016，居群水平上平均值 (H )为
0．32l1，物种水平上 (H )为0．5576。利用分子方差(AMOVA)软件分析，其结果为：在总的遗传变异中，有 50．28％的
遗传变异属于居群之间；用 POPGENE计算出的遗传分化系数 Gsr=0．4127，即居群间的分化变异占居群总遗传变异的
41．27％，比AMOVA分析所得的结果偏低。居群间遗传距离变化范围从0．0780到0．4748，遗传一致度(I)的变化范围
从0．6220到0．9250。居群间的基因流Nm=0．71 14，相对低的基因流可能是维持钟花报春居群遗传分化的原因。这表
明，喜马拉雅．横断山区钟花报春的13个居群具有很高的遗传多样性，并且居群间的分化也很大。
关键词：喜马拉雅．横断山区；报春花科；钟花报春；遗传多样性；遗传分化
中图分类号：Q16 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2005)02—0149—05
Genetic Diversity and Diferentiation in Primula sikkimensis
(Primulaceae)in Himalayan—Hengduan Mountains
WANG Feng-Ying，GE Xue-jun，HA0 Gang’，HU Oi-ming
(South China Botanical Garden,the Chinese Academy ofSciences，Guangzhou 510650，China)
Abstract：Population genetic structure ofPrimula sikkimensis distributed in Himalayan．Hengduan Mountains WaS
studied using Inter-simple sequence repeat(ISSR)markers．Ten ISSR primers were used to amplify 254 individuals
of 1 3 populations，which successfully detected 9 1 loci，al of which being polymorphic．The Shannon diversity
index(H0)ranged from O．2293 to O．4016，with an average ofO．321 l at the population level(HP0P)and O．5576 at
the species level(H )．Moreover，the AMOVA analysis showed that 50．28％ of the total genetic diversity WaS
among populations；the index(Gsr一0．4 1 27)based on POPGENE indicated tIlat 4 1．27％of molecular variation
was among populations． which was lower than that in the result Of AMOVA． The variation of genetic distance
ranged from 0．0780 to 0．4748，genetic identity from 0．6220 to 0．9250．In addition。the gene flow am ong population
WaS low fNm 0．7 l1 4)；relatively lower gene flow might be one of important factors influencing the genetic struc-
ture of the species．The present analysis reveals that 1 3 populations of P sikkimensis in Himalayan -Hengduan
Mountains have high genetic diversity and high genetic diferentiation．
Key words：Himalayan-Hengduan Mountains；Primulaceae；Primula sikkimensis；Genetic diversity；Genetic
diferentiation
收稿日期：2004—07—13 接受日期：2004—10—09
基金项目：国家自然科学基金 (30370100，30470125)；广东省 自然科学基金 (31255)；中国科学院知识创新工程重要方向性项 目
(kscxz—SW一101A)资助
‘通讯作者 Corresponding author
维普资讯 http://www.cqvip.com
15O 热带亚热带植物学报 第 l3卷
东喜马拉雅及横断山地区是全球 25个、北半
球仅有的两个生物多样性研究热点之一的中国中
南热点的核心区域[1,21，也是欧亚大陆很多植物的发
源地和避难所。这一地区因其复杂的地质历史和多
样化的生境及气候条件，蕴育出丰富的物种多样性
和特有成分，是研究物种分化和物种形成机制的理
想地区。
报春花属 (Primula)在喜马拉雅 一横断山地区
的分化是种子植物在此地区急剧辐射演化的一个
典型例子。报春花属共有500余种，我国约有300
种，西藏东南部至云南、四川I西部(亦即东喜马拉雅一
横断山地区)是该属植物的现代分布中心和多样化
中心【3I。
钟花报春 sikkimensis Hook．)隶属于报春花
属钟花报春组，多年生草本，在我国产于四川I西部、
云南西北部和西藏，生长于林缘湿地、沼泽草甸和
水沟边，海拔 3 200—4 400 m处。在尼泊尔、锡金、不
丹亦有分布[4j。
喜马拉雅一横断山地区具有丰富的物种多样性
和特有成分是早已认同的事实，以分子生物学的手
段来探讨本地区植物类群自第四纪以来的物种分
化、适应性进化和物种迁移路线的研究也逐渐开
展 。本文利用简单序列重复区间 (ISSR。inter—
simple sequence repeat)分子标记来检测喜马拉雅一
横断山地区钟花报春的遗传多样性和遗传结构，探
讨其在居群水平上的遗传分化式样，为研究本地区
的物种分化和物种形成积累资料。
1材料和方法
1．1实验材料
以居群为单位采集生长于喜马拉雅一横断山区
的钟花报春。共采集到 13个居群，每个居群各取大
约 20株个体的新鲜叶片，分别用变色硅胶进行快
速干燥，置于密封袋中带回实验室，于室温下保存。
材料来源见表 1。
1．2总 DNA的提取 PCR扩增和数据分析
采用改进的CTAB法[9]从叶片中提取总 DNA，
用 1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
从 100个 ISSR引物中筛选出 l0个能获得清
晰条带的引物，引物及序列见表2。PCR反应体系
20 l，M 浓度为 2．5 mmol／L。PCR扩增反应在
PTC一100或 PTC一200的 PCR仪上进行。扩增程序
为：94℃预变性 5 min，然后进行 35个循环：94℃30 S，
49-5l℃45 S，72oC90 S，最后于72℃延伸7min。
反应产物在 1．5％琼脂糖凝胶中电泳检测。
ISSR是显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁
移率一致的条带被认为具有同源性。属于同一位点
的产物按扩增阳性 (1)和扩增阴性 (0)记录电泳带
谱，形成 ISSR表型数据矩阵。为衡量 ISSR水平上
的遗传变异程度 ，利用 POPGENE v．1．31软件㈣，
计算 多态位 点百分数(PPB)、Shannon多样性指数
(Ho)、在物种水平上的遗传多样性(HsP)、在居群水
平上的遗传多样性 (H 、居群间遗传分化系数
(Gsr)、居群问遗传一致性(I)及基因流 (Nm)。另外采
表 1 材料来源及居群内遗传变异
Table l Sample location ofPrimula sikkimensis and genetic variation within populations
Ho：Shannon多样性指数Shannon’s information index
P：多态位点百分率 Percentage ofpolymorphic loci
维普资讯 http://www.cqvip.com
第2期 王风英等：喜马拉雅 ．横断山区钟花报春居群遗传多样性及遗传分化 151
用AMOVA1．55软件[“1分析遗传变异在居群间的分布
情况。用Mantel test~ 检测居群之间的遗传距离与
地理距离之间的关系。
表 2 钟花报春的 ISSR引物序列
Table 2 Primes used in ISSR for Primula sikkimensis
引物名称 序列
Prime name Sequence 5-3’
(AG)8C
(GA)8C
(CT)8A
(AC)8G
(AG)8yT
(AG)8yC
(GA)8yT
(AC)8YG
BDB(CA)7
DBD(AC)7
2结果
1O个引物在 254个个体中共扩增出 91条带，
平均每个引物扩增出9．1条带，扩增片段长度为
280—1 400 bp。91条带均为多态性条带，多态位点百
分数 (PPB)为 100％。单个居群的多态带百分率从
39．56％到 67．03％，平均为 54．44％。Shannon多样性
指数 (H01从 0．2293到0．4016(表 1)，居群水平上
平均值 (HP0P)为 0．321 1，物种水平上 (H )为 0．5576。
用 POPGENE计算出的居群间遗传分化系数
G盯=O．4127，表明在总的遗传多样性中，有 41．27％
的变异来自于居群之间。居群之间每一代的基因流
m1为 0．7114，这表明居群之间的基因流水平较低。
利用 AMOVA软件分析，表明在总的遗传变异
中，有 50．28％的遗传变异发生在居群之间，49．72％
的遗传变异位于居群内(表 3)。
表 4显示了钟花报春各居群地理距离和遗传距
离之间的关系。Mantel test结果显示居群之间的遗传
距离与地理距离之间呈正相关r=0．5906，P=0．0109)。
根据钟花报春各个居群之间的遗传距离进行聚类 (图
1)。13个居群明显分为 2类，一类为采 自西藏的4个
居群，另一类为采白四川和云南的9个居群。
3讨论
3．1遗传多样性
遗传多样性是一个物种生存、发展和进化的基
础[”1。Hamrick等曾多次对植物居群遗传结构与植
物生活史特性和生态因子之间的关系进行综合研
究，结果表明，繁育系统、分布范围和习性[ q是影
表3 分子方差分析结果
Table 3 Analysis ofmolecular variance
表4 钟花报春居群间的遗传距离及地理距离表 (对角线上为地理距离，下为遗传距离)
Table 4 Pairwise Phist distance estimates and geographical distances between Primula sikkimensis populations based on ISSR fingerprinting
(Geographical distance in kilometers above diagonal and genetic distance below diagona1)
居群编号见表 1 For population numbers see Table 1
8 1 4 7 4 5 0 7 8 9 踟 跗 跗 韶 韶 船 船
维普资讯 http://www.cqvip.com
l52 热带亚热带植物学报 第 l3卷
— — — — — — — — —
rJ
．rJ5
遗忙野禽Genetie di stanc0
图 l钟花报春 l3个居群的聚类图
Fig．1 Neighbor~oining tree of 1 3 populations of
丹 mula sikkimensis Hook．
居群编号见表 1 For population numbers see Table 1
响植物居群遗传变异大小的主要因素。遗传变异最
高的植物类群是那些寿命长、地理分布广、异交为
主、风媒授粉、结实性高且存在于演替末期群落中
的物种[ 。
植物的遗传多样性与物种『的地理分布范围有
着很强的关联性[14]。自然分布范围大的物种通常包
含较多的遗传多样性[18】。已有研究表明，报春花属中
的一些广布种，如鄂报春 obconicaHance)、卵叶
报春 ovlifolia Franch．)及P elatior Hil具有较高
的遗传多样性[-9-2”。钟花报春为多年生草本植物，广
泛分布在喜马拉雅一横断山区。钟花报春物种水平
上的多态位点比率为 100％，居群水平平均为
54．44％，具有很高的遗传多样性，符合分布范围广
遗传多样性就较高这一预测。但是，在报春花属其
它植物的遗传多样性研究中也发现了与地理分布
范围没有关联的情况，如景东报春 interjacens
Chen)。虽然景东报春分布范围非常小，但是遗传多
样性比较高[s】，可能与其两型花结构有关。远交植物
通常比自交植物具有较高的遗传多样性。Weler等
人研究Schiedea属和Alsinidendron属的29种植物
的遗传多样性，发现异型花植物的遗传多样性显著
高于白花授粉植物[21。．因为同一类型的花之间通常
自交不育，而只能通过昆虫来实现不同类型花之间
的授粉。钟花报春较高的遗传多样性也可能与其具
有两型花结构 (长花柱花或者短花柱花)，进行异交
有一定的关系。
Shannon多样性指数 (H0)同时也反映了遗传
多样性的水平 ，在钟花报春，Uo=O．2293—0．4016．
HFop=0．321 1，Hsp=0．5576，这些指数接近于报春花属
中的景东报春(Ho：0．3242—0．3763，HPOP：0．3459，H ：
0．4618)[81，高于卵叶报春o{o：0．1 12—0．147，HPOP：0．134，
H ：0-3 1 3)[201和鄂报春 (Ho：0．045—0．309，HPoP：0．222，
H ：O．435) 。因此，钟花报春相对于同属中的其他
物种来说具有较高的遗传多样性。
钟花报春虽然遗传多样性较高，但是各个居群
多态带百分率变化较大，从39．56％到67．03％，平均
为 54．44％。其中居群 11最高，为 67．O3％；居群 13
最低，为39．56％。居群遗传多样性水平可能与居群
所处的生境具有一定的相关性。
3．2遗传结构
用 POPGENE计算出的居群间遗传分化系数
G =O．4127，表明在总的遗传多样性中，有 41．27％
的变异来自于居群之间，而58．73％的变异则来自居
群内，说明居群间遗传分化相当高。交配系统是影
响植物遗传结构的最重要因素之一。钟花报春具有
异型花结构，是典型的异花授粉植物。其交配系统
应该促进居群间基因交流，增加有效居群大小，并
且减少基因漂变带来的影响[141。Hamrick和Godt统
计了 1968年到 1988年 2O年里报道的 165属 449
种种子植物遗传多样性研究结果，发现白交为主的
种类遗传分化平均为O．51，而异交为主的物种平均
为0．1O㈤。报春花属的其他一些植物，如鄂报春
obconica)(Gsr-0．5197)、卵叶报春 Z )(G
= 0．5737)、景东报春 interjacens)(G ：0．2613)，
遗传分化也很高；而报春花属的另一些植物居群间
遗传分化很低，如在19．elatior中只有 4％[2l】，在黄花
九龙草 (P．ver／s)中也只有 3．9~[241。然而本研究中，
钟花报春居群间的遗传分化达到0．4127，与其异交
交配系统完全不同。
虽然异交一般使居群间的遗传分化下降，但同
种植物各个居群空间上的隔离、突变、环境因子造
成的选择差异、随机遗传漂变、基因流的隔离等都
能导致居群遗传结构的空间异质性，从而促进居群
的分化[2】]。本研究所选用的居群均采自喜马拉雅 一
横断山区，本地区地理位置特殊，地势相差很大，地
形复杂，气候多变，生境多样化，具复杂的垂直带和
纵 向的平行峡谷，导致居群隔离，促进居群间大的
遗传分化 。
影响居群遗传结构的因素除繁育系统外，基因
流也是一个重要因素。高水平、稳定的基因流可以
防止居群间的遗传分化，使居群趋向于一致 。钟花
报春为生长在亚高山草甸和疏林下的低矮草本，所处
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 2期 王凤英等：喜马拉雅 一横断山区钟花报春居群遗传多样性及遗传分化 l53
的生境复杂，居群之间相距较远，种子缺乏特殊的传
播机制，花粉和种子的有效传播距离可能小于居群间
的地理距离，使得居群内基因交流频繁，而居群间难
以进行基因交流，基因流较低 (Nm=O．71 14)，造成居
群间出现较明显的遗传分化(G =O．4127)。
3．3遗传距离
在钟花报春居群的聚类树中 (图 1)，四川乡城
和稻城这两个居群亲缘关系最近，先聚合在一起，
由于地理位置接近，气候类型相似，基因交流的可
能性较大，保持着较小的遗传距离；而西藏采的4
个居群与其他的遗传距离较远，可能是地理距离较
远，生境差异较大，基因交流的可能性相对较小，因
而在进化中形成了较大的遗传距离。
参考文献
[1]Myers N，Mitermeler R A，Mitermeler C G，et a1．Biodiversity
hotspots for conservation priorities[J]．Nature，2000，403：853—
858．
【2]Sechrest W，Brooks T M，da Fonseca G A B，et a1．Hotspots and the
conservation of evolutionary history[J]．Proc Natl Acad Sci USA，
2000，87：7024—7029．
[3] Hu Q M(胡启明)．On the geographical distribution ofthe Primu-
laceae[J]．J Trop Subtrop Bot(热带亚热带植物学报)，1994，2：
l—l4．(in Chinese)
[4】 Hu Q M(胡启明)．Flora Reipublicae Popularis Sinicae Tomus 59
(2)[M]．Beijing：Science Pres，1990．136一l38．(in Chinese)
[5]Sun H(孙航)．Tethys retreat，Himalayas and Hengduanshan Moun—
tains uplift and its significan ce on the Sino—Himalaya elements and
alpine flora origin and development[J]．Acta Bot Yunnan(云南植
物研究)，2002，24：273—288．(in Chinese)
[6】Sun H(孙航)．Evolution ofarctic·tertiary flora in Himalayan·Heng—
duan Mountains[J]．Acta Bot Yunnan(云南植物研究)，2002，24：
671-688．(in Chinese)
[7】Gex J(葛学军)，ZhangLB (张林彬)，YuanYM (袁永明)，
et at Strong genetic diferen tiation of the East·Himalayan Mega-
codon stylophorus(Gentianaceae)detectedbyInter·SimpleSequence
Repeats(ISSR)[J]．Biodiver Conserv，2004．(in press)
[8] Xue D W，Ge X J，Hao G，et a1．High genetic diversity in a rare，
narrowly endemic primrose species：Primula interjacens(Primu·
laceae)by ISSR analysis[J]．Acta Bot Sin，2004，46：l 163—1 169．
[9] Doyle J．DNA protocols for plants·CTAB total DNA isolation[A]．
In：Hewitt G M ，Johnston A．M olecular Techn iques in Taxonomy
[M]．Berlin：Springer，1 99 1．283—293．
【10]Yeh F C，Yang Boyle T．POPGENE．Microsoft Windows-based
freeware for population genetic analysis[CP／DK]．Release l-3 1
University ofAlberta，Edmonton，1999．
【Il】 Excoffier L，Smouse P E，Quatro J M．Analysis ofmolecular
varian ce inferred from me c distances among DNA haplotypes：
application to human mitochondria DNA restriction sites[J]．
Genetics，l992，l3l：479—491．
[12]Miler M P．Tools for Population Genetic An alysis，Version 1．3，
Department ofBiological Sciences [CP／DK]．No．hem Arizona
University，Flagstaf,l 997．
[13]Barret B A，Kidwel K K．AFLP-based genetic diversity assess·
ment among wheat cultivars from the Pacifc Noahwest[J]．cr0p
Sci，1998，38：126l一1271．
[14]Hamrick J L，Godt M J W．Alozyme diversity in plant species[A]．
In：BrownA H D，CleggM T，KahlerA L，et a1．PlantPopulation
Genetics，Breeding and Genetic Resources【M]．Sunderland，Mas—
sachusets：Sinauer，1 989．43—63．
[15]Hamrick J L，Linhart Y B．Relationships between life history char-
acteristics and electrophoreticaUy de~ctable genetic variation in
plant[J】．Ann Rev Ecol Syst，1979，10：l73-200．
[16] Hamrick J L，Godt M J W，Sherman—Broyles S L．Factors influ—
encing levels of genetic diversity in wooay plant species[J]．New
For，1992，6：95—124．
[17]Ge S(葛颂)，Hong D Y(洪德元)．Biosystematic studies on
A denophora otanini Korsh．complex(Cam panulaceae)IV．
Alozyme variation and diferentiation[J]．Acta Phytotax Sin(植
物分类学报)，1998，36：481—489．(in Chinese)
[18]WRIGH T S．The genetic structure ofpopulations[J]．Ann Engen，
1951，15：323—354．
[19] NanP(南蓬 ShiSH(施苏华)，PengSL(彭少麟 etat Genetic
diversity ofPrimula obconica from central and southwest China as
revealed by ISSR markers[J]．Ann Bot，2003，9 l：329—333．
[20]Nan P(南蓬)．An alyses ofessential oil compositon and genetic
diversity ofPrimula obconica and Primula ovalifolia population in
China[D]．Guangzhou：South China Institute of Botany，Chinese
Academy of Sciences，2002．(in Chinese)
[2 1]Jacquemyn H，Honnay O，Galbusera P，et a1．Genetic structure of
the forest herb Primula elatior in a changing landscape [J]． Mol
Ecol，2004，l3：2l 1-2l9．
[22]Weler S G，Sakai A I(，Straub C．Allozyme diversity and identity
in Schiedea and A lsinidendron(Caryophyllaceae：Alsinoideae)in
the Hawaian Islands[J]．Evolution，1996，50：22—34．
[23]Hamric J L，Godt M J W．Alozyme diversity in plant species[A]．
In：Brown A D H，CleggM T，KahlerA L，et a1．Plan tPopulation
Genetics， Breeding， and Genetic Resources [M]． Sunderland,
Massachusets：Sinauer Associatea Inc，l 990．43—63．
[24]Antrobus S，Lack A J．Genetics of colonizing and established
populations ofPrimula veris[J]．Heredity，l993，7l：252—258．
[25]Zhang J(张娟)YinLK(尹林克)，ZhangDY(张道远)．RAPD
analysis of genetic diversity in natural populations of Tamarix
hispida[J]．Acta Bot Yunnan(云南植物研究)，2003，25：557—
562．(in Chinese)
[26]ZhangRZ(张荣祖)，ZhengD(郑度)，YangQY(杨勤业)，et a1．
Physical Geography of Hengduan Mountains[M]． Beijing：
Science Press，l 997．(in Chinese)
[27]ZouYP(邹喻苹)，Ge S(葛颂)，WangXD(王晓东)．Molecular
Marker in Systematic and Evolutionary Botany[M]．Beijing：
Science Press，200 1．(in Chinese)
维普资讯 http://www.cqvip.com