全 文 ：热带亚热带植物学报 2003，1 l(1)：1 1-14
如 of Tropical and Subtropical Botany
花生种皮蜡质和角质层与黄曲霉侵染和产毒的关系
梁炫强 周桂元 潘瑞炽
(1．广东省农业科学院作物研究所，广东 广州 510640；2．华南师范大学生物系，广东 广州 510631)
擒耍：黄曲霉侵染花生的研究表明，种皮破损的黄曲霉毒素含量显著高于种皮完整的，种皮对黄曲霉侵染和产毒起
着重要的屏障作用。采用氯仿去除种皮蜡质，用 KOH或角质酶去除种皮角质层后，种子黄曲霉感染率和黄曲霉毒素
含量显著提高。种皮蜡质和角质层同时去除的与种皮破损的黄曲霉感染率和毒素含量差异不显著，表明种皮的抗性
成份主要是蜡质和角质层。种皮蜡质含量测定和种皮表面扫描电镜观察表明，蜡质的含量和角质层的厚度与品种的
抗性有关。抗性品种种皮蜡质含量显著高于感病品种。种皮蜡质提取物在体外抑菌效果不显著，说明蜡质的抗性作
用主要是物理性阻止黄曲霉菌的穿透。
关■诩：花生；黄曲霉毒素；种皮；蜡质；角质层
中圈分类号：s435．652 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2003)01-001 l-o4
W ax and Cuticle of Peanut Seed Coat in Relation to Infection
and Aflatoxin Production by Asperilus flavus
LIANG Xuan．qiang ZHOU Gui．yuan PAN Rui·chi
(1．Crops Research ln~timte，GM dD Academy of Ag 础 Sciences，Gtlf~zhou510640，C=hi蛆；
2．Biology Deparuneru，South China Normal University,Gual~ ou 510631，a血咀)
Abstract：1【11e efects ofwax and cuticle ofpeanut seed coat on reducing the infection and aflatoxin production by
Aspergillus jq~us 嘴 Studied． Experiments showed that when the Wax on seed coat WaS removed with
chloroform or／and cuticle removed with KoH(or cutinase)．fungal infection rate and aflatoxin content in the seeds
WC~e significan tly increased． Aflatoxin content in seeds wi th wounded seed coat was higher than that in intact
seeds afterbeinginoculated tllA． 倒l‘s．Scanningelectronmicroscopicobservationon seed coatrevealed that
most ofresistant seeds were rough in appearance and had adundant wax deposits on seed surfaces．It iS indicated
thattheWax an dcuticleplayan important rolein preventingfungalpenetration．
Key words：Pean ut；Seed coat；Aflatoxin；W ax ；Cuticle
花生在收获、贮藏和加工过程中极易受黄曲霉
spergilhts l‘s Link)侵染并产生黄曲霉毒素，从
而影响花生生产、加工和出口贸易，危害人们的健
康。培育抗黄曲霉花生品种是解决花生黄曲霉感染
最有效和最经济的途径。自美国和国际半干旱作物
研究所等筛选 出抗黄曲霉侵染的花生种质资源以
来，有关抗性机制和培育抗侵染品种成为花生研究
的热点 21。
剥壳后的花生食品在加工、运输和贮藏过程
收疆 日期：2oo2—o3-25；接受日期：2oo2-o6_-24
基金项目：国家。863 计划 (2001AA241153)，广东省自然科
学基金项 目(010113)资助
中，易受外源病菌 (特别是大气中黄曲霉)的侵袭，
因此种皮成为保护种子的第一道屏障。
已有一些研究认为玉米种子的种皮结构与抗
黄曲霉侵染有关 。花生种皮由表面蜡质、角质层、
一 层厚壁色素细胞、4—5层薄壁组织和萎缩的外胚
乳组成，因此人们推测花生种皮在抗黄曲霉侵染和
产毒中也应起作用【1．刀。但迄今尚未有实验证实。
本研究主要是通过① 比较花生种子在人工针
刺破损前后，蜡质和角质层去除前后黄曲霉侵染率
和黄曲霉毒素的变化情况，探讨种皮的抗性机制；
②通过种皮蜡质含量的测定、种皮蜡质超显微结构
观察、去除蜡质和角质层试验和蜡质体外抑菌试
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12 热带亚热带植物学报 第 11卷
验，探讨抗黄曲霉侵染花生品种固有的抗性机制和
标记，为选育抗性品种提供理论依据。
1材料和方法
1．1 供试材料
共 9个，其中 5个抗黄曲霉侵染的花生品种为
J一11，VRR245，PI337494，UF71513和湛 秋 48，4个
高感染花生品种粤油 5，粤油 114，湛油 30和汕油
523。按常规种植，收获种子及时清洗，在 35-40~C下
风干，置 4℃下保存，不用任何杀虫剂、杀菌剂和染
色剂处理。
黄曲霉菌株 As．2890引自中国科学院微生物研
究所，该菌株在察氏培养基中28℃下黑暗培养。接
种时用无菌水收集培养 7-8 d的孢子，10 000×g离
心 5 min，无 菌水 重 悬 ，并 调整 孢 子 液 浓度 为
lxl0。孢子 ml～。
1．2 实验方法
接种 荚果手工去壳，每个品种选取饱满、大
小均匀无损种子 50粒，用 5％次氯酸钠消毒 5 min，
无菌水冲洗 3次，并使种子含水量达 20％，置灭菌
培养皿中。每培养皿中加入 1 ml黄曲霉孢子悬浮液
(1xl0。孢子 ml )，搅拌，使每粒种子均匀粘上黄曲
霉孢子，另设无菌水处理为对照组，28℃下作恒温、
恒湿(Rm 00％)暗培养，3次重复。第 7天统计感染
种子数和感染率。种子含水量采用 AD一4715红外快
速水分测定仪测定。
种子黄曲霉毒素 B 含量的测定 采用酶联
(ELISA)方法检测，黄曲霉毒素 B 测试盒购 自江苏
省微生物研究所。将接种后培养第 7天的9个品种
的种子用 70％乙醇表面消毒，于 1 15℃下烘干，粉碎
过 20目筛。每个品种分别准确称取 2 g样品置于磨
口试管中，并按测试盒使用说明检测每份样品黄曲
霉毒素 B 含量。三次重复。
种皮蜡质含量的测定 参照 Russint61方法，
选取饱满，大小均匀和无损种子，小心剥取种皮。每
个品种准确称取种皮 50 g，浸在氯仿中60 S，取出种
皮，氯仿蒸发后测定种皮蜡质的残留量，并据此推
算每个品种种皮的蜡质含量 (1a gmg 种皮)。
种皮蜡质体外抑菌鉴定 按 Russint61方法，
每个品种取 100 g种子浸在氯仿中 60 S，取出种子，
氯仿蒸发至干后，残留的蜡质用 3 ml的氯仿再溶，
加入已配制好的 45℃察氏培养基中，并调整每品种
蜡质的含量为 1 mg ml～，倒入培养皿中，在无菌箱
中放置 2 h，让氯仿挥发。在培养皿中心加入 l0u l
黄 曲霉孢子液 (10 个孢子 ml。)，置于 28℃下黑暗
培养，2 d后测量黄曲霉菌落的直径。以不加氯仿的
察氏培养基为对照，3次重复。
种皮角质层和蜡质抗黄曲霉的测定 参照
Guot~方法，种子在 0．1 mol／L KOH液中浸 30 min去
除角质层后，蒸馏水冲洗 3次，35-40~C风干。参照
Russint~方法，种子在氯仿中浸 60 S去除蜡质，氯仿
自然挥发后，1／3种子直接接种；1／3种子在 0．1 mol／L
KOH中浸 30 min去除角质层，蒸馏水冲洗 3次，
35-40~C风 干 ；1／3种 子 在 室温 下 用 角 质 层 酶
d00 lagml )处理 2 h，蒸馏水冲洗 3次，35-40~C风
干 。
去除种子的角质层和蜡质后，按 1．2方法测定
种子感染率。
种皮蜡质结构和分布的观察 种子在 35℃下
风干 3 d，每个品种选发育程度一致的种仁 l0个，在相
同的部位取 1删 种皮 ，置于铝柱上 ，喷上金钯
(20nm厚)，进行扫描电镜观察。
2结果和分析
2．1黄曲霉的感染率和黄曲霉毒素 B-含量
9个参试花生品种接种 7 d后，黄曲霉平均感
染率和产生的黄曲霉毒素 B 含量见表 1。按国际花
生黄曲霉感染测试标准，广东地方农家种“湛秋48”
和印度花生品种“J一1 1”的平均感染率低于20％，属
高抗侵染品种 ；美国品种 “UF71513”，“VRR245”
和 “PI337494F”感染率低 于 30％，属中抗侵染品
种，其它 4个品种感染率超过 70％，属高感品种。
所有品种接种后均检测到黄曲霉毒素 B ，但抗
侵染品种的 B 含量明显比感病品种低，通常低 4一
l0倍。抗性品种“IJ1 l5l3”最低 (45．8 ppb)，而感
病品种 “粤油 5号”最高，达 398．1 ppb(表 1)。
表 l接种黄曲霉后不同花生品种种子的平均感染率和黄曲霉毒素 B，的含量
Table l Infection rate andaflatoxinB-contentinpeanut seedsofvarious cultivarsinoculated、 th Aspergillus flavus after7 days
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第 l期 梁炫强等：花生种皮蜡质和角质层与黄曲霉侵染和产毒的关系 l3
经方差分析，抗 -感品种之间黄曲霉平均感染
率和黄曲霉毒素含量达极显著水平，表明抗 -感品
种对黄 曲霉侵染和产毒的抗性存在显著的遗传差
异。
2．2 种皮蜡质含量与蜡质提取物
采用氯仿处理花生干种子 60 S后，经电镜扫描
观察 (图版 I：K)，可发现种皮表面原有的蜡质层已
不存在，表明用氯仿处理可完全去除种皮上的蜡质。
抗 -感品种种皮蜡质含量测定，经方差分析，抗 -
感品种种皮蜡质韵含量存在显著的差异(表 2。所有
抗性品种种皮蜡质的含量均比感病品种高，而且达
显著水平。其中以 “J-ll”种皮蜡质含量最高，达
26．53 ug mE 。
裹 2花生种皮螬质对体外抑菌的影响
Table 2The efectofwaxinpeanut seedcoatonthe
resistancetoA． W tested n v／tro
’新复极差测验Dunoants test，q=o．05显著水平，具有相同字母
表示差异不显著。Meansinthecolumnfolowedbythe sameleterare
notsignifcantlydiferentaccordingtoDunoantstest(q=o．05)
在含有蜡质的培养基中，黄 曲霉菌落生长直径
越小，抑制效果越明显。从表 2可见，黄曲霉在含有
9个品种种皮蜡质提取物的培养基中产生的菌落直
径大小有一定差异，但经方差分析，品种之间，品种
与对照之间的差异不显著。表明花生种皮蜡质提取
物对抑制黄曲霉的生长并不明显，且抗 -感品种的
差异不显著。
2．3去除蜡质或角质层对花生种仁黄曲霉感染和产
毒的影响
采用 1 mm针头将种皮刺破后，所有品种黄
曲霉感染率和黄曲霉毒素 B-含量均显著增加，表明
种皮是抗黄曲霉侵染和产毒的重要屏障。
用氯仿去除种皮的蜡质后，所有参试品种的种
子萌发率没有发生变化，但黄曲霉感染率和黄曲霉
毒素B-含量均显著增加，这表明去蜡能显著地提高
种子对黄曲霉感染率和产毒的敏感性 (表 3)。抗性
品种感染率平均增加 l倍，黄曲霉毒素B-含量平均
增加 6．2倍；而感病品种感染程度略增加，黄曲霉毒
素 B-含量平均仅增加 1．3倍。这表明抗性品种种皮
蜡质在抗黄曲霉侵染和产毒中发挥的作用较感病
品种要大。
用KOH处理去角质层后，9个品种黄曲霉毒素
B-的累积量较未处理组平均高 5．8倍，比去蜡处理
组平均高 2．6倍 (表 3)，表明角质层在种皮抗性中
发挥的作用比蜡质大。种皮去角质层后 抗性和感
病品种的黄曲霉毒素 B-累积量分别比未处理组增
加 7．1和 5．5倍，表明抗性品种角质层的抗黄曲霉
裹3氯仿、KOH、角质一处理后花生种子黄曲霉侵染率(IR)和黄曲霉毒素 B．含量(A)的变化
Table 3 Changesininfection rateOR)and aflatoxinBI content(A】aftertreaUnentwithchloroform，KOHand~ltinaseforpeanut seeds
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14 热带亚热带植物学报 第 11卷
能力比感病品种强。
如同时去除蜡质和角质层，即用氯仿处理去蜡
质后，再用 K0H或角质酶处理去角质层，黄曲霉感
染率和黄曲霉毒素 B-含量均显著增加 (表 3)。用
氯仿 +KOH处理和用氯仿 +角质酶处理所获的效
果差异不显著。感病品种处理后黄曲霉感染率和黄
曲霉毒素 B-含量与种子破损处理的差异不显著；
而抗性品种的差异达显著水平，表明抗性品种除种
皮外还存在其它的抗性机制。
2．4 各品种的种皮螬质超显微结构的差异
在电镜下，种皮表面的蜡质呈白色。从图版 I可
见，花生种皮蜡质呈不均匀和不规则分布，大部分
品种种皮的蜡质分布于种皮气孔周围，品种间种皮
的蜡质结构和分布存在较大差异。
从图版 I：A．D可见，感病品种种皮的蜡质很
少，且稀薄。而抗性品种的蜡质较多，且较厚，大部
分蜡质分布于种皮气孔周围，并将气孔封闭 (图版
I：E-L)，阻止病原菌丝的侵入。
3 结语
本研究表明花生种皮在抗黄曲霉侵染和产毒
中发挥机械性阻碍作用，而起作用的主要成份是种
皮的蜡质和角质层。品种抗黄曲霉侵染能力与种皮
表面所覆盖的蜡质的多少、角质层厚度有关。种皮
表面蜡质和角质层厚度可作为花生抗黄曲霉育种
的辅助标记之一。
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Milennium International Groundnut Workshop 【C】． Qingdao：
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图版说明
图版 I 花生种皮表面蜡质电镜扫描图
A．粤油 5号；B．湛油 30；C．粤油 l14；D．汕油 523；E．PI337494F；
F．J．1l；G VRR245；H．UF71513；L湛秋 48；J．J．1l； J-Il氯仿
处理；L V】 匕45．A-_I、l(，×3 000；J、L，×2000．
Explanationofplate
PlateI SEM of懈 OU seedcoat surfacesofp~nutcultivars
A． Yucyou 5：B．~ tnyou 30；C．Yuoyou lI4；D．Shanyou 523；
E．PI 337494F；F．J-Il：G．VRR245；H．UF7I5I3； L Zhanqiu 48；
J．J．1l：K．J-Iltreated、Ⅳith chloroform；L VRR245．
AtoIandl(’×3 000；JandL。×2 000．
囊逡、
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粱
Ll
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