全 文 ：收稿日期： 2013–06–06　　　　接受日期： 2013–07–14
基金项目： 国家自然科学基金项目(31200408)资助
作者简介： 赵灿灿(1982 ~ )，女，博士，讲师，主要研究方向为土壤生态学。
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: cczhao2008@163.com
热带亚热带植物学报　2014， 22(1)： 101 ~ 106
Journal of Tropical and Subtropical Botany
氚标记胸腺嘧啶掺入法在土壤细菌生长速率研究
中的应用
赵灿灿1,2*, 王伟2
(1. 中国科学院华南植物园， 广州 510650； 2. 河南大学， 河南 开封 475004)
摘要： 氚标记胸腺嘧啶掺入法因其原理明确、方法简单易行、重复性好等特点在测定细菌生长速率中发挥着重要的作用。然而，
相比较医学和水生生态学领域，该方法在土壤生态学研究中的应用还较少，尤其是我国此方面的研究尚未见报道。就氚标记胸
腺嘧啶掺入法的原理、操作流程、影响因素、计算方法及其在土壤生态学中的应用等方面进行了综述，为该方法在我国土壤生
态学领域的推广应用提供参考。
关键词： 土壤细菌；生长速率；放射性同位素；微生物功能；氚标记胸腺嘧啶掺入法
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2014.01.017
Applications of Tritiated Thymidine Incorporation in Determination of
Bacterial Growth Rate
ZHAO Can-can1,2*, WANG Wei2
(1. South China Botanical Garden, Chinese Academy of Science, Guangzhou 510650, China; 2. Henan University, Kaifeng 475004, China)
Abstract: Tritiated thymidine incorporation method plays an important role in determination of bacterial growth
rate, due to its clear principle, simple operation and good repeatability. However, there has been little research on
soil ecology using tritiated thymidine incorporation method for determination of bacterial growth rate compared
with medical science and aquatic ecology field. Especially studies on this area in China have been reported hardly.
The principle, operation procedure, influential factor and calculation method of tritiated thymidine incorporation
method were introduced, and its applications in soil ecology were summarized. These would provide reference for
the further applications of this technology in soil ecology.
Key words: Soil bacteria; Growth rate; Radioactive isotope; Microbial function; Tritiated thymidine incorporation
土壤微生物数量巨大、种类繁多，在陆地生态
系统中，对有机物质的分解、转化和传递，调控土壤
食物网的结构和功能等方面都起了重要作用。土
壤微生物中占优势地位的两个类群分别是细菌和真
菌，它们的生物量、群落组成和生长速率等存在着很
大的差异，在分解的不同阶段也发挥着不同的功能，
因此分别探究这两大类群的特性十分必要[1–2]。能
够测定细菌和真菌生物量和群落组成的方法有很
多，包括显微镜观察计数法、氯仿熏蒸法、磷脂脂肪
酸(PLFA)法[3]、葡萄糖胺法[4]和基于 DNA 的分子技
术[5]等。显微镜观察计数法主要应用于测定细胞数
量，具有方法直接、简单的优点，缺点是由于细菌个
体大小差异大，与生物量的转换系数精确度低；氯
仿熏蒸法主要用于测定微生物生物量，具有方法简
102 第22卷热带亚热带植物学报
单、经济，可同时操作大量样品的优点，缺点是不能
区分细菌和真菌生物量；磷脂脂肪酸(PLFA)法主要
用于测定微生物生物量和群落结构，具有可提取活
体微生物 PLFA，能区分功能群的优点，缺点是不能
精确到种水平；基于 DNA 的分子技术主要应用于
测定微生物生物量和群落结构，可精确到种水平，
但方法复杂，费用昂贵，不能区分功能群。但是在
自然界中微生物本身的生理状态是多样的，有的处
于休眠状态，有的较为活跃，有的高度活跃，生理状
态具有不确定性，因此上述方法不能将微生物与其
参与的生态过程直接地联系起来。近年来，一些学
者用微生物基础呼吸来估计微生物的生长速率，但
有研究表明由于碳底物分配在生物量和呼吸用能
量的比例不同，微生物呼吸与生长速率之间并没有
直接的联系[6–7]。因此找到一种合适的反映微生物
生长活性的方法十分必要。
氚标记胸腺嘧啶掺入法测定细菌生长速率是
真实反映细菌活性和功能的重要手段，它原理明
确，方法简单易行，有较好的可重复性，能真实反映
细菌生理状态。目前，这种方法已经广泛应用于医
学领域，并已于 20 世纪 80 年代应用在水生环境的
细菌生长速率研究中[8–9]，目前已经发展成为水生
微生物学的常规方法[10–13]。但是在土壤科学领域
中的应用还很少[14–15]。为此，本文对氚标记胸腺嘧
啶掺入法的基本原理、操作流程、影响因素、计算方
法及在土壤生态学中的应用等方面进行简要介绍，
希望能对土壤细菌的有机质分解过程、在污染土壤
中的耐受能力、土壤食物网结构和功能等研究领域
提供有益的参考，为推广氚标记胸腺嘧啶掺入技术
的应用提供理论支持。
1 氚标记胸腺嘧啶掺入法的基本原理
胸腺嘧啶是 DNA 合成必须的 4 种碱基之一，
将放射性同位素 3H 标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)
加入到土壤提取溶液中，当土壤溶液中的异养细菌
增殖时，3H-TdR 会掺入到细菌的 DNA 中，通过结
束时测定掺入 3H 的含量可以计算细菌的增殖速度。
胸腺嘧啶脱氧核苷酸的合成主要通过两条途
径，第一条为挽救途径(Salvage pathway)，即 TdR 在
胸苷激酶的催化下被磷酸化形成 dTMP，进一步合
成 DNA；第二条为重新合成途径(De novo pathway)，
即由一些合成前期的分子如氨甲酰磷酸或天门冬
氨酸等合成 DNA[16] (图 1)。通常情况下，TdR 很
图 1 DNA 合成的挽救途径和重新合成途径
Fig. 1 Salvage pathway and De novo pathway of DNA synthesis
第1期 103赵灿灿等：氚标记胸腺嘧啶掺入法在土壤细菌生长速率研究中的应用
顺利地通过挽救途径合成 DNA，但是在合成过程
中一些细菌会随着 TdR 浓度的下降而停止合成，重
新合成途径启动将 dUMP 转变成 dTMP，因此在计
算 3H-TdR 浓度时要综合考虑两种途径[17]。
此方法用到的 TdR 浓度较低(200 nmol L–1)，土
壤中的真菌、植物根系、土壤动物等高等生物在短
时间内并不能利用低浓度的 TdR，因为这些生物很
多没有胸腺嘧啶激酶，不会利用 TdR 合成 dTMP。
此外，DNA 的合成速率在加入 TdR 后至少 45 min
内是恒定的，这都为细菌生长速率的测定提供了基
础和前提。
2 氚标记胸腺嘧啶掺入法的操作流程
土壤溶液的制备　　称取新鲜土壤到离心管
中，加入去离子水，制成 1 : 5 土水比溶液，放置在震
荡器上以每分钟 200 次的速度震荡 20 min，制成土
壤悬浮液。将悬浮液在 1000 ×g 下离心 10 min 后，
大土壤颗粒沉淀到底部，取上清液作为供试细菌溶
液，得到的细菌溶液需在 15 min 内进行 3H 标记等
操作。实验用各种器皿都应经高温灭菌后方可使用。
3H-TdR 参与 DNA 的合成　　将细菌溶液在
室温中放置 10 min 稳定后，取 1.5 mL 细菌溶液于微
离心管中，将 5 μL 3H-TdR (25 Ci mmol–1, 1 mCi mL–1)
和 2 μL 50 μmol L–1 未标记的胸腺嘧啶加入到离心
管中，此时 TdR 终浓度为 200 nmol L–1，2 h 后加
75 μL 100% 的冰三氯乙酸(TCA)，此高浓度 TCA
可以立即阻止 DNA 的合成。对于空白对照样品，
应先加冰 TCA 阻止一切 DNA 合成，10 min 后加
细菌溶液和胸腺嘧啶，实验过程温度设定与原位土
壤温度一致[18]。
3H-DNA 的 提 取　　 早 期 的 学 者 利 用 过 滤
膜 清 洗 未 插 入 DNA 的 3H-TdR，Bååth 等[18]省 略
了过滤步骤，用更为简单经济的微离心法来提取
3H-DNA, 得到了广泛应用。样品稳定 30 min 后，
微离心管在 15000 ×g 下离心 5 min，弃上清液后加
1.5 mL 5% 的冰 TCA，再次离心弃上清液；再加入
1.5 mL 80% 的冰乙醇离心弃上清液后，加 0.2 mL
1 mol L–1 NaOH，在室温下过夜溶解大分子[19]。将
样品在 90℃水浴锅中水浴 2 h，冷却后转入闪烁计
数管中，并用 250 μL 0.1 mol L–1 NaOH 洗微离心管
2 次，加入液体闪烁液后用液体闪烁计数仪测定放
射性同位素 3H 的含量。
3 影响氚标记胸腺嘧啶掺入的因素
影响氚标记胸腺嘧啶掺入的因素很多，主要
包括： (1) 土壤有机质含量。土壤中含有有机质和
矿物质颗粒，因此确定土壤中细菌的生长速率不像
在水环境中那么明确，胸腺嘧啶和土壤颗粒之间的
连接具有不确定性[20]，可能导致 3H-TdR 加入零时
刻的放射量较高，降低了测量精度，因此在预实验
图 2 插入 DNA 的 3H 浓度与初始胸腺嘧啶浓度的关系。农田土壤的 TOC 含量为 0.89%、pH 值为 6.56，标准曲线在 x 轴上的截距将用于新放
射性浓度的计算。
Fig. 2 Relationship between 3H incorporation into DNA and initial concentration of thymidine. Total organic carbon (TOC) and pH value of selected
farm soil were 0.89% and 6.56, respectively. Intercept on the x axis of calibration curve were used to calibrate new specific activity.
104 第22卷热带亚热带植物学报
中设置不同 TdR 浓度测定 3H-TdR 加入零时刻的
放射量十分必要，为后面重新计算放射性浓度提供
数据支持(图 2)，一般有机质含量较高的土壤用量
要适当减少[18]。(2) 土壤 pH 值。土壤 pH 值过高
或过低都会影响微生物活性，例如有些酸化较严
重的松林土壤需根据需要调节 pH 值[21]。(3) 细胞
的大小。不同土壤中细菌细胞大小不一，会直接
对 3H-TdR 的掺入产生影响。小型细胞在数量上
要远远多于大型细胞，但小型细胞的生物量小，生
长速率低，对碳转化的贡献较小[22]。(4) 3H-TdR 参
与 DNA 合成的时间。3H-TdR 掺入的时间要适中，
如果太短 DNA 不能完成一个复制周期，一般一个
复制周期不少于 45 min；但如果时间过长，可能会
导致 3H-TdR 的逐步掺入而原浓度被稀释，不能以
正常的速度掺入 DNA，或者 3H-TdR 部分掺入到真
菌、原生动物和土壤动物等中(图 3)。(5) 温度。温
度由 0℃升高到 15℃，细菌生长速率随之增加，当
温度高于 15℃时，细菌生长速率不再增加较为恒
定[23]。(6) 细菌溶液的浓度和 TdR 的浓度都会对细
菌生长速率产生影响，实验前进行预实验确定土水
比、TdR 浓度、掺入时间、3H-TdR 加入零时刻的
放射量初始值等十分必要[24]。
图 3 插入 DNA 的 3H 浓度与掺入时间的关系
Fig. 3 Relationship between 3H incorporation into DNA and incorporation time
4 细菌生长速率的计算
4.1 计算掺入DNA的TdR量
SA =
μCi
nmol + [x]
(1)
T =
dpm
SA
=
dpm × mmol × 10–3
Ci × 2.22 × 1022 (2)
其中 SA 为胸腺嘧啶放射性浓度，Ci 为放射
性活性单位居里，[x]为标准曲线在 x 轴上的截距，
T 为插入 DNA 的 TdR 摩尔数。
4.2 计算细菌增殖数
N =
T × 318 × 1/p
w
= T × 5 × 1017 (3)
其中 N 为细菌增殖数，318 为 TdR 的分子量，
p 为 TdR 在 AGCT 中所占的比例，平均值为 0.25，
w 为每个细胞 DNA 的质量，一般在 1.7 ~ 5 fg 范围
内，平均值为 2.5 fg。
4.3 计算单位时间细菌增殖数
N/h =
dpm × 10–3 × 60 × 5 × 1017
SA × 2.22 × 1012 × t
=
dpm × 1.35 × 104
SA × t (4)
其中，N/h 为每小时的细菌增殖数，t 为掺入
时间(min)。
4.4 计算细菌生长速率和世代周转时间
μ =
N
Nt
， g =
ln 2
μ
(5)
其中，μ 为细菌生长速率，Nt 为现存细菌总数，
g 为世代周转时间。Nt 可通过荧光染色制片后用
紫外灯荧光显微镜观察计数等方法获得。氚标记
第1期 105赵灿灿等：氚标记胸腺嘧啶掺入法在土壤细菌生长速率研究中的应用
胸腺嘧啶掺入法计算细菌生长速率公式的转化系
数均为平均值，而实际情况是不同的生境、不同的
土壤类型的转化系数都会有较大变异，因此使用平
均值会降低估算精确度，在实验中可根据实际情况
调整转化系数。
5 氚标记胸腺嘧啶掺入法在土壤生态
　学中的应用
自 20 世纪 90 年代起，氚标记胸腺嘧啶掺入法
测定细菌生长速率已经应用于土壤生态学领域，着
重于解决生物与非生物环境对土壤细菌功能的影
响等科学问题，具体有以下 3 个方面：第一，细菌对
于土壤重金属污染的响应。随着人类工业化水平
的提高，重金属污染问题日益突出，土壤微生物对
此会做出怎样的反应？Díaz-Raviña & Bååth[25]对
镉、铜、镍、铅、锌 5 种人工重金属污染处理的研究
表明，加入重金属土壤的细菌生长最大速率远远高
于对照[26]，铜污染土壤的细菌生长速率在处理 1 个
月后达到最大，表明土壤细菌对铜污染很敏感，而
其它重金属污染处理中，细菌生长速率在处理 1 年
后才达到最大，表明土壤细菌对镉、镍、铅、锌污染
的耐受性较好。Pennanen 等[27]在芬兰和瑞士重金
属污染地区进行野外实验，研究表明土壤重金属污
染显著影响 PLFA 群落结构组成和细菌生长速率，
铜污染地区的细菌耐受性增加，而镉、镍、锌污染处
理对细菌耐受性没有显著影响，所有重金属混合
时的细菌耐受性最高[28]。第二，细菌活性对于土壤
pH 值变化的响应。土壤 pH 值是影响土壤微生物
群落结构和功能的重要因子。Rousk 等[2]在英国一
个定位观测站分别测定了 pH 为 4.0 ~ 8.3 范围内
的土壤细菌和真菌的生物量和生长速率，结果表明
pH 值从 8.3 逐渐降低到 4.0 时，细菌生长速率降低
了 5 倍而真菌生长速率升高了 5 倍，总体相当于近
30 倍的差异，而细菌和真菌的生物量仅有不到 3 倍
的差异，由此可见随着土壤 pH 值的降低总的碳矿
化速率降低，出现功能冗余现象。第三，细菌在植
物根际和非根际的不同作用。Christensen 等[29]的
研究表明，在根际以微生物为食的原生动物和线虫
数量是非根际的 3 ~ 4 倍，根际土壤细菌生长速率
比非根际土壤和没有植物种植的土壤慢，但是稳定
性极高，说明土壤食物网的动态变化不是上行效应
决定的。
氚标记胸腺嘧啶掺入法测定细菌生长速率以
其掺入速率稳定、方法简单易行和重复性好等特
点，为土壤生态学研究提供了很好的工具，并将在
多个研究方向发挥更重要的作用：第一，土壤是一
个巨大的碳库，有机质分解速率的微小变化会引起
大气成分和气候的较大改变，因此在大气层温度上
升、温室气体浓度上升和土地利用方式改变等全球
变化背景下，研究土壤细菌调节有机质分解和对大
气的反馈，对于阐明其内在机理和预测未来气候变
化具有重要意义。第二，土壤生物包括土壤细菌、
真菌、放线菌以及原生动物、线性动物、节足动物
等，种类丰富且数量巨大，这些生物交错联结，形成
错综复杂的食物网对土壤能量流动和物质循环起
决定性作用，探究土壤细菌的数量和生长速率对于
阐明底端资源(上行效应)还是顶端捕食者(下行效
应)决定食物网不同营养级结构和功能机理具有重
要贡献。第三，在陆地生态系统中，生产者通过地
上部分为系统提供有机物质，而分解者通过分解凋
落物和释放营养物质使得营养物质得以循环，研究
土壤最主要分解者细菌的生长和周转是整合地上
和地下部分生态系统功能和过程的有效途径。相
信在未来的时间里，氚标记胸腺嘧啶掺入法测定土
壤细菌生长速率会被更多的土壤生态学家所认识
并得到更加广泛的应用，为进一步丰富土壤生态系
统功能和过程的机理研究提供技术保障。
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