全 文 ：热带亚热带植物学报 2004，12(4)：367-370
Journa／of Tropical and Subtropical Botany
阳桃胚乳愈伤组织诱导和不定芽发生的研究
刘建福 吴 清2
(1．华侨大学生物工程系，福建泉州362021；
杨道茂 欧阳明安
2．四川省宜宾市园林管理局，四川宜宾644000)
摘耍：首次成功建立阳桃胚乳组织培养并获得胚乳再生植株。胚乳愈伤组织诱导以培养基MS+2,4一D2．0mgL-。+BA
0．2mgL-。的效果最好，诱导频率可达 94．7％，愈伤组织乳白色，结构致密，生长旺盛；将其接种在培养基MS+ZT
3．0mgL。+NAA0．2mgL-。上，愈伤组织由乳白色致密型转变为淡绿色致密型，进而形成绿色芽点，分化出不定芽，分
化频率可达73．3％；胚乳植株在培养基MS+ZT 2．O ．5 mg L- +NAA 0．05 mg L- 上进行壮苗和营养繁殖。
关键词：阳桃；胚乳；离体培养
中圈分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号：lOO5—3395(2004)04-0367-04
Callus Induction and Plant Regeneration from
Endosperm of Averrhoa carambola
LIU Jian—fu WU Qing YANG Dao．mao OUYANG Ming—an
(1．Department of Biology Engineering,Huaqiao University,Qull~OU362021，China；
2．Sichuan Yibin Gardens Bureau，Yibin 644000，China)
Abstract：Explants from endosperm of A verrhoa carambola were used to establish culture vitro and
regeneration system．Z e experiments showed thaf endosperm inoculated on MS medium supplemented with
2．0 mg I一-’2,4一D and 0．2 mg I一- BA，gave highest calus induction rate(94．7％)．The calus was milk white and
compact． n the endosperm derived callus was cultured on MS medium containing 3．0 mg I一- ZT and
O．2 mg I一- NAA， the calus became greenish and compact， the shooting frequency being 73．3％． Optimal
medium for multiplication ofplantlets was MS supplemented with 2．0-2．5 mg L。’ZT and 0．05 mg L—NAA．
Key words：A verrhoa carambola；Endosperm ；Tissue culture
阳桃(Averrhoa carambola)又名杨桃、五敛子、
三廉子，为酢酱草科阳桃属植物。阳桃的果实清甜
多汁，酸甜适度，风味可口，果形独特美观，含有人
体需要的多种维生素、氨基酸、矿物质及有机酸，具
有较高营养价值和药用价值[1一。但目前我国阳桃品
种质量差，果实小且种子多，这严重制约阳桃的生
产发展，急需加强优良品种的引种和选育工作，以
培育无籽果实和提高果实品质。
大多数被子植物胚乳为三倍体组织，三倍体植
物具有无籽特性，人们试图通过胚乳培养获得三倍
体植物，培育无籽品种。这方面在果树上取得了进
展【 ，本试验旨在建立阳桃的胚乳愈伤组织诱导分
收稿日期：2003-08-12 接受日期：2004一O1—17
基金项目：华侨大学科研基金项目(o3HZR 1)资助
化培养体系，为实现阳桃快速繁殖和选育优良品种
提供依据。
1材料和方法
1．1种子灭菌、胚乳获取
将阳桃成熟饱满的干种子去壳，在超净工作台
上，先用75％乙醇浸泡 10-12 S，无菌水冲洗2次，
再用0．1％HgCI2(加数滴吐温)进行 10 min的再次
消毒，无菌水冲洗4-5次，接种于MS培养基上萌
发。待种子萌发至胚乳开裂但尚未完全脱落时，在
超净工作台上剔除种胚，再将胚乳分段切取接种在
诱导培养基上。
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368 热带亚热带植物学报 第 12卷
1．2培养基及培养条件
基本培养基为MS，蔗糖浓度3％，并依试验目
的需要添加不同浓度的BA、ZT、NAA、2，4一D等植
物生长物质。所有培养基皆以0．7％琼脂固化，在高
压灭菌前将pH值调至5．8。每种处理组合中均加入
0．2％活性炭。培养温度 25+2~C，光照强度 1500—
2 000Ix，光照时间 12-14hd～，
1．3愈伤组织诱导
将获得的无菌胚乳接种在 MS分别添加 BA
0．1、0．2、0-3 mg L。(单位下同)，2,4-D 1．0、2．0、3．0
的诱导培养基中进行筛选。分为光培养和暗培养、
胚乳表皮朝向培养基和胚乳表皮背向培养基、萌发
前的胚乳和萌发后的胚乳进行愈伤组织诱导效果
的比较研究。
1．4愈伤组织分化、植株再生和倍性检测
将淡绿色致密的愈伤组织剔除褐色部分接入
分化培养基中，分化培养基是MS加上NAA 0．1、
0．2和 ZT 1．0、2．0、3．0、4．0、5．0，筛选出适宜的诱导
分化和再生植株培养基。取再生植株幼叶和根尖，
采用去壁低渗法进行细胞学鉴定，随机抽取20株，
每株观察 10个细胞。
2结果和分析
2．1不同植物生长物质配比的影响
胚乳愈伤组织诱导培养基的筛选结果表明：不
同植物生长物质配比，其诱导效果、胚乳愈伤组织
的生长速度及其表现都存在明显差异(表 1)。在无
植物生长物质的培养基中，胚乳局部边缘膨大，不
能形成愈伤组织；在2，4一D的培养基中，少数胚乳产
生乳白色愈伤组织，结构疏松，初始愈伤化时间较
早，生长迟缓，愈伤量少；而在 2，4一D与BA的培养
基中，愈伤组织诱导频率较高，生长旺盛，结构致
密，但存在褐化现象。由此可见，培养基必须附加
2，4一D才能诱导出胚乳愈伤组织。
2,4-D与BA配比结果表明：高浓度2,4-D与低
浓度BA配比，愈伤组织呈乳白色，结构疏松，愈伤
量少；相反，高浓度BA与低浓度2，4一D配比，愈伤
组织呈乳白色，结构致密，愈伤量多。两种植物生长
物质配比筛选，结果以2，4一D 2．0+BA 0．2效果最
好，诱导频率达94．7％，愈伤组织生长旺盛，呈乳白
色，结构致密，褐化程度较轻。
2．2不同胚乳培养方式的影响
胚乳采用表皮朝向培养基和表皮背向培养基
两种方式接入诱导培养基中，培养30 d，观察统计。
结果(表2)表明：以表皮背向培养基方式接种的胚
乳，切口边缘膨大较早，生长迅速，诱导效果好，诱
导频率达 100％，愈伤组织呈乳白色，愈伤量多且结
构致密。
光培养和暗培养下，多数胚乳都能产生愈伤组
织。光培养诱导结果较好，诱导频率达96．7％，愈伤
组织生长也较暗培养好，表现为生长迅速，愈伤量
多，呈乳白色，结构致密，褐化程度较轻。而暗培养
的愈伤组织为灰黑色、致密型、生长迟缓、愈伤量
少、褐化程度因颜色相近而不能辨别(表2)。当暗
培养的愈伤组织置于光照下，多数能转变为乳白色
致密型，恢复正常生长。
裹 l檀袖生长缅质配比对阳桃胚乳愈伤组织诱导的影响
Table 1 Efects of2，4-D and BA on calus induction from endosperm ofAverrhoa carambola
接种数为3O块Thirty explants were used for each experiment．
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第4期 刘建福等：阳桃胚乳愈伤组织诱导和不定芽发生的研究
萌发前的胚乳接种到培养基中无膨大现象，也
无愈伤组织形成，而萌发后的胚乳能形成生长状态
良好的愈伤组织，生长速度也较快，愈伤量多，诱导
效果好，诱导频率达 100％(表2)。由此可见，阳桃
成熟干种子的胚乳诱导愈伤组织需要借助胚的活
化作用。
2．3植物生长物质对愈伤组织分化的影响
将乳白色致密型愈伤组织转接到附加不同配
比ZT和NAA分化培养基上，培养20 d，多数愈伤
组织转变为淡绿色致密型，培养40 d，愈伤组织出
现绿色芽点，进而分化成芽，每块愈伤组织可形成
多个芽，有的芽点可形成芽丛。分化的芽多数生长
良好，形态正常，但也有畸形苗，表现为茎极度短
缩、叶片皱缩扭曲、难于展开、生长势弱。在培养中
未发现有根的分化。此外，分化培养时间稍长，其褐
化现象加剧，部分愈伤组织老化，分化能力也下降，
培养60 d统计分化频率和平均分化芽数。
从表3可见，以ZT 3．0+NAA0．2的植物生长
物质配比，分化频率最高，达73．3％，分化的芽形态
正常，生长旺盛，愈伤组织褐化程度轻。随着细胞分
裂素／生长素比值的增大，分化频率降低、褐化程度
加剧、愈伤组织老化、分化能力减弱、平均分化芽数
降低、畸苗率升高。因此，阳桃胚乳愈伤组织较适宜
的分化培养基为MS+ZT 3．0+NAA0．2。同时，培养
20 d进行继代，能较好地保持愈伤组织的分化能力。
2．4再生植株的倍性检测和壮苗
对再生植株的幼叶和根尖细胞进行染色体数
目检测，结果2n=2x=33的细胞数目占85．2％，证实
所得再生植株是来源于胚乳的三倍体而不是胚体
组织。刚分化的再生植株比较弱且茎干较短，不宜
立即进行生根诱导。在MS+ZT2．0-2．5+NAA0．05
培养基上进行培养，以获得健壮的胚乳苗；同时，还
能分化出不定芽，其增殖系数高，达5．7。继代培养
时可将不定芽连同其基部愈伤组织切下并接入培
养基中繁殖。2-5 cm高的健壮胚乳苗既可继续进行
扩繁，又可进行生根培养。
3讨论
3．1原位胚在胚乳培养中的作用
原位胚在胚乳愈伤组织诱导过程中的影响，主
要取决于接种时胚乳的年龄或生理状态。处于旺盛
生长阶段的未成熟胚乳，只要条件合适，无须原位
胚的参与就能脱分化而形成愈伤组织，这已在苹
果、猕猴桃、柚、橙和核桃等的胚乳培养中得到证
实 。而完全成熟的胚乳，尤其是干种子中的胚乳，
其生理活性十分微弱，在诱导其脱分化形成愈伤组
织之前，必须借助于原位胚的萌发，产生所谓的“胚
因子”使其活化嘲。本试验证明：在适宜培养条件下，
表2 不同胚乳培养方式对愈伤组织诱导的影响
Table 2 Efects ofculture method on calus induction from endosperm ofAverhoa carambola
接种数为30块Thirty explants眦 used for each experiment．
表3檀物生长物质对胚乳愈伤组织分化的影响
Table 3 Efects ofgrowth regulators on shoot formation from endosperm induced calus ofAverhoa carambola
植物生长物质(rng L’)
Growth regulators
出芽的愈伤组织 (块)
No．ofshooting caluses
愈伤分化频率(％) 平均每块分化芽数(个)
Shooting frequency Mean no．ofshoots per cxplant
接种数为30块Thirty explants werc used for each experiment
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370 热带亚热带植物学报 第 l2卷
接入处于尚未萌发或萌发初期的胚乳，不能诱导出
愈伤组织，而萌发后的胚乳却能形成愈伤组织，而
且诱导频率高达 100％，愈伤组织的生长势表现良
好。此结果支持 Srivastava的观点【91，他认为原位胚
的参与之所以能对胚乳产生活化作用，是因为胚在
萌发时产生某种物质，即所谓“胚因子”。因此，阳
桃成熟干种子的胚乳诱导愈伤组织需要借助原位
胚的活化作用。
处于旺盛生长期的胚乳，在离体条件下最容易
诱导产生愈伤组织。因此，在胚乳培养中，旺盛生长
期是取材的最适期。处于发育早期的胚乳，不仅接
种操作不便，而且愈伤组织诱导频率很低，如不同
细胞期的红江橙胚乳(核型)，前期的愈伤组织诱
导频率不到中后期的一半[1Ol；青果期的枸杞胚乳
(细胞型)愈伤组织诱导频率显著低于变色期和红
果期 “1。而接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱
导频率又因材料不同而不同。有些植物如猕猴桃【】 ，
其诱导频率很低甚至不能产生愈伤组织；而一些大
戟科[9l、檀香科植物 31，它ti]的成熟胚乳不仅能产生
愈伤组织，而且其中有些还能表现不同程度的器官
分化，产生完整的再生植株。
3．2胚乳培养中植物生长物质的优化
植物生长物质对胚乳愈伤组织的诱导和生长
起着十分重要的作用。在没有任何外源植物生长物
质的培养基上，柚、苹果、枸杞和橙等胚乳皆不能或
极少产生愈伤组织[9l。在培养基中生长素和细胞分
裂素的合理搭配，其效果显著优于使用单一的生长
素或细胞分裂素。另外，有些植物对植物生长物质
的种类还有特殊要求，如大麦只有在添加一定2，
4一D的培养基上才能产生愈伤组织；在猕猴桃胚乳
培养中，玉米素则是效果最好的【 ；而枣胚乳培养则
没有特别的要求【 51。此外，有机添加物是某些植物愈
伤组织诱导和生长所必需的【 。本试验证明：高浓度
BA与低浓度 2，4一D配比有利于诱导愈伤组织，在
没有添加植物生长物质的培养基上，不能产生愈伤
组织。
本试验结果表明：随着ZT AA比值的增大，
分化频率降低、褐化程度加剧、愈伤组织老化、分化
能力减弱、平均分化芽数降低、畸苗率升高。这说明
并不是细胞分裂素／生长素的比值越高越有利于愈
伤组织的脱分化。这可能是细胞分裂素的增加，促
进了愈伤组织中混倍体及非整倍体细胞比值的增
加，导致愈伤组织的分化能力下降或分化植株表现
为畸形。因此，对于植物生长物质在阳桃组织培养
中的作用机理还有待更深入的研究。
参考文献
【l】China Tropical Horticultural Society．South China Fruit Cultural
Practice：Averhoa carambola【M】．Beijing：China Agricultural
Press．2000．1 53一l 80．(in Chinese)
【2】 Xiao B S(肖邦森 )，Xie H H(谢红辉 )，Lei X T(雷新涛)．
Cultural Practice of A verhoa carambola【M】．Be ng：China
Agricultural Press．2001．166一l8O．(in chinese)
【3】Li J H(李继红)，Shao H S(邵寒霜)，Huang G X(黄贵修)．Rapid
regeneration of in vitro cultured shoot tip of Averhoa carambola
【J]．China Fruit(中国果树)，1999，4：37．(in Chinese)
【4】 Zhang Q(张琴)，Yan Y(闰勇)，Liang G L(梁国鲁)．Calus
induction and triploid plant regeneration from endosperm of
Pa~siflora edulis【J】．J Southwest Agri Univ(西南农业大学学
报 )，2000，22(5)：398—399．(in Chinese)
【5】Zhuang D H(庄东红)，Masashi Ishida．Changes in chromosomal
ploidy in regenerated plant obtained from cultured endosperm of
Diospyros kaki【J】．J Shantou Univ(Natl Sci)(汕头大学学报自
然科学版)，l99：，10(1)：42-47．(in Chinese)
【6】Peng X J(彭晓军)，Wang Y Q(王永清)．Calus induction and
regeneration from endosperm ofloquat【J】．J Sichuan A Univ
(四川农业大学学报)，2002，20(3)：228-231．(inChinese)
【7] GmiferJr FG，LjngXB，DenXX．Induction oftriplond
plants from endosperm caili in vitro【J]．Theor Appi Gent，1990，
80：785—790．
【8】Zhu D Y(朱登云)，Li J M (李浚明)．The historical and current
status of endosperm culture in angiosperms[J]．J Agri Bioteeh(农
业生物技术学报)，l996，4(3)：205-216．(in Chinese)
【9] Srivastava P S．JohriBM．Triploidplants ofPutranjiva roxburghi
from endosperm【J】．Beitr Biol Pflanzen，1998，54：381-397．
【10】Chert RZ(陈如珠)，Lj G G(李耿光)，Zhang LY(张兰英)．
Initiation of calus an d triploid plant from endosperm of Citrus
sinensis Osbeck【J]．Atca Bot Sin(植物学报)，1991，33(11)：
848-854．(in Chinese)
【ll】Wang LY(王立英)，Lj J(李健)，Wang J X(王锦秀)，et a1．
Preliminary study on endosperm culture vitro from diferent
developmental stages of Lycium barbarum [J】．Ningxia A
Scitechn(宁夏农业科技)，1999，(4)：12—15．(in Chinese)
【12】Mu S K Fraser L G，Harrey C F．Initiation of calus and
regeneration ofplantlets from endosperm ofA ctlnidia interspeeife
hybrid ．Sci Horticul，1990，44：lo4一l17．
【13】Lakshmi SitaG，RaghavaRamNV，VaidyanathanC S．Triploid
plant from endosperm culture of sandalwood by experimental
embryogenesis【J]．Plant Sci Lett，l998，20：63-69．
【14】ChikkanaihP S，GayatriMC．Organogenesisinendospermtissue
cultureofCodiaeum variegatumBlum叨．CurrScL 1994,43~3-24．
【15】ShiYP，WangQS．Studies onbiologyofendospermplantsin
Zizyphus sativa【Al In：International Symposium on Horticultural
Germplasm Cu ltivated and wildPartI．Fruit Trees tC1．Beijing：
International Academic Publishers．1988．398 ．
维普资讯 http://www.cqvip.com