全 文 ：热带亚热带植物学报 2002，10(1)：58—62
Journal{4 Tropical arm Subtropical Botany"
少花龙葵毛状根的诱导和次生代谢物的产生
龚玉莲 ’ 施和平
(华南师范大学生物系
李 玲 潘瑞炽
广 东 广州 51063I)
摘 要：研究 了发根农杆菌 ( grohca．terium rh&ogenes)对 少仡龙葵 【sr m pholeitmctvptcrt)的转化和毛状
根的诱导 ，分析了影响转化的因 素．并初步检测了毛状根的生长和次生代谢物的产生 。发根农杆菌菌株
R．000、Rl601分别感染少花龙棼的I1l片 、茎段 ．约 7 d后得到毛状根 。菌株 R．000感染的外植体的生根率
分别 为 90．2％和 50．0％．根诱导频率分别为 6．2和 4 6；菌株 Rl601感染的外植体 的生根率分别为 92．1％和
49．2％，根诱导频率分别为 6和 5．5；对照两周内不 出根。冠 瘿碱检测证实所得毛状根为转 化根 。感染在
MS+PPⅧ培养基上生长的矮壮苗叶片，毛状根诱 导频率显著提高；用 MS液体培养基稀释 l倍的菌液感染
叶片 ．转化效率也得至 提高。毛状根生长速度快 ，培养 4周后干重增加 420倍 ，总糖苷生物碱和皂甙含量分
别为原植株根的 3l和 l07倍。
关键词 ：发根农杆菌；少花龙葵 ：毛状根 ：次生代谢物
中国分类号 ：Q943．1 文献标识码 ：A 文章编号 ：1 005—3395(2002)0l一0058—05
Induction of Solanum photeinocarpum H airy Roots and
Production of Secondary Metabolites
GONG Yu一1 ian SHI He—Ping LI Ling PAN Rui—chi
t pnn Ⅲ q B Sol~h Chin~N⋯ d Lrm,er~it),Guangzhou 5、063 1．China)
Abstract：Genetictransformation ofSolanum photeinocarpum byAgrohacterium rhizogenes R1000 and
R1601． the efects of some factors on tran sformation efficiency and the production of secondary
metabolites by hairy root culture were studied Hair),roots were induced from leaf an d stern explan ts
with A． rhizogenes strain R1000 and R1601 ca 7 days after inoculation Hairyroot frequencies
obtained from leaf and stem explan ts inoculated by R 1000 harboring the agropine type Ri plasm id
pRiA4b were 90 2％ an d 50 0％． respectively． while those by R 160 1 with the agropine-type Ri plasm id
pRi1 500 and pTVK291 were 92．1％ an d 49．2％ ． respectively． Opine analysis indicated that T·DNA
genes ofA rhi：ogenes strain R1000 an d R1601 were expressed in S．photeinoccapum hair)roots Hairy
root-inducing frequencyof leaf explan ts from S．p]mteinoearpum grown on M S medium supplemented
th PP 3 was remarkably increased， and that of leaf explants inoculated by doubled diluting
agrobacterium liquid on M S liquid medium was also increased． Hairy"roots grew rapidly and the dry
weight increased by 420 times alter culture for 4 weeks，and the dry weight contents of total
glycoalkloids and saponins were 3l and 107 times higher than those ofthe original ones，respectively．
Key words： mu photeirmcarpum；Agrobacterium rhizogenes；Hairy roots；Secondary
．
metabolites
发根农杆菌 Ri质粒的 T—DNA在高等植物的 DNA中整合并表达 ，产生具有激素 自主型生长 、
收稿 日期 ：200l一02一∞ 接受日期：200l一07一l1
基盒项 目：广东省重点科技项 目【5990401)；广东省 自然科学基金(9942l6)资助
·现在通讯处 广东教育学院生物系，广州 510310
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 】期 龚玉莲等：少花龙葵毛状根 的诱导和次生代谢物的产生
多根毛 、多分枝、无向地性 、易再生成植株等特点的毛状根Il。建立发根农杆菌 Ri质粒对高等植物
的遗传转化系统 ，对于外源基闲导人的研究有重要意义。目前应用 Ri质粒系统转化成功的植物很
多 毛状根具有激素 自主型、稳定性 、高产性等优点 ，因此应用毛状根生物技术在植物次生代谢物
的生产方面有着广阔的前景 l
少花龙葵是传统的中草药，具有清热解毒 、散血消肿等功效 ，其总糖苷生物碱(total
glycoalkloid)和皂甙具有抗炎 、抗过敏、抗菌 、强心、刺激造血系统等药理作用 但未见少花龙葵遗
传转化及其毛状根的报道 本文研究了发根农杆菌对少花龙葵的遗传 转化和毛状根的诱导 ，以及
影响转化的因素 ，并初步检测 了其毛状根的生长和次生代谢物的生产。
1 材料和方法
细菌菌株及其培养 发根农杆菌(Agrob r~terium rhizogenes)RIO00和 R1601在 AB+100mgL-‘
Km(卡那霉素)的斜面培养基 上培养、保存 感染前挑取单菌落接种于 YEB+100mgL Kin的液体
培养基中、28~C、160 r mbr。振荡培养 30 h，得到活化的菌液。
植物材料的培养 少花龙葵 (Solarium photeim~carpumNakamura etOdashima)的果实采 自华
南师范大学校园 内 种子先用 70％酒精浸泡 15 S，再用 0 1％ HgCI 消毒 10rain，无菌水漂洗 5次 ，
置于MS基本培养基上萌发 按谭文澄的方法 获得无菌苗 ，在 25_+1~C、光强 350 m01 m ～、
12 hd 条件下培养，每月继代 1次 。
毛状根的诱导与培养 将少花龙 葵叶片切成 0．5—1 c 小块 ，于 MS基本培养基上预培养
48 h，再在 已活化的菌液 中浸泡 5rain，取 出吸干表面菌液 ，置于原培养基上共培养 48 h．然后转人
MS+500mgL 头孢噻肟~fl(Cefotaxime)培养基中除茵。将少花龙葵的节间切成 1-2 cm长的茎段 ，
倒插于 MS基本培养基中、用接种环在茎段的形态学下端涂上已活化的菌液 ，共培养 48 h，转人
MS+500 mgL 头孢噻肟钠培养基中除菌。在 25℃、散射光(12 h )条件下诱导毛状根。对照用不
含农杆菌的 YEB+100 mg L Km处理 两周后统计生根结果 切下毛状根转人 MS+500 mg L-。头
孢噻肟钠培养基 中彻底除菌。
冠瘿碱检测 参照 Elis等[61的方法 。纸电泳条件为 ：20V cm-。，时间 60rain
影响转化 的因素 测定在 MS+I mg L～PP3∞(Paclobutrazo1)培养基上生长 1个月的少花龙
葵矮壮苗的叶片直径、叶绿素含量(voc一1型数字显示叶绿素测定仪，上海第二光学仪器厂)和转化
效率 、对照为 MS基本培养基 生长的少花龙萎叶片。用稀释菌液(用 MS基本培养基稀释 l倍 的
菌液 )感染叶片 ，对照为原菌液感染叶片。转化过程同前 。
毛状根的生长和次生物质含量的测定 切取毛状根于修改的 MS培养基 (KNO，、NI-LNO 的
浓度为 MS培养基的 1／5)中液体培养 、25℃、100 rrain 条件黑暗培养 ，4周继代 1次 ，每周 取样测
定鲜重、干重 ；对照取少花龙葵无菌苗的根进行培养 总糖苷生物碱 、皂甙的提取参照 Ehrnkedr~的
方法 、生物碱检测用碘 一碘化钾试剂、碘化汞钾试剂 I。
2 结果和分析
2．1 毛状根的诱导和培养
发根农杆菌感染少花龙葵叶片 3—4 d．外植体膨大，形态学下端有少量白色或淡黄绿色愈伤组
维普资讯 http://www.cqvip.com
热带亚热带植物学报 第 1 0卷
织产生 ，而上端切 口处的愈伤组织 出现较晚 感染 1周后发生毛状根 ，主要由切 口处长出，下端 比
上端生根早 、多 根白色、密集丛生 ，多根毛、多分枝 、无向地性(图版 I：2,3)；生长迅速 ，多次继代仍
能保挣 上=述性状(图版 I：4)。对照两周 内未生根，两周后才略有膨大或不膨大(图版 I：1)，有 3个
外植体上长 出 3条根 ，分支少、生长慢甚至停滞，具有明显的正I句地性。
发根农杆菌感染少花龙葵茎段 3 d后 ，形态学下端开始膨大，并产生愈伤组织 ，6—7 d后在愈伤
组织处长出辐射状丛生、白色 、多根毛的根(图版 I：6)。对照茎段两周 内未 见生根 ，仅下端略有愈
伤组织形成 (图版 I：5)
从表 1可见 ，发根农杆菌 R1000和 R1601对少花龙葵叶片的致根能力高于茎段，但菌株之 间
无显著差异 。
表 1发根农杆菌 RIO00和 R1601感染少花龙葵叶片和茎段的生根情况
Tabte t叫 uct Lon ofhairy rootsfrom leafand stem cxptants ofSobmwn 抛 l删 呷 爪
infected by P⋯ rh／zo6,en~ R LO~O and R1601
根诱 导{颠率 ：平均每个外植体的生根数 Mean number ofroots produced one explant
值得注意的是 ，叶片在转化操作过程 中出现部分褐化甚至死亡的现象 ，而感染后存活的外植
体全部能生根。
2．2 冠瘿碱检测
由图 1可见 ，发根农杆菌感染少花龙葵叶片和
茎段后产生的毛状根 ，均能合成农杆碱和甘露碱 ，
而对照根未能检测出 ．初步表明 Ri质粒 中 T-DNA
编码的冠瘿碱合成酶基因已在少花龙蕾细胞 中表
达 。 2 a 4 5 6 7
圉 t少花龙葵 毛状根的纸 电泳 图
^
_
HS
2．3影响转化的因素 ： ： ：
PP 3处理使少花龙 葵苗矮壮 ，生长慢 ，粗壮 ，t R L60t诱导叶片形成的毛状根Hairy rootsfrom leafexplains
叶色浓绿 与对照相比．叶片直径增大了 28．4％，叶 ind
。
uce d by
。 三 ：嚣： 甚 翟
绿素含量增加了 54．6％，株高仅为对照的 44 1％ 形成的毛状根Hairy roots from stem cxp]ants induced by
发根农杆菌R1000 R1601转化矮 苗口=}片 。1 601 ；． 刚ind。u ced诱b导y R]段0形0：成! 虢
的结果如表 2，表明外植体的生理状态对转化有一 № ．仃a ro 。d o0b(c。nl 1)；7标准品St d删．A：农扦碱
定影响。 Authentic agropine；M一甘露碱Man 叩i【le；NS：中性糖Neutral
用 1／2浓度的发根农杆菌 RIO00和 R1601菌
液转化叶片的结果如下：对照的存活率分别 为 81_]％和 87．5％．生根所需 时间均为 7 d，生根率分别
为 81．3％和 87．5％，根诱导频率分别为 5．2和 5 7；处理的存活率分别为92．6％和 100％．生根所需时
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 1期 龚玉莲等：少花龙葵 毛状根的诱导和次生 代谢物的产生 6J
间均为 6 d．生根率分别为 92．6％和 100％．根诱导频率分别为 7 1和 8．2。这表明菌液浓度也能影响
转化效率 ，稀释菌液的转化致根能力较未稀释的好。
衰 2发根农杆菌 R1000和 R16Ol感染少花龙葵雉壮 苗叶片的生根情况
Table 2 Induction of hairy rootsfrom theleaf"ofdwarfseedling Of phf-teim~ 一 inoculatedwith^ rMzogenes R100(I andRI60
同 表 【。 Same asinTable
2．4 毛状根的生长和次生代谢物的产生
培养 4周后 ．毛状根的鲜重增加 453倍 ，干重增加 420倍 ，生长速度达 0．3 gDW L d～。继代 7
个月仍能保持快速生长、多分枝 、无向地性 的特性 ，且未见愈伤组织分化。对照的生长慢甚至停滞，
鲜重仅增加 1．9倍 ，干重增加 2倍，
少花龙葵毛状根及对照的酸提取液与碘 -碘化钾试剂 、碘化汞钾试剂反应结果均为阳性 ，表明
含有生物碱 培养 4周的毛状根粗总糖苷生物碱含量 为 41 mgg。DW．为对照的 31倍 ，皂甙含量为
1 8 mg g～DW ，为对照的 107倍
3 讨论
发根农杆菌 R1000具质粒 pRiA4b 。发根农杆菌 R1601也具质粒 pRiA4b，并且其中的 Hind gl
片段 2l上整合有NPTlI基因，染色体背景与 c 相同 该菌还具有超致病根癌农杆菌pTiBo542的
Vir区的粘性质粒 pTVK29F。ul。本实验 中发根农杆菌感染少花龙葵叶片和茎段产生的毛状根均 由
切 口处的愈伤组织上发生 ，但偶有 毛状根从叶片非切 口处长 出，这可能是由于叶片在操作过程 中
因机械损伤而感染发根农杆菌所致 叶片和茎段均以形态学下端生根较多 ，可能与生长素的极性
运输有关 ”。感染后只得到一种形态的毛状根，这与少花龙葵的近种龙葵(Solarium 呐 r)的转化结
果类似 、但转化效率比龙葵原生质体高” 。
PP 在离体培养中具有使试管苗矮壮 、改善试管苗生长状况的作用㈣。用矮牡苗叶片进行转
化，外植体存活率提高，有助于克Nn-t一片在转化操作过程中出现褐化甚至死亡的问题。
菌液浓度是转化过程中常常被调整的因素。菌液浓度过高，发根农杆菌生长过快，不易被抗生
素杀死．易导致外植体受到伤害、发生褐化甚至死亡；菌液浓度过低，又无法感染外植体。用 MS基
本培养基稀释 1倍的菌液感染少花龙葵叶片．转化效果较好
少花龙葵毛状根培养物生长快，能长期保持其毛状根的特性+有较强的次生代谢物合成能力，
具有生产次生代谢物的可能性。
参考文献：
【l】wh F F Nes~r E W Hairy root；plasmid encodes virulence traits in m r rhlzngene c【 J Bacterio1．1980．141：I134
Il4l
【2】TeperD Gertefictrartsform~ion using^ ’ m Ⅲ rhizoge~s⋯ Physiol Plant，1990，79：lO4_I46．
[3 J 周立 刚．王君健，杨崇仁 植物毛状根的培养及其化学 进展 ：f植物毛戢根的诱导形成与培养 [J】天然产物研究 与开发 ．1998
维普资讯 http://www.cqvip.com
热带亚热带植物学报 第 10卷
10(3)：87—95
【4】谭文澄 }届六种植 物的组织堵养 【J]植物生理学通讯．1 984 1：38—41
【8】《广东 中药志》编辑委员会 r东中药志(第二卷)【M】广州 ：广东科挂 出版{十．1996
【6j EllisD，Roberts D．SuRon B．et al Transformation ofwhite spruceand other conifer species by rhiz r,ge~*【 Plant
Cell Reports．t989．8 16—20
[7]Ehmked A．Ohm stede Elilert U Steroidal glycoalkaloids in cell and shoot teratoma cultures of&Jlammt， ⋯ n⋯ Plant Cell，
Tissue and Organ Culture．1 995．43：l 9l—l 97
[8]郭晓庄 有毒中草药夫司媳 【M】天津 ：太津科技翻译山版公司．1992
【9] White E F．Taylor B H．Hufman G A．et al Molecular and genetic analysis ofthe transfered DNA regions ofthe root·inducing
plasmid of4grohtu：Ierium rhizoge r*e‘lJj J Bacterial，【985．164：33—44．
【10】Pythoud F．SinkarV P．Nester Ew．et al Increased virulence of 48r~d,fu ⋯ rhlzogene~confered bythe vir region ofpTibo542：
app[ication to genetic engineering ofpop[ar[J]BicCTechn．1987．29(5)：1 323—1327
[【1]施和平 发根农杆 曲对黄瓜的遗传转化厦毛状根 中内源激素的变化 【D】_广州 ：华南师范大学博_L研究生毕业论文 ．t996．
[t2】Mugnier J Establishment ofnew axenic hairy root lines by inoculation with Agr．h r~leritm rt~zogenes[J]Plant Celt Reports，1988
7：9一l 2
【1 3】赵成章 ，部康 乐．戚秀芳 多效唑对水稻末成熟肛愈伤组织诱 导、分化和壮苗 的影响 【J Jl植物学报 ，1990．32(5)：407-409
图版说明
图版 I
1对照．培养 2周的步花龙葵叫H：
2发报农朴苗 Rl 00O感染 2周后的少花龙葵口l片诱导出的毛状根
3．发根农扦凿 R1601感染 2周 鹋少花龙蘑叶片诱导 鹋毛状根：
4．枉修改：titMS液体培养基上生 K 4周 的少弛龙葵毛状根
5．对照，培荐 2周的少艳龙葵茎殷 ；
6．发根农杆 闰R l6Ol感染 2周后 的少花龙蓥茎段诱导 的毛状帐
Explanation ofplate
PlateI
1 C,~nfol leaf golr~ rn p Omlelmu：~pmn atler cuIture far 2 v／eeks；
2 Hair；,rootsinducedfrom [eafofS．photein ~c．TJum infected by Agroh uteri~ rhizt~genes strainR]000 after culturefor2weeks；
3 Hair},rootsinducedfrom [eafofS ^ Ⅱm infected by strainR】60l aRer culturefor 2weeks；
4 Hairy roots cultured onmodifedM Sliquidmedium for4weeks；
8 Control stem of．8．pl~,seim,rfuFum aftercu[turefor 2weeks；
6 HaiDroots induced from stem ofg ，。 r·J⋯ 1 m infected by strain R160[ater culture for 2 weeks
维普资讯 http://www.cqvip.com
王润辉等 ：莉竹属和牡竹属【竹亚科)叶表皮微形态特征
WANG Run-hu[吐 a1． Micromorphotogical Study OlLeafEpidermisofBmnb~ and 谳 r ‘t出m
(Poaceae：Bambusoideae)
See explanation a【the end of text
图版 l
P]ate I
维普资讯 http://www.cqvip.com