全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (8): 1216~1222　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.00331216
收稿 2014-01-26　　修定 2014-06-25
资助 国家自然科学基金面上项目(30671312)。
致谢 感谢中国农业科学院油料作物研究所魏文辉博士及其实
验室给予的技术和设备上的帮助。
* 通讯作者(E-mail: wanglijun@caas.cn; Tel: 027-86711930)。
白菜rDNA及C0t-1 DNA的荧光原位杂交及其核型分析
吴春红1, 范双莉2, 王力军3,*
1河南理工大学图书馆, 河南焦作454000; 2济源职业技术学院护理系, 河南济源459000; 3中国农业科学院油料作物研究所/油
料作物生物学与遗传改良农业部重点实验室, 武汉430062
摘要: 以早熟白菜苔为实验材料, 从其基因组DNA中分离出C0t-1 DNA并用生物素标记作探针, 25S rDNA用地高辛标记作
探针, 对有丝分裂中期相染色体进行双色荧光原位杂交。每对染色体上均显示出了特定的C0t-1 DNA荧光原位杂交带型, 5
对染色体上显示出了25S rDNA荧光原位杂交带型。双色荧光原位杂交证实了C0t-1 DNA与25S rDNA二者具有一致的染色
体位置特征, 表明基于rDNA及C0t-1 DNA的荧光原位杂交核型分析技术, 优于目前普遍采用的只基于rDNA的荧光原位杂
交核型分析方法。结合C0t-1 DNA与25S rDNA的荧光原位杂交带型和传统的染色体的形态学标记分析方法及白菜已公布
的基于rDNA分布的核型分析结果, 创建了一个精确的白菜核型。
关键词: 白菜; rDNA; C0t-1 DNA; 荧光原位杂交; 核型分析
Fluorescence in situ Hybridization and Karyotyping Analysis of rDNA and C0t-1
DNA in Brassica campestris
WU Chun-Hong1, FAN Shuang-Li2, WANG Li-Jun3,*
1Library of Henan Polytechnic University, Jiaozuo, Henan 454000, China; 2Nursing Department, Jiyuan Vocational and Technical
College, Jiyuan, Henan 459000, China; 3Institute of Oil Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Bi-
ology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China
Abstract: With Brassica campestris cv. Zaoshu baicaitai as experimental material, C0t-1 DNA was isolated
from the genomic DNA and labeled with Biotin-Nick as a probe, while 25S rDNA was labeled with DIG-Nick.
Fluorescence in situ hybridized to the mitotic metaphase chromosomes of B. campestris showed the specific
fluorescence bands of C0t-1 rDNA on each chromosome pair. However, the specific fluorescence bands of 25S
rDNA were detected on 5 chromosome pairs. The dual fluorescence in situ hybridization confirmed the C0t-1
DNA and rDNA had identical chromosome sites. And also the karyotyping technique based on a combination of
rDNA and C0t-1 DNA chromosome landmarks was superior to alone one. Based on a combination of rDNA
sites, C0t-1 DNA fluorescent bands, chromosome lengths and arm ratios, a more exact karyotype idiogram of B.
campestris was described.
Key words: Brassica campestris; rDNA; C0t-1 DNA; fluorescence in situ hybridization; karyotyping
当前, 以甘蓝(Ayele等2005)和白菜(Yang等
2005)为代表的国际芸薹属植物基因组计划正在全
球迅速展开。在植物基因组中研究最广泛的重复
序列就是核糖RNA基因(rDNA)。通过荧光原位杂
交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术将
rDNA在染色体上进行定位, 可以为核型分析提供
有效的细胞学标记。人们已成功地利用FISH技术
定位了小麦(徐川梅等2007)、大麦(赵丽娟等2005)
及甘薯(安婷婷等2012)等的rDNA。芸薹属植物
rDNA原位杂交进行核型分析也有很多成功的报
道(Koo等2004; 轩淑欣等2007), 然而用rDNA作为
染色体识别标记也有其致命弱点, 因为rDNA只分
布在物种的部分染色体上, 不容易鉴别出所有染
色体。
C0t-1 DNA是物种基因组中所有的高度重复
序列及中度重复序列, 它的最佳长度为100~300
bp, 符合作为荧光原位杂交探针的条件。目前, 仓
鼠和家鼠等动物已经有商品化的C0t-1 DNA, 绝大
多数植物的C0t-1 DNA则由研究人员自己制备。
吴春红等: 白菜rDNA及C0t-1 DNA的荧光原位杂交及其核型分析 1217
C0t-1 DNA作为探针在染色体上显带的技术在人类
染色体研究中已有报道, 然而它在植物染色体研
究中的应用却很少报道。Zwick等(1997)用山地棉
(Gossypium arboreum) C0t-1 DNA作为探针, 运用
FISH技术对其在基因组的分布作了初步研究。
Wei等(2005)和王太霞等(2006)利用FISH将C0t-1
DNA定位于甘蓝型油菜(Brassica napus)和甘蓝
(Brassica oleracea)的中期染色体上, 利用其在染色
体上杂交的带型首次构建了甘蓝型油菜和甘蓝每
条染色体上都有杂交信号的核型, 开创了利用C0t-
1 DNA显带对植物进行核型分析的先河。
白菜的rDNA FISH显带已有报道(Koo等2004;
轩淑欣等2007), 但C0t-1 DNA和rDNA的双色FISH
显带还未见报道。本试验以C0t-1 DNA和25S
rDNA的双色FISH为基础, 结合传统的染色体的形
态学标记分析方法及白菜(Koo等2004)已公布的基
于rDNA分布的核型分析结果, 创建一个精确的白
菜核型。
材料与方法
1 实验材料与染色体制片
早熟白菜苔(Brassica campestris cv. Zaoshu
baicaitai)购自市场。种子于室温下萌发生长, 取幼
嫩花蕾用于制片, 幼叶用于提取基因组DNA并制
备C0t-1 DNA。25S rDNA探针由波兰Silesia大学
Robert Hasterok博士提供。
染色体制备参照魏文辉等(2000)及Wei等
(2003)方法, 略有改动。取早熟白菜苔的幼嫩花蕾
放于水中, 4 ℃处理1~2 d。将处理好的材料放在
卡诺氏固定液中4 ℃过夜固定, 固定后用蒸馏水洗
3~5次, 每次5 min。将蒸馏水洗过的材料在含1%
的纤维素和果胶酶的混合溶液中28 ℃酶解3 h, 火
焰干燥法制片。制好的染色体制片可直接在
Olympus CX-41相差显微镜下观察, 找到好的制片
放于–20 ℃保存备用。
2 基因组DNA抽提、处理及C0t-1 DNA分离
基因组DNA抽提参照Pierre和Laurence (1992)
方法。
C0t-1 DNA分离参照Zwick等(1997)、Wei等
(2005)及魏文辉和王力军(1999)方法。用5 mol·L-1
NaCl及无菌水将基因组DNA浓度调为100~500
ng·μL-1, NaCl终浓度为0.3 mol·L-1, 分装于1.5 mL
Eppendorf管中, 每管总体积0.5 mL。121 ℃下灭菌
锅处理5或10 min, 以获得100~1 000 bp基因组DNA
片段, 立即冰上放置。然后95 ℃变性10 min, 冰上
冷却10 s, 65 ℃水浴复性。复性结束后, 冰上放置2
min, 取出50 μL进行短片段基因组DNA浓度的测
量, 剩余的450 μL加入适量10×S1 buffer, 混合, 再
加适量S1酶(每μg DNA加1 U S1酶), 37 ℃水浴处
理8 min后, 立即加入等体积Tris平衡酚抽提1次, 氯
仿:异戊醇(24:1)抽提2次, 取上清, 加2.5倍体积无
水乙醇–20 ℃沉淀DNA, 过夜。离心, 干燥, 20 μL
TE溶解; 琼脂糖凝胶电泳观察C0t-1 DNA提取的结
果, 紫外分光光度计(Beckman)测定其浓度; –20 ℃
保存备用。
3 探针标记及荧光原位杂交与检测
早熟白菜苔C0t-1 DNA用生物素切刻平移试
剂盒标记(Catalogue No. 11745824910; Roche), 25S
rDNA用地高辛切刻平移试剂盒标记(Catalogue
No. 11745816910; Roche)。原位杂交参照Wei等
(2003)方法, 略微修改。首先将杂交液沸水浴10
min, 立即置于冰上, 放置0.5 h以上, 使双链DNA探
针变性, 并且不能复性。将制备好的早熟白菜苔
的染色体玻片标本于60 ℃培养箱中烤片2~3 h; 取
出玻片标本, 将其浸在70 ℃的70%甲酰胺/2×SSC
的变性液中变性2.5 min; 立即按顺序将标本经
70%、95%和100%冰乙醇(均为–20 ℃)系列脱水,
每次5 min, 然后空气干燥。将已变性的DNA探针
杂交液60 μL, 滴于已变性并脱水的玻片标本上, 盖
上24×50盖玻片, 放入含有2×SSC的保湿皿中, 90
℃置10 min; 将保湿皿放到室温, 当温度冷却至
60~70 ℃时, 放到37 ℃培养箱中杂交16 h。次日,
将标本从37 ℃温箱中取出, 在2×SSC中浸一下, 盖
玻片将从载玻片上流下, 在室温, 转移到2×SSC染
缸中15 min; 0.1×SSC染缸中15 min; 1×PBS染缸中
15 min。此步骤有助于除去非特异性结合的探针,
从而降低本底。PBS未干时, 加入生物素标记的探
针的一抗, 1×PBS/1% BSA 50 μL (含50×Strepavi-
din-Cy3 1 μL), 盖上盖玻片, 37 ℃保湿皿30 min以
上, 进行抗体结合; 然后去掉盖玻片, 在50 mL染缸
中1×PBS洗涤3次, 每次5 min; PBS未干时, 加入生
物素标记的探针的二抗, 1×PBS/1% BSA 50 μL (含
植物生理学报1218
50×biotinylated anti-avidin 1 μL), 盖上盖玻片, 37
℃保湿皿30 min以上, 进行抗体结合; 然后去掉盖
玻片, 在50 mL染缸中1×PBS洗涤3次, 每次5 min;
PBS未干时, 加入生物素标记的探针的三抗, 即一
抗, 1×PBS/1%BSA 50 μL (含50×Strepavidin-Cy3 1
μL), 盖上盖玻片, 37 ℃保湿皿30 min以上; 然后去
掉盖片, 在50mL染缸中1×PBS洗涤3次, 每次5 min;
然后进行地高辛的检测, 重复以上过程, 但抗体变
为地高辛的抗体, 地高辛的一抗和三抗用的是羊
抗-dig-FITC (FITC conjugated antidigoxigenin anti-
body from sheep), 二抗是兔抗羊-FITC (FITC con-
jugated anti-sheep IgG from rabbit)。
4 观察和拍照
当检测完毕后, 加入20 µL 2 µg·mL-1 DAPI
(4,6-diamidino-2-phenylindole), 盖上盖玻片, 用装
有DFC300 CCD照相系统的Leica DM IRB荧光显
微镜观察装片, 分别用紫外(UV)、蓝色(WB)和绿
色(WG)激发滤光片观察DAPI染色、地高辛标记
和生物素标记的杂交信号, 并将好的图片进行拍
照保存。
5 核型分析
选取分散且染色体形态良好的中期分裂相,
洗出照片, 进行剪裁、测量, 按照李懋学和陈瑞阳
(1985)的方法计算单倍基因组绝对长度、各染色
体的相对长度 [ (染色体长度 /单倍基因组总长
度)×100%]和臂比(长臂/短臂)、染色体长度比(最
长染色体长度/最短染色体长度), 确定各染色体的
类型和核型不对称类型, 染色体按从长到短顺序
排列。计算rDNA和C0t-1 DNA位点的百分距离
[(杂交信号中点(或次缢痕)至着丝粒的长度/染色
体臂总长度)×100%]。综合rDNA和C0t-1 DNA信
号带和染色体测量数据绘制核型模式图。
实验结果
1 白菜基因组DNA抽提、处理及C0t-1 DNA分离
早熟白菜苔基因组DNA片段大小均在20 kb以
上, 120 ℃处理5或10 min后, 绝大部分基因组DNA
片段在100~1 000 bp之间, 只有少数片段大于1 kb。
制备的C0t-1 DNA片段基本上在1 kb以下(图1)。
2 核型分析
早熟白菜苔的染色体数目为20条, 共10对, 根
据染色体长度和着丝点位置, 这10对常染色体包
括9对中部着丝粒染色体和1对亚中部着丝粒染色
体, 臂比大于2的染色体的百分比为10%, 最长染色
体与最短染色体的比值为2.46, 染色体臂数是40
条, 因此根据Stebbins的核型分类标准来划分, 早熟
白菜苔的核型为 2 B型 , 核型公式为 2 n = 2 x =
20=18m+2sm, 其基本臂数NF=40 (表1)。
3 荧光原位杂交
早熟白菜苔核型分析按照从长到短(不包括
随体长度)的顺序排列。从图2-B可以看出, C0t-1
DNA在早熟白菜苔每对染色体上都有明显而强的
荧光杂交带, 杂交信号带稳定, 位于第5号染色体
的长臂, 第2、6、7和8号染色体短臂, 第1号染色
体着丝粒和长臂位置, 第4号染色体着丝粒和短臂
位置, 在第3、9和10号染色体长臂、短臂和着丝
粒位置都有C0t-1 DNA杂交带(图2~4)。
25S rDNA位于第1、3和5号染色体长臂、第2
号和第4号染色体短臂, 其中, 第2号和第3号染色
体上的信号特别强, 25S rDNA几乎位于第2号染色
体的整个短臂 , 第1号染色体上的信号最弱(图
2-C)。对应于25S rDNA的染色体上, 有C0t-1 DNA
杂交带(图2-B), 但是C0t-1杂交带的信号明显要
弱。早熟白菜苔的双色荧光原位杂交结果进一步
图1 早熟白菜苔C0t-1 DNA电泳结果
Fig. 1 C0t-1 DNA electrophoresis result of B. campestris
M: λDNA/EcoRІ+HindШ marker; 1: 早熟白菜苔总基因组
DNA; 2: 灭菌锅处理10 min的基因组DNA; 3: 制备的C0t-1 DNA。
吴春红等: 白菜rDNA及C0t-1 DNA的荧光原位杂交及其核型分析 1219
显示25S rDNA所在位置也是C0t-1 DNA所在位置
(图2-B~D)。
对图3的核型分析图进行测量计算(表2), C0t-1
DNA显带长度在染色体上分布最高的是10号染色
体, 占所在染色体的69%, 分布最低的为6号染色
体, 占所在染色体的25%; 3号染色体C0t-1 DNA相
对长度最长, 为8.25, 8号染色体C0t-1 DNA相对长
度最短, 为1.94; 从整体上算, C0t-1 DNA总显带长
度占染色体总长度的比例为39.32%, 粗略估计出
早熟白菜苔的基因组中高度及中度重复序列占基
因组DNA的39.32%。25S rDNA显带长度在染色
体上分布最高的是2号染色体, 占所在染色体的
41%, 分布最低的为1号染色体, 占所在染色体的
3%; 2号染色体25S rDNA相对长度最长, 为5.34, 1
表1 早熟白菜苔的染色体数据分析
Table 1 Data analysis of chromosome of B. campestris

染色体序号
相对长度/%
臂比(长臂/短臂) 染色体类型 着丝粒指数/%
长臂 短臂 总长
1 9.71 5.83 15.53 1.67 m 37.50
2 7.77 5.34 13.11 1.45 m 40.74
3 9.71 3.40 13.11 2.86 sm 25.93
4 6.31 5.34 11.65 1.18 m 45.83
5 5.83 4.85 10.68 1.20 m 45.45
6 5.34 4.37 9.71 1.22 m 45.00
7 3.88 3.40 7.28 1.14 m 46.67
8 3.40 2.91 6.31 1.17 m 46.15
9 3.88 2.43 6.31 1.60 m 38.46
10 3.40 2.91 6.31 1.17 m 46.15

号染色体25S rDNA相对长度最短, 为0.49; 从整体
上算, 25S rDNA总显带长度占染色体总长度的比
例为15.05%, 粗略估计出早熟白菜苔的25S rDNA
占基因组DNA的15.05%。
基于传统的根据染色体长度和臂比值的分析,
以及C0t-1 DNA杂交带的位置和长度、25S rDNA
的位置和长度, 对早熟白菜苔的核型进行了构建,
并根据其核型画出了其核型模式图(图4)。
讨　　论
白菜的每一分裂相的所有染色体都具有C0t-1
DNA荧光杂交带, 带型稳定。同源染色体对应位
置分布有相同或相近的重复序列, 而非同源染色
体之间重复序列的分布存在位置与量上的差别,
表2 早熟白菜苔杂交带长度与染色体长度的比例
Table 2 Proportion of hybridization band length and chromosome length in B. campestris dual-color FISH
染色体序号
C0t-1 DNA显带 25S rDNA显带
C0t-1 DNA相 C0t-1 DNA占所在 C0t-1 DNA在 25S rDNA相 25S rDNA占所在 25S rDNA在
对长度/% 染色体比例/% 染色体的位置 对长度/% 染色体比例/% 染色体的位置
1 4.37 28 P, L 0.49 3 L
2 5.34 41 S 5.34 41 S
3 8.25 63 L, S, P 4.85 37 L
4 3.40 29 S, P 2.43 21 S
5 2.91 27 L 1.94 18 L
6 2.43 25 S
7 3.40 47 S
8 1.94 31 S
9 2.91 46 L, S, P
10 4.37 69 L, S, P

植物生理学报1220
图2 早熟白菜苔有丝分裂中期染色体的25S rDNA及C0t-1 DNA荧光原位杂交
Fig.2 FISH of the C0t-1 DNA and 25S rDNA probes to the mitotic metaphase chromosomes of B. campestris
A: 分裂相的DAPI染色图; B: C0t-1 DNA杂交结果; C: 25S rDNA杂交结果; D: C0t-1 DNA及25S rDNA双色荧光原位杂交结果; 其中红
色为C0t-1 rDNA信号, 绿色为25S rDNA信号; 图中数字代表染色体序号。标尺=5 µm。
图3 早熟白菜苔的核型分析图
Fig.3 Karyotype of B. campestris
使得同源染色体C0t-1 DNA荧光杂交带型相同或相
似, 非同源染色体之间带型不同, 这是利用C0t-1
DNA杂交带进行核型分析的基础。C0t-1 DNA既
然包含基因组中各种高度重复序列及中度重复序
列, 它就应该分布于白菜的整个染色体组, 在所有
染色体上都应有杂交带, 杂交带可能位于着丝粒
部位, 也可能位于染色体长臂或短臂, 我们的试验
结果充分地证实了这一点。
吴春红等: 白菜rDNA及C0t-1 DNA的荧光原位杂交及其核型分析 1221
C0t-1 DNA是指一个物种的基因组中所有的
高度重复序列及中度重复序列, rDNA是中度重复
序列中的一种, 因此, 从一个物种基因组中分离得
到的C0t-1 DNA就包含有rDNA。从理论上讲, 凡是
能检测到rDNA杂交信号的位置就能检测出C0t-1
DNA杂交信号。在早熟白菜苔的双色FISH中, 发
现了在有25S rDNA显带的地方也有C0t-1 DNA的
杂交带, 并且在有25S rDNA显带的地方C0t-1 DNA
杂交带相对较弱, 因为在杂交的过程中25S rDNA
和C0t-1 DNA竞争杂交位点。这充分证明了C0t-1
DNA含有25S rDNA序列, 二者位置是一致的。
Koo等(2004)定位的3个重复序列(5S、45S
rDNA和C11-350H)所在的染色体位置是第2号染
色体的短臂, 第4和6号染色体的短臂和着丝粒位
置, 第1、3、5、7、8、9和10号染色体的短臂、
长臂和着丝粒。既然C0t-1 DNA为物种基因组中所
有高度和中度重复序列, 这3个重复序列就应该被
包含在C0t-1 DNA所在的带内, 但事实上它们并没
有被包含在本实验所检测C0t-1 DNA位置内, 有一
定的差别。我们推测, 重复序列的在染色体上的
位置是不定的, 或者说重复序列在染色体的位置
具有不确定性。
本实验检测到有5对染色体上有25S rDNA的
杂交信号 , 这与前人的研究结果相一致(Koo等
2004), 但Koo等(2004)定位的45S rDNA位于第1、
2、4和5号染色体的短臂和着丝粒位置及第7号染
色体的长臂, 和本实验所检测的位置有所不同, 强
弱也有不同。我们推测rDNA位置存在种间差异,
或rDNA位点具有不确定性(Weiss等2000)。
我们精确地确定了各个C 0t -1 DNA和25S
rDNA 位点在染色体上的位置, 并得出了各位点间
的相对距离, 识别染色体时, C0t-1 DNA结合rDNA
的双色荧光原位杂交技术比使用二者之一的单色
荧光原位杂交技术更为可靠。结合白菜已公布的
基于rDNA分布的核型分析结果(Koo等2004)、染
色体长度与臂比及25S rDNA与C0t-1 DNA的杂交
位置和带型, 鉴定了白菜的全部10对染色体, 获得
了早熟白菜苔的所有染色体都有荧光杂交带型的
核型分析图(图3), 并画出了基于C0t-1 DNA和25S
rDNA荧光带型的核型模式图(图4), 这比目前使用
的其它方法更能准确地识别白菜的所有染色体,
而且简单快速。
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图4 早熟白菜苔核型模式图
Fig.4 Idiogram of B. campestris
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