全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月370
收稿 2009-12-23 修定 　2010-03-17
资助 东北林业大学本科生创新项目(091022532)和国家自然
科学基金(30 87 2 04 5)。
* 通讯作者(E-mail: yaguangzhan@126.com; Tel: 0451-
8 2 1 9 1 7 5 2 )。
白桦单细胞培养体系的建立
占爱瑶, 由香玲, 詹亚光 *, 付丽楠, 何之龙, 王翀
东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨 150040
提要: 以白桦花药(单核靠边期)、种子(萌发)及再生苗的茎段诱导愈伤组织, 在NT1、NT2和 B5三种不同的培养基中进行
悬浮培养, 筛选出优良的白桦悬浮体系, 而后进行单细胞分离的结果表明, 白桦花药愈伤组织在B5培养基上生长迅速, 分散
性好, 适合于细胞分离。分离得到的单细胞用不同方式培养, 建立了白桦单细胞两步培养法。
关键词: 白桦; 悬浮培养; 优良悬浮体系; 单细胞培养
Establishment of Single Cell Culture of White Birch (Betula platyphylla Suk.)
ZHAN Ai-Yao, YOU Xiang-Ling, ZHAN Ya-Guang*, FU Li-Nan, HE Zhi-Long, WANG Chong
College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: In this study, calli of Betula platyphylla were induced from three kinds of explants: anther (microspores
in monokaryotic stage), the seedling, and the stem of in vitro cultured plant. The best growth of calli induced
from anther was obtained in the B5 medium when they were suspended in three media: NT1, NT2 and B5,
respectively, also in that medium the anther calli shown good dispersivity in liquid medium, which was suited to
single cell separation. The single cell was cultured in different ways, and the white birch two-step single cell
culture was established.
Key words: Betula platyphylla; suspension culture; fine suspension system; single cell culture
植物组织或细胞培养物由许多不均一的细胞
组成, 这些细胞的大小、结构、遗传、生理生化
等特性各不相同, 其代谢状态和合成次生代谢物的
能力也有很大差别。组织或细胞培养物中细胞的
这种杂合性常是造成培养物在连续培养过程中生长
和次生代谢产物合成不稳定的因素之一(戴均贵等
2000)。而植物悬浮细胞系是进行原生质体培养、
细胞融合、外源基因转化、细胞突变体筛选、次
生代谢物质生产及体胚发生的极好试材(Yao等
2008)。白桦植株体内所含的三萜化合物白桦酯醇
和白桦酯酸等具有抗菌、抗病毒、降脂、利胆
和保肝等作用(孟艳秋等2004; 张云峰等2006)。白
桦酯酸对人类黑色素瘤、神经外层瘤和恶性脑瘤
细胞有特异的细胞毒性, 前几年有人验证它是1-型
艾滋病病毒(HIV-1)的特异抑制剂, 其作用有高效低
毒的特点(刘志芹等 2004)。目前, 白桦三萜类化合
物主要来源于白桦树皮, 人们还试图通过其他途径
来生产白桦三萜类化合物, 如化学合成、植物组织
与细胞培养技术。从长远来看, 通过组织与细胞培
养技术生产白桦三萜类化合物可能是一条比较好的
途径。在以前的白桦组织培养研究中, 细胞系的筛
选都是停留在愈伤组织水平上(詹亚光和杨传平
2002), 这样获得的 “细胞系 ”严格地讲只能称为组
织系, 其均匀性、高产性和稳定性均有一定限度。
采用单细胞克隆技术来筛选优良细胞系可能有助于
解决这一问题。
本文在以前工作基础上(王博 2008; 董杰等
2008; Zeng等2009), 进一步就外植体来源和培养基
成分进行研究, 筛选出适合单细胞培养的白桦悬浮
培养体系, 并建立了单细胞两步培养法, 进而用这
种培养方法得到优质的(如次生代谢产物含量高)单
细胞克隆, 以期为白桦细胞次生代谢产物生产的研
究提供参考。
材料与方法
1 材料
以白桦(Betula platyphylla Suk.)的花药(单核靠
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边期)、种子(萌发)及再生苗的茎段为材料进行愈
伤组织的诱导。
实验中采用 4种培养基: NT1、NT2、N7和B5,
均添加 2%的蔗糖, 固体培养基中添加 0.7%琼脂,
pH 6.5, 121 ℃高温高压灭菌 20 min。NT1培养基
为NT培养基中添加 0.02 mg·L-1 TDZ和 0.4 mg·L-1
6-BA; NT2培养基为NT培养基中添加 0.01 mg·L-1
TDZ和 0.1 mg·L-1 6-BA; N7培养基(Simola 1985)中
添加了 1 g·L-1水解酪蛋白(CH)、2 mg·L-1 2,4-D和
0.5 mg·L-1 KT; B5培养基中添加 0.6 mg·L-1 TDZ、
0.2 mg·L-1 6-BA和 1 g·L-1 CH。
2 方法
2.1 愈伤组织诱导及增殖 将白桦花药(单核靠边
期)、种子(萌发)及再生苗的茎段, 分别在 B5、N7
和NT2培养基上诱导愈伤组织。诱导得到的愈伤
组织继续增殖, 30 d继代一次, 选择松散的愈伤组
织用于悬浮培养。
2.2 白桦悬浮体系的建立 将分散性好的 3种来源
的白桦愈伤组织, 按 40 g·L-1的量接种于NT1、NT2
和B5液体培养基中, 置于转速为120 r·min-1摇床上
振荡培养。测定生长曲线, 观察生长状况, 筛选出
优良的悬浮体系, 用于单细胞分离。
2.3 单细胞的分离和纯化 主要用过筛的方法。将
悬浮培养物经 172和76 μm孔径不锈钢丝网过滤2
次, 除去大块细胞团, 收集滤液; 53 μm细胞筛过滤,
以除去小的细胞团, 得到单细胞; 再用 45 μm的细
胞筛纯化单细胞。
2.4 细胞活力和分裂能力观察 用双醋酸盐荧光素
(FDA)染色法; 以显微镜观察细胞的分裂、增殖和
生长。
2.5 细胞密度的测定 将分离得到的单细胞采用血
球计数板进行细胞密度计数, 并用稀释或离心重新
悬浮的方法调整细胞密度。
2.6 单细胞的培养 将分离得到的单细胞按 105个 ·
mL-1接种于B5培养基上进行单细胞悬浮培养和平
板培养, 每隔 3 d进行显微观察, 拍下各个时期细
胞生长、分裂和增殖的动态变化, 30 d后统计植
板率。
结果与讨论
1 愈伤组织的诱导与增殖
将白桦组培苗的茎段、种子(萌发后)和花药
(单核靠边期), 分别在NT2、N7和B5培养基上诱导
愈伤组织, 选择松散的愈伤组织进行继代, 每 20 d
继代一次, 继代 4次后, 3种愈伤组织均较松散(图
1)。
图 1 不同来源外植体的愈伤组织
Fig.1 Callus derived from different explants
a: 茎段; b: 种子; c: 花药。
2 白桦优良悬浮体系的筛选
外植体的来源和状态、培养基的成分、接种
的起始密度等都影响着木本植物悬浮细胞培养(化
青报等 2008)。白桦花药愈伤组织在 NT1、NT2、
B5三种培养基中进行悬浮培养的初期, 3种悬浮培
养基中细胞的长势均较好, 生长较快, 细胞均一, 不
易褐化。但在NT1和NT2两种培养基中, 继代 2~3
次后, 细胞块较大, 生长速率较慢, 平均每天分别为
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3.331和 3.990 g·L-1; 而在 B5培养基中的悬浮细胞
分散好, 细胞均一, 生长速率快, 生长速率平均每天
为5.201 g·L-1, 是一种优质细胞悬浮培养系, 可用于
单细胞分离(图 2)。而茎段和种子的愈伤组织在
NT1、NT2、B5三种培养基中悬浮培养, 细胞的长
势均不好, 块大, 容易褐化, 生长缓慢, 茎段愈伤组
织在 NT1、NT2、B5三种培养基中平均每天的生
长速率分别为 3.017、3.251、3.150 g·L-1 (图 3);
种子愈伤组织在 NT1、NT2、B5三种培养基中平
均每天的生长速率分别为 2.976、2.925、3.113
g·L-1 (图 4)。
图 2 不同培养基中的花药愈伤组织生长变化
Fig.2 Growth of anther callus in different medium
图 3 不同培养基中茎段愈伤组织的生长变化
Fig.3 Growth of stem callus in different medium
图 4 不同培养基中种子愈伤组织的生长变化
Fig.4 Growth of seed callus in different medium
3 白桦单细胞的分离和培养方式的筛选
在单细胞克隆的研究中, 获取分散细胞的方法
有物理方法、化学方法和酶法 3类。物理方法最
有潜力, 它操作方便, 不会改变细胞的生理生化特
性, 对正常细胞的生长和分化以及生物合成的研究
比较适用, 因而用得较普遍(查宏波等 2004)。本文
也用了此方法。将B5培养基中培养优良的白桦花
药悬浮培养液以 76和 53 μm孔径不锈钢丝细胞筛
过滤 2次去细胞团, 收集滤液, 此时单细胞含量占
60%以上, 再用 45 μm的细胞筛纯化单细胞, 将细
胞筛上的单细胞用培养液冲入到灭过菌的三角瓶
里, 细胞液里的单细胞占80%以上(图5-j)。用FDA
染色法(徐林林等 2006)鉴定细胞活力为 82.3% (图
5-c、d)。
4 单细胞培养方式的选择
在单细胞培养方式(单细胞悬浮培养、浅层
培养、平板培养及看护培养)中, 我们采用了单细
胞悬浮培养和平板培养两种方式进行了白桦单细胞
培养的初步研究。将分离得到的单细胞分别按105
个·mL-1接种于B5液体和固体培养基中进行单细胞
悬浮培养和平板培养, 每隔 3 d进行一次显微观察,
拍下各个时期细胞生长、分裂和增殖的动态变化,
结果(图5)表明, 单细胞悬浮培养比平板培养的细胞
分裂更快, 分裂率和植板率都较高, 得到的单细胞
克隆较多(表 1)。但悬浮培养不适合单细胞克隆的
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图 5 单细胞的生长和分裂
Fig.5 Growth and division of single cell
a、b: 平板培养 6 d后分裂的三细胞团; c、d: 分离得到的有活力的单细胞; e、f: 悬浮培养 12 d的多细胞团; g、h: 悬浮培养
3 d的二细胞团; i : 正在分裂的细胞; j: 80%以上单细胞。
表 1 不同培养方式对细胞分裂率和植板率的影响
Table 1 Effects of different culture methods on cell division rate and plating efficiency
培养时间 /d
培养方式
3 6 9 30
单细胞悬浮培养 多为单细胞, 二细胞团为 11.44%, 二细胞团或多细胞团 多细胞团为 46.21%, 植板率为 11.29%
三细胞团为 3.03% 为 35.21% 有较多可见的愈伤组织
单细胞固体培养 多为单细胞, 二细胞团为 9.25%, 二细胞团或多细胞团 多细胞为 35.3%, 植板率为 6.33%
三细胞团为 2.44% 为 23.8% 有个别愈伤组织可见
图 6 花药悬浮培养细胞及单细胞生长
Fig.6 Anther suspension cells and growth of single cell
a: B5培养基中的花药悬浮细胞; b: 单细胞悬浮培养 7 d后的单细胞; c: 单细胞平板培养 10 d后的单细胞克隆; d: 继代培养 30 d后
的单细胞克隆。
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进一步生长和单细胞克隆的挑选, 所以建议采用下
面介绍的两步培养法。
5 单细胞的两步培养法
从优良的悬浮培养细胞中分离的单细胞, 按
105个·mL-1接种于B5液体培养基上进行单细胞悬浮
培养7 d后, 接种于B5固体培养基中进行平板培养,
当单细胞克隆可见时, 继而挑选出来进行继代培养,
建立了白桦单细胞两步培养法, 即单细胞悬浮培养
和平板培养相结合的方式(图 6)。
本文以单核靠边期的白桦花药为外植体, 进行
愈伤组织诱导, 在B5培养基上进行悬浮培养, 建立
了一个优良的适合单细胞分离的白桦悬浮培养体
系。采用物理的方法进行单细胞分离, 对白桦单细
胞培养进行了初步研究。
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