全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (4): 362~368362
收稿 2012-12-03　　修定 2013-03-12
资助 陕西省自然科学基础研究计划项目(2012JQ4013)、中央高
校基本科研业务费专项资金资助(GK201102017)、陕西教育
学院自然基金(2012KJ044)。
* 通讯作者(E-mail: zzwang@snnu.edu.cn; Tel: 029-85301260)。
丹参普遍胁迫蛋白基因(SmUSP)的克隆及表达模式分析
邝静, 生华, 武玉翠, 葛茜, 张媛, 王喆之*
药用资源与天然药物化学教育部重点实验室, 西北濒危药材资源开发国家工程实验室, 陕西师范大学生命科学学院, 西安
710062
摘要: 通过BLAST比对分析丹参EST数据库, 发现一个与普遍胁迫蛋白(USP)基因家族同源性较高的基因序列, 命名为
SmUSP, GenBank登录号为JX416284。依据该序列, 从DNA和cDNA水平克隆得到该基因全长, 经分析发现该基因无内含子
序列, 包含一个长711 bp的完整开放读码框(ORF), 编码236个氨基酸残基。生物信息学分析显示, SmUSP编码蛋白的相对
分子量25.5 kDa, 为无信号肽和跨膜结构域的疏水酸性蛋白; SmUSP具有UspA结构域和ATP结合位点, 属于USP蛋白UspFG
亚家族。实时荧光定量PCR分析表明, SmUSP在丹参的根、茎、叶、花中均有表达, 在根中的表达量较高。同时, SmUSP
表达受茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)以及脱水胁迫的上调诱导, 推测该基因可能在丹参防御反应中发
挥作用。
关键词: SmUSP; 生物信息学分析; 表达模式分析
Cloning and Expression Analysis of Universal Stress Protein Gene (SmUSP)
from Salvia miltiorrhiza Bunge
KUANG Jing, SHENG Hua, WU Yu-Cui, GE Qian, ZHANG Yuan, WANG Zhe-Zhi*
Key Laboratory of Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry, Ministry of Education; National Engineer-
ing Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drugs in Northwest of China; College of Life Sciences,
Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China
Abstract: A sequence showed high homology with universal stress proteins (USPs) was found by BLAST
searching in EST database of Salvia miltiorrhiza. The full-length cDNA and gDNA sequences of the gene were
cloned and named as SmUSP. The GenBank accession number is JX416284. SmUSP contained an intact open
reading frame (ORF) of 711 bp without intron and encoded 236-amino acid peptides. Bioinformatic analysis
showed SmUSP was a stable acidic protein with a predicted molecular weight of 25.5 kDa. There is no signal
peptides and transmembrane domain in SmUSP. SmUSP protein has an UspA domain with an ATP-binding site
and can be classified into the UspFG subfamily of USP. The results of real-time quantitative PCR revealed that
SmUSP was expressed in roots, stems, leaves and flowers of S. miltiorrhiza, and most abundant in roots. Up-
regulated expression of SmUSP could be induced by methyl jasmonate (MeJA), salicylic acid (SA), abscisic
acid (ABA) and drought, indicating that SmUSP might be involved in plant defenses.
Key words: SmUSP; bioinformatics analysis; expression analysis
普遍胁迫蛋白(universal stress protein, USP)是
一个古老、保守的蛋白家族, 参与大量胁迫应答
反应(Sauter等2002)。最早于大肠杆菌(Escherichia
coli) K-12 strain W3110中被发现(VanBogelen等
1990)。在高等植物中, USP的发现起始于Sauter等
(2002)在水稻(Oryza sativa)水淹胁迫差减文库的构
建。2008年, 王慧梅等(2008)利用抑制性消减杂交
技术构建了干旱胁迫下黄檗(Cortex phellodendri)
幼苗的消减文库, 然后对获得的EST序列分析发现
USP基因的表达丰度较高, 这说明干旱胁迫可以上
调该基因的表达。之后, USP在拟南芥(Arabidopsis
thaliana)、紫云英(Astragalus sinicus)等高等植物
中也相继被发现(Chou等2007; Kerk等2003)。该蛋
白几乎与所有胁迫和饥饿应答有关(Nyström和
Neidhardt 1993), 因而吸引了大量研究者对其基因
邝静等: 丹参普遍胁迫蛋白基因(SmUSP)的克隆及表达模式分析 363
表达及功能进行全面研究。
USP属于自磷酸化丝氨酸和苏氨酸的磷酸蛋
白, 可作为GTP和ATP的磷酸供体(Freestone等
1997)。大肠杆菌USP基因家族被分为6类基因, 分
别为uspA、uspC、uspD、uspE、uspF和uspG
(Gustavsson等2002)。USP相关蛋白根据Usp域的
序列相似性可分为两个亚家族: UspA、UspC和
UspD属于一类, 命名为UspA亚家族; UspF和UspG
属于另一类, 命名为UspFG亚家族。UspE是一个
串联型的USP, 它的第一个结构域与UspFG亚家族
相近, 而第二个结构域却更接近UspA亚家族。目
前在其他物种中发现的USP蛋白大多属于UspA亚
家族。基于多序列比对UspA结构域的系统发生树
分析, UspA亚家族也可分为结合ATP和不结合ATP
两大类。而UspFG亚家族的USP蛋白均含有ATP
结合位点 , ATP结合保守结构域的特征序列是
G-2X-G-9X-G[S/T] (Oh等2009)。Mushegian和
Koonin (1996)认为UspA结构域具有DNA结合特
性, 推测其可能有保护DNA的功能。本研究中的
SmUSP蛋白有UspA结构域, 并且含ATP结合位点
G-2X-G-9X-G[S/T]序列结构, 属于USP蛋白UspGF
亚家族(VanBogelen等1990)。
丹参为唇形科(Labiatae)鼠尾草属多年生草本
植物, 以其干燥根及根茎入药, 味苦, 性微寒, 具有
活血祛瘀、通经止痛、清心除烦等功效, 在临床
上被广泛应用于心脑血管疾病、癌症以及各种炎
症的治疗, 是重要的大宗药材之一(冯玲玲和周吉
源2004)。本研究从丹参中克隆得到一个USP蛋白
基因SmUSP, 采用生物信息学方法对该基因及其
推导的氨基酸序列从氨基酸组成、理化性质、疏
水性、亚细胞定位及结构功能域等方面进行了预
测和分析, 通过实时荧光定量PCR检测分析SmUSP
的表达特征。
材料与方法
1 材料与试剂
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)种子收集于陕
西商洛药用基地。种子发芽后, 实生苗于RXZ-
2500D人工气候箱(宁波江南仪器有限公司)中培
养。培养条件为: 温度(25±2) ℃; 光强150 μmol·m-2·s-1;
光周期为光照16 h/黑暗8 h; 湿度48%。培养2个月
的丹参实生苗用于本研究的各项实验。
RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和DNase消
化试剂购自OMEGA公司; SYBR Green II Premix
Ex Taq、pMD19-T simple vector购自TaKaRa公司;
大肠杆菌DH5α为本实验室保存。
2 材料处理方法
取丹参盛花期不同部位新鲜组织, 液氮速冻
后于-80 ℃储藏, 用于基因器官特异性的表达检
测。本研究中所选取的处理浓度均为经过不同浓
度处理的梯度实验筛选而得到的最适浓度。
茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)处理时,
用500 μmol·L-1 MeJA溶液喷洒于二月龄的丹参实
生苗表叶面, 分别于处理后0、0.5、2、4、6、8、
12、48、72 h取样。
水杨酸(salicylic acid, SA)处理时 , 用500
μmol·L-1 SA溶液喷洒于二月龄的丹参实生苗表叶
面, 分别于0、1、2、4、6、12、24和60 h取样。
脱落酸(abscisic acid, ABA)处理时, 用100
μmol·L-1 ABA溶液喷洒于二月龄的丹参实生苗表
叶面, 分别于0、0.5、1、2、6、8、10和12 h取样。
干旱胁迫处理时, 将二月龄的丹参实生苗从
营养钵中小心地转移至干燥的滤纸上, 室温下进
行失水胁迫, 分别于开始处理后的0、10、20、
40、60、120、180和240 min取样。
取经处理的二月龄丹参全株为样品, 收集后
迅速放入PE袋中, 置于液氮中速冻, 5 min后取出,
置于-80 ℃冻存备用。
3 核酸提取
采用CTAB法(郝岗平等2006)提取丹参总
DNA。用OMEGA公司试剂盒提取丹参根、茎、
叶、花以及各处理样品中的总mRNA, 按照反转录
试剂盒PrimeScript® RT Reagent Kit (TakaRa公司)
说明书, 以总mRNA为模板合成cDNA第一链。
4 丹参SmUSP基因的克隆
依据本实验室构建的丹参E S T数据库中
SmUSP的序列信息, 采用Primer Premier 5.0软件设
计特异性引物: 5-ATGGCATCACCAGGCAAACC-3
和5-CAAAGAATGAATCCTCGTCGCA-3。分别以
丹参gDNA和cDNA为模板, 扩增SmUSP片段。反
应程序为: 95 ℃预变性4 min; 95 ℃变性30 s, 57 ℃
退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 30个循环; 72 ℃延伸10
植物生理学报364
min。PCR扩增产物经胶回收后与pMD19-T simple
vector连接, 转化至大肠杆菌DH5α, 送至上海桑尼
生物科技有限公司测序。
5 SmUSP的生物信息学分析
采用DNAStar及http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、
http://www.ebi.ac.uk/、http://www.cbs.dtu.dk/、
http://cn.expasy.org/等网站提供的各类生物信息学
软件进行分析(Mount等2003; Baxevanis和Ouellette
2000)。核酸及氨基酸序列的组成分析、理化性质
分析、开放阅读框(open reading frame, ORF)的查
找和翻译与保守结构域的预测利用DNAStar软件
及ProtParam、pI/MV、ORF Finder、NCBI-CDS等
在线工具进行 ; 核酸及氨基酸序列的同源性比
对、多序列比对利用NCBI网站上的BLAST和
Clustal W在线工具完成; 蛋白质信号肽的预测、
跨膜结构域及亲水性/疏水性的分析利用在线工具
SignalP、TMHMM和ProtScale完成。
6 丹参SmUSP基因的表达分析
分别以丹参根、茎、叶、花以及经MeJA、
SA、ABA和脱水处理的cDNA样品为模板进行实
时荧光定量PCR分析。以持家基因 (SmAct in ,
DQ243702)为内参, 引物序列见表1。反应条件为:
95 ℃变性3 min; 95 ℃变性10 s, 60 ℃退火30 s, 40
个循环。每个样品3个技术重复及2次生物学重
复。数据分析采用“2-ΔΔCT”的方法(Vandesompele等
2002), 并用SPSS 13.0中one-way ANOVA方法进行
单因素方差分析, 利用Tukey test分析各样品间基
因表达的显著性(P<0.05)。
表1 实时荧光定量PCR检测SmUSP基因表达所用引物
Table 1 List of primers used for the analysis of the expression of SmUSP by real-time quantitative PCR
基因 扩增产物长度/bp 引物名称 序列
SmUSP 300 SmUSP-R 5-CACCAGGCAAACCTCGGAA-3
SmUSP-F 5-CCAGTTTCTGCTGCGATTTCT-3
SmActin 278 SmActin-R 5-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3
SmActin-F 5-AGGAACCACCGATCCAGACA-3
结果与讨论
1 SmUSP基因的克隆与生物信息学分析
分别从丹参gDNA和cDNA水平上克隆得到
SmUSP基因(图1)。序列分析表明SmUSP基因包含
一个全长711 bp的完整开放读码框, 不含内含子, 编
码236个氨基酸残基。NCBI网站的BLAST在线工
具分析结果显示, SmUSP蛋白具有UspA结构域(图
2-A), 属于USP蛋白家族, 且含有UspFG亚家族典
型的ATP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]结构序列(图
2-B)。该基因编码蛋白的理论分子量为25.5 kDa,
理论等电点为5.26, 不稳定常数[instability index
(II)]为35.69, 说明该蛋白是一个稳定的酸性蛋白。
疏水性是指氨基酸远离周围水分子、将自己
包埋进蛋白质核心的相对趋势, 是蛋白质三维空
间构象的影响因素之一(翟中和等2000)。疏水性/
亲水性的预测和分析有助于了解蛋白的性质, 并
为进一步预测其高级结构提供参考信息。利用
ProtScale软件对丹参SmUSP氨基酸序列的疏水性/
图1 SmUSP基因的PCR扩增产物
Fig.1 PCR amplification products of SmUSP gene
M: DL2000 Marker; 1: 模板为cDNA的扩增片段; 2: 不加模板
的阴性对照; 3: 模板为gDNA的扩增片段。
亲水性进行预测, 结果显示, 最低值为-3.389, 最高
值为2.356, 总体表现为疏水性。
邝静等: 丹参普遍胁迫蛋白基因(SmUSP)的克隆及表达模式分析 365
信号肽(signal peptide)的预测和分析对认识和
理解蛋白质的细胞定位及功能有重要意义。信号
肽是位于蛋白质N端的信号序列, 与蛋白质到不同
的细胞器或细胞质基质的特定部位转运和分选相
关(Nielsen等1997)。利用SignalP 3.0程序对SmUSP
氨基酸序列的信号肽进行预测(Bendtsen等2004;
Nyström和Neidhardt 1992), 结果显示, SmUSP不具
有信号肽 , 不存在信号肽酶切位点 , 据此推测
SmUSP蛋白是定位于细胞质中的胞内蛋白。
跨膜结构域一般是由20个左右的疏水氨基酸
残基组成的α-螺旋, 固着在细胞膜上起“锚定”作
用, 是膜脂与膜内在蛋白相结合的主要部位(Niels-
en等1997)。利用TMHMM 2.0程序对SmUSP氨基
酸序列的跨膜结构域进行预测, 结果显示, SmUSP
不具有跨膜结构域, 推测其可能游离在细胞质中
发挥作用。
2 SmUSP蛋白序列特征分析
应用NCBI上的BLASTP在线工具进行序列同
源性分析的结果显示, SmUSP蛋白与GenBank已注
册的玉米(Zea mays) USP蛋白(NP_001149193)、水
稻(Oryza sativa)胁迫相关蛋白(AAR87267)、拟南
芥(Arabidopsis thaliana) USP蛋白(NP_567770)、
葡萄(Vitis vinifera) USP蛋白(XP_002281607)、苜
蓿(Medicago truncatula) USP蛋白(XP_003591542)
的同源性分别为 : 88%、72%、70%、66%和
65%。对这6个蛋白进行蛋白序列比对分析的结果
图2 SmUSP蛋白序列特征以及基因核酸序列和其编码蛋白序列
Fig.2 Sequence character of SmUSP and its nucleotide sequence and amino acid sequence
A: SmUSP蛋白保守结构域。蛋白序列上的数字表示组成SmUSP蛋白的氨基酸序号; 三角表示组成疏水穴的8个氨基酸。B: SmUSP
基因的核酸序列及其编码的蛋白序列。阴影表示G-2X-G-9X-G[S/T]基序(即ATP结合位点)。
植物生理学报366
显示, SmUSP在氨基酸序列第157~174位包含有在
其他物种中已报道的USP蛋白的保守功能域, 即
ATP结合位点(G-2X-G-9X-G[S/T]) (图3), 属于
UspFG亚家族。对这6个蛋白理化性质进行分析的
结果显示, 其蛋白分子量介于17~28 kDa之间, 理论
等电点介于4.7~8.9之间, 其中拟南芥USP蛋白是不
稳定的酸性蛋白, 苜蓿USP蛋白是稳定的碱性蛋
白, 其他均为稳定的酸性蛋白。
3 SmUSP基因的表达水平检测
植物营固着生活, 需要适应周围不断变化的
环境。受外界刺激时, 植物通过信号网络做出响应,
这对其生存和进化具有重要意义(刘庆霞等2012)。
目前, USP基因已在很多个物种中发现。研究
表明USP蛋白可在许多情况下被诱导表达, 比如:
C、N、磷酸盐、硫酸盐及必需氨基酸的缺乏, 有
毒化学物质处理, 包括重金属、氧化剂、酸、乙
醇、抗生素, 热击和DNA损伤等(Cheong和Choi
2003; Nyström和Neidhardt 1994)。这说明USP参与
了这一系列胁迫条件下的细胞抗逆反应。且大多
数USP基因都受到不同激素和胁迫的诱导表达, 说
明其在植物防御反应中发挥重要作用。
基因的表达模式分析可为基因功能的揭示提
供重要的线索。本研究在分析SmUSP基因的不同
器官表达模式后发现, SmUSP在丹参的根、茎、
叶、花中均有表达, 表达量由高到低依次为: 根>
花>茎>叶(图4)。统计分析表明, 根中的表达量与
图3 SmUSP与其他植物USP蛋白的多序列比对
Fig.3 Comparison of amino acid sequence of SmUSP with that of other USPs
*表示6个蛋白都相同的氨基酸残基; :表示4个蛋白都相同的氨基酸残基; ·代表3个蛋白都相同的氨基酸残基; 方框内表示ATP结合位点。
邝静等: 丹参普遍胁迫蛋白基因(SmUSP)的克隆及表达模式分析 367
茎、叶和花中的表达量有显著差异。
茉莉酸(酯)类物质是与抗性密切相关的植物
生长调节物质, 它作为内源信号分子参与植物在
机械伤害、病虫害、干旱、盐胁迫、低温等条件
下的抗逆反应。在植物受到伤害时, 植物体内茉
莉酸及其衍生物的含量显著增加, 进而诱导一系
列与抗逆有关的基因表达, 如蛋白酶抑制剂、硫
蛋白和苯丙氨酸转氨酶等, 提高酯氧合酶活性, 从
而增强植物的抗性(Cutler等2010)。ABA可调节
植物对低温、干旱、盐碱及病原菌等多种逆境的
抗性反应(Kim等2010)。 SA与植物抗病性有关。
本研究结果显示, 500 μmol·L-1 MeJA胁迫处理后,
SmUSP表达量在12 h达到最大, 约为对照组(0 h)
的3.9倍(图5-A); 500 μmol·L-1 SA处理后, SmUSP
表达量在1 h达到最大, 约为对照组(0 h)的10倍(图
5-B); 100 μmol·L-1 ABA处理后, SmUSP表达量在
0.5 h达到峰值, 之后在检测的8 h内表达量有递减
趋势, 在10 h时与对照持平(图5-C)。脱水胁迫后,
SmUSP的表达量在20 min时达到最低值, 之后在
检测的240 min内表达量呈递增趋势(图5-D)。因
此推测SmUSP基因可能在植物防御反应中发挥
作用。
图4 SmUSP基因在丹参不同器官的表达水平
Fig.4 The expression levels of SmUSP in different
organs of S. miltiorrhiza
*P<0.05; ***P<0.001。
图5 SmUSP基因受MeJA (A)、SA (B)、ABA (C)、干旱(D)诱导或胁迫下的表达
Fig.5 Expression patterns of SmUSP gene under MeJA (A), SA (B), ABA (C) or drought treatments
*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001。
植物生理学报368
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