全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月 651
收稿 2009-03-10 修定 　2009-05-07
资助 广东省高等院校专科建设专项资金(LYM08102)和广东
省自然科学基金(04 0 10 3 7 7)。
* 通讯作者(E-mail: lilab@scnu.edu.cn; Tel: 020-85211378)。
野葛葡糖基转移酶基因 PlUGT3 的克隆与生物信息学分析
周文灵 1, 王瑛华 1,2, 陈刚 2, 李玲 1,*
1 华南师范大学生命科学学院广东省植物发育生物工程重点实验室, 广州 510631; 2 肇庆学院生物系, 广东肇庆 526061
提要: 采用 3和 5 RACE技术从野葛中克隆到葡糖基转移酶基因 PlUGT3 (GenBank登录号 EU889121) cDNA序列, 长度为
1 678 bp, 包含完整的开放阅读框(ORF)。ORF全长 1 428 bp, 编码 475个氨基酸。此氨基酸序列具有葡糖基转移酶糖基受
体结合特征区域 PSPG box, 与几种高等植物氨基酸序列的同源性大于 40%。半定量RT-PCR表明, PlUGT3在野葛根和叶
中表达, 两者表达量没有明显差别。
关键词: 野葛; 葡糖基转移酶; RACE; 生物信息学分析
Cloning and Bioinformatic Analysis of Glucosyltransferases Gene PlUGT3 in
Pueraria lobata (Willd.) Ohwi
ZHOU Wen-Ling1, WANG Ying-Hua1, 2, CHEN Gang2, LI Ling1,*
1Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Science, South China Normal University,
Guangzhou 510631, China; 2Department of Biology, Zhaoqing University, Zhaoqing, Guangdong 526061, China
Abstract: A glucosyltransferase gene, named PlUGT3 (GenBank accession No. EU889121) was cloned from
Pueraria lobata by RT-PCR and RACE methods. The cDNA contained 1 678 bp with an open reading frame
(ORF) of 1 428 bp and encoded a putative protein of 457 amino acids. The deduced amino acid sequence
showed more than 40% similarity to homologues from other plants such as Rhodiola sachalinensis and Arabidopsis
thaliana, and to highly conserved functional domain PSPG box of the gene family. Semiquantitive RT-PCR
analysis indicated that PlUGT3 expression levels were not significant different in roots and leaves.
Key words: Pueraria lobata; glucosyltransferases; RACE; bioinformatic analysis
野葛是豆科植物葛属的一个种, 其干燥根作为
我国传统中药。野葛中的葛根素含量最高、药性
好, 有多种疗效(宋雪鹏等 1988; Xu 等 2005; 吕俊
华等 2006; 黄筑艳等 2007)。
糖基转移酶广泛存在于植物中, 催化植物次生
代谢物合成, 是植物次生代谢途径中的重要部分, 制
约野葛独特药用成分葛根素生物合成( Inoue 和
Fujita 1977), 它将活性糖基从核苷糖[通常是尿嘧啶
核苷二磷酸 - 葡萄糖(UDP-glucose)]转移到一系列
植物小分子化合物受体上形成糖苷化合物(王克夷
1994)。根据底物特异性和序列同源性, 糖基转移
酶分为91个家族以及一个未知的家族(http://www.
cazy.org/fam/acc_GT.html), 其中第一个家族利用
UDP-葡萄糖作为糖基供体, 故称UDP-葡糖基转移
酶(UDP-glucosyltransferases, UGTs)。UGTs 由多
基因家族成员编码, 已知拟南芥中至少有120个成
员, 水稻中有 193个成员, 苜蓿中有 165个成员(Ko
等 2006)。
本文从野葛叶片中克隆到UGT基因, 并分析它
的序列特征和表达特性, 为探讨UGT基因在葛根素
的生物合成以及基因工程调节的研究建立了基础。
材料与方法
野葛[Pueraria lobata (Willd.) Ohwi]于2006年
夏天采于梅州市梅县书坑村山坡, 以自来水洗涤后
存于 - 80℃中。
根据已报道的植物UGT基因保守区序列, 设计
简并引物 UGTD-F 和 UGTD-R (表 1), Trizol
(Invitrogen)法提取叶片总 RNA, 逆转录为 cDNA,
PCR 扩增目的片段。反应条件为: 94 ℃预变性 5
min; 94 ℃变性 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃延伸 30 s, 30
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月652
个循环; 然后 72 ℃延伸 10 min。PCR 产物经
1.0% 琼脂糖凝胶电泳检查后, 切下目的条带, 用
PCR产物纯化试剂盒回收DNA, 与 pMD18-T Vec-
tor (TaKaRa)连接, 转化大肠杆菌 DH5α, 鉴定并测
序。
以引物3 RACE-T逆转录得 cDNA模板, 分别
用PlUGT3-F1和PlUGT3-F2 (表 1)与3接头引物3
RACE-R进行槽式PCR扩增3 cDNA末端片段; 为
了得到野葛 UGT 基因 5 cDNA 末端序列, 根据测
序得到的序列信息, 采用TaKaRa公司5-Full RACE
K i t 进行 cD N A 第一链的合成及 R AC E 实验。
PlUGT3-R1 和 PlUGT3-R2 分别与 5 Race Outer
Primer (5 ROP)和 5 Race Inner Primer (5 RIP) (表
1)扩增 5 cDNA 末端片段。PCR 体系和条件严格
按照试剂盒说明进行操作。PC R 扩增产物的回
收、连接、转化和测序同上。设计引物 PlUGT3F
和PlUGT3R (表1)进行PCR, 获得开放读码框(open
reading frame, ORF)蛋白 cDNA序列。反应条件为:
表 1 克隆 PlUGT3 基因中所用引物序列
Table 1 Primers used in isolating PlUGT3 gene
引物 引物序列(5 → 3)
UGTD-F TTYGTNACICAYTGYGGITGGAA
UGTD-R TCCATNAGICTICGICANGCYTTYTCDAT
PlUGT3-F1 TGCGAAGTTTCTGACGGACATAGTTAAG
PlUGT3-F2 ACGTGGATTGGTATGATGGGAAGGGAC
PlUGT3-R1 ATTTGAGCAAGCTCCTTCGCTCTG
PlUGT3-R2 TCCCTTCCCATCATACCAATCCACG
PlUGT3F CATGGGTAACGAGAATCGCGAGCTTCA
PlUGT3R ATCAATGGGCACGCGACCTCAAATC
3 RACE-R GACTCGAGTCGACATCGA
3 RACE-T GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT
5 ROP CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
5 RIP CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
引物序列中 N 代表 A、G、C 或者 T, Y 代表 C 或者 T。 5 Race Outer Primer (5 ROP)和 5 Race Inner Primer (5 RIP)由 TaKaRa
公司 5 Race 试剂盒提供。
94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃
延伸 1.5 min, 30 个循环; 然后于 72 ℃延伸 10 min。
序列对比基于NCBI的Blast和GenBank (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), 采用 DNAMAN 和
DNAStar 等分析基因的预测 ORF、分子量、等电
点, 并建立相关 UGT 蛋白系统进化树。
提取野葛基因组 DNA, 以引物 PlUGT3F 和
PlUGT3R进行PCR, 获得PlUGT3基因组DNA序列,
分析内含子。
半定量RT-PCR分析基因转录水平时, 分别提
取野葛根和叶总RNA, 取等量RNA为模板, 以18S
rRNA 基因(Bhagwat 等 2001)为内参(18S-F: 5
ATTCCTAGTAAGCGCGAGTCATCAG 3; 18S-R: 5
CAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC 3)。利用编码
区特异引物: PlUGT3F 和 PlUGT3R (表 1)进行One
Step RT-PCR 扩增。预实验确定 PCR 循环数为 25
个(内参基因 20 个)。半定量 RT-PCR 检测不同组
织的基因转录水平。
实验结果
1 野葛UGT基因 cDNA序列的克隆
根据报道的植物UGT基因保守区域PSPG box
设计简并引物 UGTD-F 和 UGTD-R, 通过 RT-PCR
扩增得到约 250 bp 条带(图 1-a 箭头处), 回收、克
隆并测序, 测序结果在国际生物技术信息中心网站
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析其基因
同源性, 结果表明此片段为野葛UGT基因的中间部
分序列。在此基础上分别得到 367 bp 的 3 端和
1 347 bp的 5 端(图 1-b、c 箭头处), 再将这些中间
部分序列、3端序列和 5端序列拼接, 得到一具有
完整 ORF的 cDNA序列信息。再进一步依据所得
到的序列信息用引物PlUGT3F和PlUGT3R扩增(图
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月 653
1-d)并测序后, 得到长度为1 428 bp ORF序列, 命名
为 PlUGT3。
2 野葛 PlUGT3 基因生物信息学分析
PlUGT3基因 cDNA全长为 1 678 bp (图 2), 含
图 2 PlUGT3 核苷酸序列预测的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PlUGT3
下划线部分为保守的糖基受体结合域 PSPG box。
图 1 野葛 UGT 基因 cDNA的 PCR 扩增
Fig.1 PCR of UGT gene cDNA in P. lobata
a: RT-PCR 产物; b: 3 RACE 产物; c: 5 RACE 产物; d: ORF。1: 中间扩增片段; 2: 3 RACE 片段; 3: 5 RACE 片段; 4: ORF 片段;
M: 标准分子量。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月654
有一个长1 428 bp的ORF, 位于序列的94~1 521 bp,
编码 475 个氨基酸残基, 分子量为 53.3 kDa, 蛋白
等电点为 5.43。5 端非编码区长度为 93 bp, 3 端
非编码区长度为 157 bp。生物信息学分析表明, 该
基因C端含有UGTs的糖基受体结合特征区域PSPG
box (图 3)。PlUGT3与高山红景天UGT73B6、烟草
TOGT1、截形苜蓿GT99D、水稻Os01g0176200、
拟南芥 UGT73B3 的同源性分别为 58%、54%、
41%、42% 和 52%。系统进化分析结果(图 4)表
明, PlUGT3与红豆的AdGt-4及拟南芥的At1g73880
和甜菊的 UGT89B2亲缘关系较近。cDNA序列在
GenBank 注册, 登录号为 EU889121。
图 3 PlUGT3 与其他 UGT 蛋白的糖基受体结合域 PSPG box 比对
Fig.3 Alignments of PSPG domain between PlUGT3 and other UGTs proteins
黑框代表糖基受体结合域 PSPG box。
分析基因组结构的结果表明, PlUGT3 含有一
个 225 bp 内含子(图 5), 其外显子与内含子连接区
符合经典剪拼序列的 GT-AG 法则。
3 PlUGT3在野葛组织中的表达
分别提取野葛的根和叶总 RNA, 采用半定量
RT-PCR的方法分析PlUGT3在野葛器官表达的结
果(图6)显示, PlUGT3在正常生长条件下的野葛根
和叶中均表达, 两者的强度差异不大, 可能为组成
型表达。
讨 论
UGTs是野葛独特药用成分葛根素生物合成的
关键酶。目前研究报道的植物 UGTs 多为将底物
通过 O- 或者 N- 糖基化形成其他代谢物。Brazier-
Hicks 等(2007)发现 UGT72B1 在异生素代谢中具
有将 O- 和 N- 葡糖基化的双重功能; UGT73B4 和
UGT73C1在2,4,6-三硝基甲苯(2,4,6-trinitrotoluene,
TNT)解毒过程中具有将 O- 和 C- 葡糖基化的双重
功能(Gandia-Herrero等 2008)。微生物存在 3个C-
UGTs, 分别为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)
Tü2717 中的 UrdGT2 (Mittler 等 2007)、灰黄链霉
菌(Streptomyces griseoflavus) Gö3592中的gilGT (Liu
等2006)和大肠杆菌(Escherichia coli) CFT073中的
iroB (Fischbach 等 2005)。UrdGT2 使乌达霉素前
体物质C9发生C-糖基化形成乌达霉素; gilGT催化
抗癌药物Gilvocarcin V生物合成的C-糖基化; iroB
能将肠菌素 3个C5糖基化形成相应的葡萄糖苷肠
菌素。C-UGTs 在天然药物生物合成中所起的作
用备受关注, 而对于这些特异物种, 由于建立转基
因体系不成熟, 获得转基因植物周期长, 体外研究
却常受高活性羟基基团的阻碍, 以致植物中 C -
UGTs 的研究进展较为缓慢。
本文结论表明, 野葛UGT基因PlUGT3的结构
具有植物 UGTs 蛋白的典型特征区域 PSPG box。
根据它在野葛根和叶中的组织表达, 认为 PlUGT3
可能为组成型表达。至于这一基因在毕赤酵母中
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月 655
图 4 PlUGT3 与其他 UGT 蛋白系统发生的关系
Fig.4 Phylogenetic tree of PlUGT3 and other UGTs proteins
O s01 g0 17 6 2 0 0 (N P_ 0 0 1 04 2 1 79 )和 O s01 g0 69 7 1 0 0 (BAF0 5 8 84 )来源于水稻; UG T 7 3 B1 (N P_5 6 7 9 55 )、UG T7 3 B3
(NP_567953)、UGT73B4 (NP_179151)、At1g73880 (AAP31940)、AT3G16520 (NP_850597)和 UGT72B1 (NP_192016)来
源于拟南芥; AdGt-3 (BAB86921)和 AdGt-4 (BAB86922)来源于红豆; GT29C (ABI94022)、GT99D (DQ875465)、UGT71G1
(AAW56092)和 Ugt85h2 (22PQ6_A)来源于截形苜蓿; UGT73A4 (AAS94329)来源于甜菜; CaUGT2 (AB159213)来源于长春花;
DicGT4(AB191248)来源于康乃馨; 5GT (Y18871)来源于彩虹菊; GmIF7GT (BAF64416)来源于大豆; TOGT1 (AF346431)来源于烟
草; UGT73B6 (AY547304)来源于高山红景天; UFGT (AB031274)来源于黄芩; TWI1 (CAA59450)来源于番茄; UGT89B2 (AAR06921)
来源于甜菊; P lUGT 3 来源于野葛。
图 6 RT-PCR 分析 PlUGT3 在野葛组织中的表达
Fig.6 Expression pattern of PlUGT3 in P. lobata by RT-PCR
的表达, 以及目的蛋白与葛根素生物合成的相关
性、是否具有 C-UGTs 活性正在深入探讨中。
参考文献
黄筑艳, 赵延涛, 李焱(2007). 葛根药理及临床研究进展. 光明中
医, 22 (6): 63~67
吕俊华, 张世平, 沈飞海, 潘竞锵, 谭海荣(2006). 葛根素对 D- 半
乳糖诱导糖基化大鼠脑损害的干预作用. 中国中药杂志, 31
(14): 1184~1187
宋雪鹏, 陈平平, 柴象枢(1988). 葛根素对自发高血压大鼠的降
压作用及对其血浆肾素活性的影响. 中国药理学报, 9 (1):
55~58
王克夷(1994). 糖基转移酶的研究进展. 生物化学与生物物理进
展, 21 (1): 9~13
Bhagwat AS, Krishna TG, Jawali N, Mitra RK (2001). Cloning
and characterization of a ribosomal RNA gene repeat unit
from groundnut. Plant Cell Rep, 20: 193~197
Brazier-Hicks M, Offen WA, Gershater MC, Revett TJ, Lim EK,
Bowles DJ, Davies GJ, Edwards R (2007). Characterization
a n d e n g i n e e r i n g o f t h e b i fu n c t i o n a l N - a n d O -
glucosyltransferase involved in xenobiotic metabolism in
图 5 野葛基因组中 PlUGT3 基因结构
Fig.5 The structure of PlUGT3 gene in P. lobata
植物生理学通讯 第 45 卷 第 7 期，2009 年 7 月656
plants. Proc Natl Acad Sci USA, 104: 20238~20243
Fischbach MA, Lin H, Liu DR, Walsh CT (2005). In vitro
cha ra cter iza t ion of I roB , a pa thogen-a ssocia ted C-
glycosyltransferase. Proc Natl Acad Sci USA, 102 (3):
571~576
Gandia-Herrero F, Lorenz A, Larson T, Graham IA, Bowles DJ,
Rylott EL, Bruce NC (2008). Detoxification of the explo-
sive 2,4,6-trinitrotoluene in Arabidopsis: discovery of bi-
functional O- and C-glucosyltransferases. Plant J, 56 (6):
963~974
Inoue T, Fujita M (1977). Biosynthesis of puerarin in Pueraria
root. Chem Pharm Bull, 25 (12): 3226~3231
Ko JH, Kim BG, Hur HG, Lim Y, Ahn JH (2006). Molecular
c l o n i n g , e x p r e s s i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a
glycosyltransferase from rice. Plant Cell Rep, 25 (7):
741~746
Liu T, Kharel MK, Fischer C, McCormick A, Rohr J (2006).
Inactivation of gilGT, encoding a C-glycosyltransferase, and
gilOIII, encoding a P450 enzyme, allows the details of the late
biosynthetic pathway to gilvocarcin V to be delineated.
Chembiochem, 7: 1070~1077
Mittler M, Bechthold A, Schulz GE (2007). Structure and action
of the C-C bond-forming glycosyltransferase UrdGT2 in-
volved in the biosynthesis of the antibiotic urdamycin. J
Mol Biol, 372 (1): 67~76
Xu ME, Xiao SZ, Sun YH, Zheng XX, Ou-Yang Y, Guan C (2005).
The study of anti-metabolic syndrome effect of puerarin in
vitro. Life Sci, 77: 3183~3196