全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 11期, 2010年 11月1140
收稿 2010-07-21 修定 　2010-08-12
* 通讯作者(E-mai l: bkkua i@fu dan.edu .cn; Tel : 02 1-
6 5 6 4 2 6 4 8 )。
过量表达拟南芥HD-START转录因子 AtHDG11提高黑麦草(Lolium
perenne)抗旱性的初步研究
魏强 1, 宋贺玲 1, 向成斌 2, 蒯本科 1,*
1复旦大学生命科学学院植物科学研究所, 上海 200433; 2中国科学技术大学生命科学学院, 合肥 230027
提要: 本研究通过农杆菌介导法, 获得了 5个 PCR和 Southern 杂交检测阳性的 AtHDG11转基因黑麦草株系。相比野生型
再生植株, 转基因植株具有更发达的根系, 同时在干旱胁迫下具有较低的MDA含量, 并且具有较高水平的超氧化物歧化
酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性。这些结果均显示过量表达 AtHDG11能够提高黑麦草的
耐旱性。
关键词: 黑麦草; 耐旱性; 拟南芥HD-START转录因子
Preliminary Study on Improving Drought Tolerance of Ryegrass (Lolium
perenne) by Overexpressing a HD-START Transcription Factor AtHDG11 from
Arabidopsis
WEI Qiang1, SONG He-Ling1, XIANG Cheng-Bin2, KUAI Ben-Ke1,*
1Institute of Plant Biology, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China; 2School of Life Sciences, University
of Science and Technology of China, Hefei 230027, China
Abstract: Five AtHDG11 transgenic ryegrass lines verified by PCR and Southern blot were obtained by
Agrobacterium mediated transformation. The transgenic ryegrasses had more extensive root system and higher
level of SOD and CAT activity while producing lower MDA content under a water-deficit stress. It indicated that
overexpressing AtHDG11 could improve drought tolerance in ryegrass.
Key words: ryegrass (Lolium perenne); drought tolerance; AtHDG11
AtHDG11是拟南芥HD-START转录因子家族
成员之一。拟南芥中共有 16个HD-START转录
因子, 这些转录因子在拟南芥的正常生长发育过程
中充当中心调节子(Schrick等 2004)。到目前为止,
对AtHDG11的研究甚少。Nakamura等(2006)发现
hdg11具有过度分支的表皮毛, 这种表型在双突变
体 hdg11hdg12中尤为明显。RT-PCR分析显示在
生长 7 d的幼苗, 14 d苗的根, 以及 40 d成熟苗的
叶子、茎秆、花、果荚中都能够检测到 HDG11
的表达。Yu等(2008)发现过量表达AtHDG11能够
显著提高转基因拟南芥和烟草的抗旱性, 降低转基
因植株的气孔密度; 转基因植株根系更为发达, 同
时积累ABA和脯氨酸和具有较高水平的SOD活性,
并且能够上调众多响应干旱胁迫的基因的表达; 而
无论是 hdg11还是 hdg11hdg12的抗旱性与野生型
拟南芥都没有差别。Cao等(2009)也发现在高羊茅
中过表达AtHDG11能够显著提高转基因植株的耐
旱性和耐盐性。以上研究显示AtHDG11在改良植
物的抗干旱性和耐盐性上具有重要的应用潜力。
本研究通过农杆菌侵染黑麦草胚性愈伤组织,
将由 4个 35S增强子和玉米Actin1启动子驱动的
AtHDG11导入黑麦草, 比较了干旱胁迫下转基因和
野生型再生黑麦草的MDA含量、SOD和 CAT活
性, 初步证实来源于拟南芥的AtHDG11在黑麦草中
同样具备抗旱的生理功能, 可以用来改良禾本科植
物黑麦草的抗旱特性。
材料与方法
采用黑麦草(Lolium perenne L.)商业品种
‘Impulse’的成熟胚作为外植体诱导愈伤组织, 含外
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源基因 AtHDG11的植物表达载体 pCB2004C由中
国科学技术大学向成斌提供(图1)。农杆菌LBA4404
由本实验室保存。
胚性愈伤组织诱导培养基(I): MS+3 mg·L-1 2,
4-D+0.1 mg·L-1 6-BA+ 0.5 g·L-1肌醇+0.5 g·L-1水解
酪蛋白 +2 g·L-1凝胶(Gelrite)+30 g·L-1 蔗糖, pH 5.8。
继代培养基(SI): MS+3 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 6-
BA+2.5 g·L-1 脯氨酸 +0.5 g·L-1水解酪蛋白 +3 g·L-1
Gelrite+30 g·L-1蔗糖, pH 5.8。分化培养基(R):
MS+0.2 mg·L-1 KT+3 g·L-1 Gelrite+30 g·L-1 蔗糖, pH
5.8。生根培养基(Rt): 1/2MS+3 g·L-1 Gelrite+30 g·L-1
蔗糖, pH 5.8。
将胚性愈伤组织和含有pCB2004C表达载体的
农杆菌菌液于25℃, 100 r·min-1的摇床, 侵染30 min,
用无菌滤纸吸除多余菌液, 转移干燥愈伤组织于固
体共培养基上[I+100 μmol·L-1乙酰丁香酮(acetosy-
ringone), pH 5.2], 25℃黑暗培养 3 d。共培养后的
愈伤组织用洗脱培养基[MS+3%蔗糖 +250 mg·L-1
头孢噻肟钠(cefotaxime sodium), pH 5.8]进行洗脱,
并于无菌滤纸吸干愈伤表面水分, 转接到筛选培养基
[I+3 mg·L-1膦丝菌素(phosphinothricin, PPT)+500
mg·L-1头孢噻肟钠, pH 5.8]上筛选, 25 ℃暗培养, 3
周后继代一次。挑选新生愈伤组织接种于抗性愈
伤分化培养基(R+3 mg·L-1 PPT+250 mg·L-1头孢噻
肟钠, pH 5.8)上, 25 ℃光照培养 3~4周, 再生的小
苗转移到 1/2MS抗性苗生根培养基(Rt+3 mg·L-1
PPT+250 mg·L-1头孢噻肟钠, pH 5.8)上进行壮苗,
2~3 周后移栽到珍珠岩:蛭石:黑土为1:3:9的混合基
质中正常培养。
根据Bar基因序列设计PCR引物, 用于转基因
植株的检测, 引物序列如下, F: 5 GTCTGCACC-
ATCGTCAACC 3; R: 5 GAAGTCCAGCTGC-
CAGAAACC 3。PCR 反应条件为 94 ℃, 5 min; 94
℃变性45 s, 55 ℃退火45 s, 72 ℃延伸30 s, 35个循
环; 72 ℃, 10 min。
点杂交参照《分子克隆实验指南》(萨姆布
鲁克和拉塞尔2002)书中所述方法进行, 采用CTAB
大量抽提植物基因组 D N A 法提取黑麦草植株
DNA, 探针标记使用TAKARA公司的随机引物标记
试剂盒。
以稀释500倍的Basta (含18.19%有效成分)涂
抹野生型再生黑麦草和转基因植株叶片检测转基因
植株的除草剂抗性。每株选 3个分蘖作为重复, 叶
片为每分蘖的倒二叶, 叶背和叶腹均需均匀涂抹至
液滴下滴为止, 4 d后观察叶片颜色变化。
取生长状态良好的转基因和野生型再生黑麦
草植株, 以 8~9个分蘖(自然分蘖的方式)为一组进
行干旱胁迫。材料种于含 30 g珍珠岩(购自上海园
林所)的 10 cm×10 cm盆钵中, 地下部分保持 6 cm
的长度, 地上部分保持 16 cm的高度, 在 1/2PNS营
养液中恢复 1周(每隔 3 d浇一次营养液), 随后进
行干旱处理。对照组保持水份含量正常, 即每隔 3
d浇一次营养液; 处理组则连续 12 d不浇水。每组
设 3 个重复。
丙二醛(MDA)含量测定参照《现代植物生理
学实验指南》(中国科学院上海植物生理研究所和
上海市植物生理学会1999)书中方法。超氧化物歧
化酶(SOD)活性按Beauchamp和Fridovich (1971)文
中所述方法测定。过氧化氢酶(CAT)活性按 Beers
和 Sizer (1952)文中所述方法测定。
结果与讨论
1 黑麦草 ‘Impulse’高效再生系统的建立
针对黑麦草 ‘Impulse’品种, 从抑制成熟胚提
前萌发并促进胚性细胞形成的角度入手, 使用适当
的激素比例及必要的有机添加物, 来建立高频再生
系统。在基本培养基成分上, 选用了高盐的基本培
养基MS。虽然很多禾本科植物特别是水稻上偏
图 1 植物表达载体 pCB2004C的 T-DNA区域
Fig.1 Schematic diagram of the T-DNA region of expression vector pCB2004C
polyA: 来源于花椰菜花叶病毒的 35S终止子; Bar: 膦丝菌素转移酶基因; 35S: 来源于花椰菜花叶病毒的 35S启动子; Es: 4个 35S
增强子; Actin1: 玉米泛素启动子; TNOS: 冠瘿碱合成酶基因终止子。
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向于N6培养基, 但在预备试验中我们没有发现二者
之间的显著差异。
在激素比例和必要有机添加物的选择上, 设立
9种供试培养基(表 1)。2,4-D是诱导禾本科植物
胚性愈伤组织最常使用的生长素。本实验选择
2、4和 6 mg·L-1的 2,4-D, 通过比较培养基 1号、
2号和3号对愈伤组织诱导的效果(图2-A~C), 结果
发现 6 mg·L-1 的 2,4-D (图 2-C)对抑制成熟胚萌发
表 1 愈伤组织诱导培养基优化组合试验中各供试培养基成分
Table 1 Components of different culture medium for optimizing the calluse induction
培养基 2,4-D/mg·L-1 6-BA/mg·L-1 ABA/mg·L-1 甘露醇 /mol·L-1 肌醇 /g·L-1 水解干酪素 /g·L-1 蔗糖 /g·L-1 Gelrite/g·L-1
1号 2 0.1 — — 0.1 0.5 3 0 2
2号 4 0.1 — — 0.1 0.5 3 0 2
3号 6 0.1 — — 0.1 0.5 3 0 2
4号 2 0 — — 0.1 0.5 3 0 2
5号 4 0 — — 0.1 0.5 3 0 2
6号 3 0.1 — — 0.5 0.5 3 0 2
7号 3 0 2 0 0.1 0.5 3 0 2
8号 3 0 0 0.3 0.1 0.5 3 0 2
9号 3 0 0 0.3 0.1 0.5 3 0 2
图 2 培养基中不同添加物对黑麦草愈伤组织质量的影响。
Fig.2 Effect of different components in culture medium on calluse quality of ryegrass
A~ I 对应表 1 中培养基 1 号 ~ 9 号。
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效果明显。虽然 6 mg·L-1的 2,4-D 对抑制成熟胚
提前萌发效果显著, 但鉴于高浓度的 2,4-D可能造
成潜在的体细胞变异, 特别是在转基因过程中还要
经过 2个月的抗性筛选, 因此最后确定中间浓度 3
mg·L-1 2,4-D作为既定实验浓度。很多研究认为在
愈伤组织形成的初期不宜添加 6-BA, 本实验表明,
6-BA对于诱导愈伤组织起到抑制作用, 抑制胚性细
胞形成, 促进胚萌发; 但低浓度的 6-BA, 如 0.1 mg·L-1
剂量可以改进已经形成的愈伤组织质量, 减少水渍
化或玻璃状的愈伤组织[培养基 1、2号(图 2-A、
B)与培养基 4、5号(图 2-D、E)比较]。因此本
实验确定生长素和细胞分裂素以3 mg·L-1 2,4-D和
0.1 mg·L-1 6-BA组合。在培养基 6号中(图 2-F)添
加5倍于常规肌醇浓度, 结果显示高浓度肌醇对于
愈伤组织的形成和成熟胚的提前萌发都有促进作
用, 这种促进作用在形成愈伤组织的高峰期即接种
后 20 d左右更加明显。培养基 7号、8号和 9号
(图 2-G~I)中不添加 6-BA, 分别添加 2 mg·L- 1
ABA、0.3 mol·L-1或 0.6 mol·L-1甘露醇提高培养
基渗透势, 观察渗透势对于愈伤组织形成的影响。
有研究认为在高羊茅成熟胚诱导愈伤组织初期, 2
mg·L-1的ABA或脯氨酸可以抑制胚芽和根生长, 提
高成熟胚愈伤组织的诱导率(胡张华等2003), 本实
验没有得到类似结果, 在添加2 mg·L-1的ABA以及
0.3或0.6 mol·L-1甘露醇培养基中, 胚芽生长势得到
明显抑制, 但同时也抑制了愈伤组织的形成, 在 20
d左右没有愈伤组织形成或愈伤组织很小, 并且质
地坚硬, 0.6 mol·L-1甘露醇几乎完全抑制离体成熟
胚的进一步发育, 从 3周至 6周的时间内基本处于
发育停滞状态。具体原因还有待于进一步研究。
本实验表明, 从成熟胚诱导胚性愈伤组织过程
中采用MS+3 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 6-BA+0.5
g·L-1肌醇 +0.5 g·L-1水解酪蛋白 +2 g·L-1 Gelrite+30
g·L-1蔗糖作为基本培养基, 对于‘Impulse’黑麦草诱
导愈伤组织、抑制成熟胚提前萌发是合适的(图
2 )。
2 转基因植株的获得
通过农杆菌介导法(图 3)获得了 5株经 PCR
(图 4)和 Southern杂交(图 5)检测阳性的转基因
‘Impulse’黑麦草植株, 分别命名为: T1、T2、T3、
T4和 T5。使用稀释 500倍的 Basta (含 18.19%有
效成分)涂抹野生型再生黑麦草和转基因植株叶片,
结果(图 6)表明上述 5个转基因株系均具有除草剂
抗性。 转基因植株相比野生型植株具有较为发达
的根系(图7), 这与Yu等(2008)和Cao等(2009)报道
一致。
3 转基因植株的抗旱性鉴定
挑取 T0代T3和T4转基因植株用于鉴定植株
抗旱性, 野生型再生黑麦草作为对照, 12 d后观察。
结果(图 8)表明T3和T4均比野生型再生黑麦草具
有更强的抗干旱能力, 尤其是T4, 干旱处理 12 d后
仍有一半叶片保持直立伸展, 而对照植株萎蔫严
重。
MDA是细胞膜脂过氧化作用的主要产物之一,
MDA含量的高低可以反映出质膜破坏程度, 从而可
以间接的反应出植株抵抗逆境的能力。在逆境胁
迫下MDA含量低的植株具有更强的耐逆能力, 反
之, 则抵抗逆境的能力差。通过测定在干旱胁迫下
转基因株系 T3、T4和野生型植株的MDA含量显
示, T3、T4和野生型植株MDA含量随着干旱胁
迫时间的增加而显著增加, 但是2个转基因株系无
论是MDA的绝对含量还是相对增加程度都显著低
于野生型, 因此具有更强的抗旱性(图 9)。
4 转基因和野生型黑麦草在干旱胁迫下的SOD和
CAT活性
SOD、CAT等保护酶类在植物体内协同作用,
在逆境胁迫中清除过量的活性氧, 维持活性氧的代
谢平衡, 保护膜结构, 从而使植物在一定程度上忍
耐、减缓或抵御逆境胁迫伤害。通过测定干旱胁
迫下转基因野生型植株的SOD活性, 结果(图10)表
明干旱胁迫下转基因和野生型植株的SOD活性都
呈单峰曲线。野生型植株在干旱胁迫 6 d的时候
SOD活性达到最大, 而后急剧下降; 而转基因植株
则在干旱胁迫10 d的时候达到最大, 后有较大的回
落, 但是从峰值到低谷的降低幅度要明显小于野生
型。SOD活性和自由基之间是一种动态平衡关系,
自由基累积诱导SOD活性上升, 二者在一定范围内
保持动态平衡, 但到后期, 膜脂过氧化严重, 自由基
含量超出SOD的淬灭能力, SOD 的活性急剧下降,
但就总体SOD活性而言转基因植株在干旱胁迫下
具有更高水平的 SOD酶活性, 同Yu等(2008)结论
一致。在植物体内 SOD催化O2-发生歧化反应进
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图 3 转基因植株的获得
Fig.3 Regeneration of transgenic plants
A: 胚性愈伤组织的分化和再生; B: PPT 抗性愈伤组织的筛选和转基因植株的再生; C: 转基因植株的生根和土壤生长。
图 4 AtHDG11转化黑麦草的 PCR鉴定
Fig.4 Identification of AtHDG11 in transgenic ryegrass by PCR
M: DL2000; +: 阳性对照; Wt: 野生型再生 ‘Impulse’黑麦草对照; T1~T5: 检测阳性的转基因 ‘Impulse’黑麦草独立株系。下图同此。
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图 5 AtHDG11转化植株的 Southern杂交鉴定
Fig.5 Identification of AtHDG11 in transgenic
ryegrass by Southern blot
图 6 转基因植株除草剂抗性鉴定
Fig.6 Identification of Basta resistantance of transgenic plants
图 7 转基因和野生型黑麦草根系比较
Fig.7 Comparison on root system of transgenic
and wild type ryegrass
图 8 转基因和野生型黑麦草在正常浇水和
干旱胁迫 12 d下的表型
Fig.8 Performance of transgenic and wild type ryegrass
under the condition of normal-watered and
12-day-water-deficit
图 9 转基因和野生型黑麦草干旱胁迫处理
过程中的 MDA含量变化
Fig.9 Change of MDA content in transgenic and wild type
ryegrass druing the drought stress treatment process
而解除其毒性伤害, 而歧化反应过程中所产生的
H2O2则由 CAT等来清除。干旱处理后, 转基因和
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性, 与 Cao等(2009)报道一致, 具体原因仍待进一
步研究。
Yu等(2008)推测AtHDG11可能通过直接或间
接地方式调控了一个复杂的基因网络, 但还不清楚
AtHDG11具体是通过什么方式来参与胁迫调控路
径的, 然而这个基因在提高植株抗旱性方面是极为
显著的, 我们将继续获得更多的转基因植株, 从更
多的角度, 如ABA合成、脯氨酸含量等继续研究,
以便理解这个基因的功能, 特别是这样一个来自于
双子叶植物中的基因, 在单子叶植物黑麦草中仍具
有相似的功能, 这一点是值得深入探讨的。
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图 10 转基因和野生型黑麦草干旱胁迫处理
过程中的 SOD活性变化
Fig.10 Change of SOD activity in transgenic and wild type
ryegrass druing the drought stress treatment process
图 11 转基因和野生型黑麦草干旱胁迫处理
过程中的CAT活性变化
Fig.11 Change of CAT activity in transgenic and wild type
ryegrass druing the drought stress treatment process
野生型植株体内CAT活性同SOD活性变化趋势相
似, 呈单峰曲线, 野生型和 T3、T4在处理第 10天
CAT活性最高, 而后急剧回落(图 11)。但总体而
言, T3、T4具有更高水平的 CAT活性, 清除H2O2
能力强于野生型植株。此外, Yu等(2008)和Cao等
(2009)发现在过表达AtHDG11条件下, 转基因植株
具有显著高于野生型植株的本底SOD活性, 本实验
没有得到类似的结果, 相反转基因植株的本底SOD
活性显著低于野生型植株。与此同时我们发现转
基因植株具有明显高于野生型植株的本底CAT活