全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 10 期, 2010 年 10 月 1061
收稿 2010-05-13 修定 　2010-07-30
资助 黑龙江省自然基金重点项目(ZD 20091 8)和中央高校基
本科研业务费专项资金(D L0 9BA14 )。
* 通讯作者(E-mail: yaguangzhan@126.com; Tel: 0451-
8 2 1 9 1 7 5 2 )。
可用于实时荧光定量 PCR标准化的白桦内参基因
尹静 1, 任春林 1, 詹亚光 1,*, 滕文华 2, 陈秀福 1, 王玉成 3, 孙红冉 1
东北林业大学 1 生命学院; 2 帽儿山实验林场, 3 林学院, 哈尔滨 150040
提要: 为了快速、准确的对白桦多个样品进行基因表达分析, 本研究应用荧光定量PCR技术, 对白桦持家基因微管蛋白基
因(Tu)和泛素基因(UbQ)在不同处理的细胞及不同树龄或不同生长季节白桦植株各部位表达的稳定性进行检测。结果表明,
对于茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)处理的白桦细胞和不同生长季节白桦植株的基因定量表达分析, 可同时使用Tu和UbQ
平衡化qRT-PCR数据; 而针对不同树龄白桦茎皮中基因表达研究时, 单独使用UbQ基因作为内参对照即可获得精确的表
达数据。
关键词: 白桦; 实时定量PCR; 持家基因
Selection of Internal Control Genes for Real-Time RT-PCR Normalization in
White Birch (Betula platyphylla Suk.)
YIN Jing1, REN Chun-Lin1, ZHAN Ya-Guang1,*, TENG Wen-Hua2, CHEN Xiu-Fu1, WANG Yu-Cheng3, SUN Hong-Ran1
1College of Life Sciences, 2Maoershan Experimental Forestry Center, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin
150040, China
Abstract: In order to facilitate rapid and accurate gene expression analysis of multiple samples from birch, the
expression stability of housekeeping genes such as genes coding micro-tube protein (Tu) and ubiquitin (UbQ)
were assessed by qRT-PCR using a set of cDNAs from different birch samples including cells after different
treatments and different parts of birch plants in different ages or different growing seasons. The results sug-
gested that the Tu and UbQ genes could provided superior transcript normalization in birch cells treated with
different elicitors (MeJA and SA), and birch plants in different growing seasons, while UbQ gene was the
recommended reference gene for gene expression studies using cDNAs from white birch bark in defferent
years.
Key words: birch; real-time RT-PCR; housekeeping gene
实时定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-
PCR)因为快速、灵敏和定量的特点, 已经成为分
析基因转录水平及进行芯片和微点阵数据验证的常
用手段, 这种方法比传统的Northern杂交更安全和
精确, 并且所需起始材料的量较少。但是实验过程
会因为 RNA的质量和数量、cDNA合成效率以及
PCR扩增的差异而导致结果严重偏差(Vandesompele
等 2002)。为了得到更精确的数据, 通常需要一个
和多个内对照基因来平衡化 qRT- PCR 数据。目
前一般选择持家基因(housekeeping gene)作为内对
照, 持家基因编码的蛋白是维持细胞结构和基本代
谢所必需, 所以其表达水平在各种环境下基本保持
一致。持家基因包括泛素(ubiquitin, UbQ)、肌动
蛋白( actin)、微管蛋白( tubul in, Tu)、组蛋白
(histone)、18S rRNA 以及甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶
(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,
GAPDH)等基因。然而, 很多持家基因的表达水平
随着环境的改变和组织部位的不同而发生变化
(Thellin等 1999; Lee等 2002; Czechowski 等 2005),
如肌动蛋白基因是葡萄浆果发育过程中最稳定的内
对照基因之一(Reid等2006), 但在某些实验中肌动
蛋白则表现不稳定(涂礼莉等2007)。Nicot等(2005)
研究表明, 在马铃薯应对生物胁迫(晚疫病)和非生
物胁迫(冷和盐害)过程中, 内参基因选择因处理不
同而差异显著。因此, 选择合适的持家基因作为
qRT-PCR 内参非常必要。
植物生理学通讯 第 46 卷 第 10 期, 2010 年 10 月1062
白桦的树叶和树皮中富含三萜类化合物, 药用
价值广泛, 加之其生长迅速, 材质优良, 是重要的经
济树种。本实验以白桦细胞和白桦植株为试材, 对
持家基因UbQ和Tu在白桦细胞悬浮培养过程及白
桦植株不同组织表达水平的稳定性进行了检测, 以
期为白桦中重要基因的定量表达研究提供更为准确
的数据。
材料与方法
1 实验材料
1.1 白桦细胞来源及处理 白桦(Betula platyphylla
Suk.)母树取自本校白桦强化种子园, 5~7年生嫁接
优树(接穗 30 年生)诱导的组培苗。
以白桦组培苗茎段为外植体, NT 为基本培养
基, 附加激素 0.01 mg·L-1 TDZ 和 0.1 mg·L-1 BA, 诱
导愈伤组织。稳定继代 3 次后, 取 3 g (FW)愈伤
组织转移到含有100 mL相同液体培养基的250 mL
三角瓶。悬浮培养第 7 天进行水杨酸(SA)诱导处
理, 同时设立对照组(等量的 0.5% 乙醇水溶液)。
SA 的终浓度为 50 mg·L-1, 处理后 0 h、2 h、12
h、1 d、3 d、5 d 和 7 d 分别收获细胞。处理
重复 3 次, 每次均按如上取样。细胞于液氮速冻,
-80 ℃保存, 待提取 RNA。
以白桦无菌苗茎段为外植体, IS为基本培养基,
附加激素0.8 mg·L-1 6-BA和0.6 mg·L-1 NAA诱导愈
伤组织, 稳定继代 3 次后, 取 3 g (FW)愈伤组织转
移到250 mL三角瓶中进行悬浮培养, 其中含有100
mL B5液体培养基, 添加激素0.2 mg·L-1 6-BA和0.6
mg·L-1 TDZ, 然后在悬浮培养的第 7天分别进行 10
μmol·L-1 和 100 μmol·L-1 茉莉酸甲酯(MeJA)及 500
μmol·L-1 布洛芬(IBU, 即 MeJA合成专一性抑制剂)
3 种处理, 同时设立对照组(0.5% 乙醇水溶液), 每
种处理重复 3 次。MeJA 和 IBU 处理后 0 h、6 h、
12 h、1 d、2 d 和 3 d 分别收获细胞。细胞于
液氮速冻, -80 ℃保存, 待提取 RNA。
NT和B5 液体培养基均添加 20 g·L-1蔗糖、pH
值为 6.0~6.5, 以 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min, 培养
温度为 23 ℃~26 ℃, 光照强度为 40 μmol·m-2·s-1, 光
照时间为 16 h·d-1, 湿度为 65% 左右, 摇床转速为
120 r·min-1。
1.2 白桦植株来源及取样 不同树龄(一年生、四
年生、六年生、八年生)白桦植株来自东北林业
大学白桦强化种子园, 除一年生白桦苗在2008年5
月 ~10月期间每月取样外, 其余树龄均于 6月中旬
一次取样。样品包括不同树龄叶片、根皮和茎皮
部分。液氮速冻后, -80 ℃冰箱保存, 待提取RNA。
2 实验方法
2.1 RNA抽提及 cDNA合成 RNA 提取采用 Tris-
CTAB 法, 不同样品总 RNA 用 DNase I (Promega)
处理, RNA 完整性通过 1.4% (W/V)琼脂糖胶电泳
检测。用 Eppendorf DU800 分光光度计(Eppendorf
AG)分析核酸浓度。取 A260/A280 在 1.9~2.1 之间及
A260/A230 大于 2.0 的 RNA 进行 cDNA 合成。
cDNA的合成操作参照TaKaRa PrimeScriptTM
1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书, 以 500 ng 总
RNA 为起始材料, 合成 cDNA 第一链。反应结束
后, 加 180 μL 去离子水稀释, 于-20 ℃保存备用。
2.2 实时荧光定量PCR反应体系及程序 选择白桦
微管蛋白基因(alpha-tubulin, Tu, GenBank 号为
FG067376)和泛素基因(Ubiquitin, UbQ, GenBank号
为FG065618) 2个持家基因, 根据已知基因序列, 同
时依据real-time RT-PCR 引物设计原则, 利用Primer
Premier 5.0 软件进行引物设计。引物序列见表 1。
表 1 实时荧光定量 PCR 使用的持家基因引物序列
Table 1 Primers for quantitative real-time PCR
基因 5 → 3
UbQ (R) GATTGAGGGGAGGGATGCTG
UbQ (L) GGAGGACAAGGTGGAGGGTG
Tu (R) TCAACCGCCTTGTCTCTCAGG
Tu (L) TGGCTCGAATGCACTGTTGG
实时荧光定量PCR所用试剂盒为TOYOBO公
司(日本)生产的 SYBR Green Realtime PCR Master
Mix-Plus- (code No.QPK-212T)。PCR 反应体系含
有 3.1 μL 蒸馏水、10 μL SYBR Green Realtime
PCR Master Mix-Plus-, 2 μL Plus solution、1.2 μL
引物R (10 μmol·L-1)、1.2 μL引物L (10 μmol·L-1)、
2.5 μL 稀释的 cDNA 模板。所有试验样品均重复
3 次。PCR 反应在 OPTION II (MJ Research 公司)
荧光定量 PCR 仪上完成。PCR 反应程序为: 94 ℃
植物生理学通讯 第 46 卷 第 10 期, 2010 年 10 月 1063
预变性 30 s; 94 ℃变性 12 s; 58 ℃退火 30 s; 72 ℃
延伸 40 s; 82 ℃, 1 s; 读板。45 次循环。每 0.5 ℃
进行熔解曲线(melting curve)扫描, 温度范围 55~
99 ℃。
结果与讨论
1 SA处理下白桦细胞中持家基因表达变化
设定 0.01为荧光定量PCR的阈值, Tu和UbQ
这2个持家基因的熔解曲线均为单一峰值, 熔解温
度分别为 84 ℃和 86 ℃, 确定产物单一。结合PCR
测序结果, 与已知白桦基因 Tu 和 UbQ序列同源性
达 99%, 1 个碱基的差异可能是荧光产物测序过程
中造成的误差。
在NT培养基上进行愈伤组织诱导和悬浮培养
的白桦细胞, 悬浮培养的第 7 天, 50 mg·L-1 的 SA
处理后不同时间点取样, 结果表明, 除Tu基因在SA
及对照处理早期(2 h)基因表达量略低(Ct 值略高于
其他处理)和UbQ基因在SA处理2 h时表现表达量
显著高于其他处理外, 其他处理下, 2 个持家基因
表达量表现稳定(图 1)。Tu、UbQ 和 Tu+UbQ 在
各处理间变异系数分别为 0.083、0.068 和 0.061
(表 2), 可以确定Tu+UbQ组合在使用NT培养基培
养的白桦细胞基因定量表达分析时作为内参比单独
使用 Tu 或 UbQ 基因效果更佳。
图 1 水杨酸(50 mg·L-1)处理的白桦细胞中持家基因 Tu 和 UbQ 的 Ct 检测值
Fig.1 The Ct value of housekeeping genes Tu and UbQ in birch cells treated with 50 mg·L-1 salicylic acid
0 h: 处理前; 2hck: 对照处理 2 h; 2hSA: 50 mg·L-1 SA 处理 2 h; 12hck: 对照处理 12 h; 12hSA: 50 mg·L-1 SA 处理 12 h; 1dck: 对照
处理 1 d; 1dSA: 50 mg·L-1 SA 处理 1d; 3dck: 对照处理 3 d; 3dSA: 50 mg·L-1 SA 处理 3d; 5dck: 对照处理 5 d; 5dSA: 50 mg·L-1 SA 处理 5 d;
7dck: 对照处理 7 d; 7dSA: 50 mg·L-1 SA 处理 7 d。图中不同大小写字母分别表示同一持家基因处理间 Ct 值在 0.01 和 0.05 水平差
异显著, 下图同。
表 2 不同处理下白桦细胞及白桦植株各部位中持家基因 Ct 值变异系数
Table 2 The coefficient of variation of Ct value of housekeeping gene in different cells under different treatments
and in different parts of birch trees
材料 持家基因 最大值 最小值 平均值 标准差(SD) 变异系数(CV)
MeJA 处理白桦细胞 Tu 22.408 17.043 18.780 1.410 0.075
UbQ 19.984 15.238 17.812 1.250 0.070
Tu+UbQ 20.455 17.377 18.295 0.980 0.054
SA 处理白桦细胞 Tu 26.625 20.069 22.186 2.054 0.083
UbQ 24.542 19.841 21.765 1.820 0.068
Tu+UbQ 25.583 20.550 21.905 1.738 0.061
不同季节白桦植株各部位 Tu 28.669 18.978 22.218 2.034 0.092
UbQ 22.288 17.341 20.277 1.675 0.083
Tu+UbQ 25.203 19.422 21.247 1.490 0.070
不同树龄植株 Tu 28.669 20.143 20.759 3.560 0.150
UbQ 22.288 20.108 21.195 0.996 0.047
Tu+UbQ 25.203 20.125 22.477 2.117 0.094
植物生理学通讯 第 46 卷 第 10 期, 2010 年 10 月1064
图 2 茉莉酸甲酯及其抑制剂 IBU 处理的白桦细胞中持家基因 Tu 和 UbQ 的 Ct 值检测
Fig.2 The Ct value of housekeeping genes Tu and UbQ of birch cells treated with MeJA and IBU
0h: 处理前; 6h IBU: 500 μmol·L-1 IBU 处理 6 h; 12h IBU: 500 μmol·L-1 IBU 处理 12 h; 1d IBU: 500 μmol·L-1 IBU 处理 1 d; 2d IBU:
500 μmol·L-1 IBU 处理 2 d; 3d IBU: 500 μmol·L-1 IBU 处理 3 d; 6h MeJA/10: 10 μmol·L-1 MeJA 处理 6 h; 12h MeJA/10: 10 μmol·L-1 MeJA
处理 12 h; 1d MeJA/10: 10 μmol·L-1 MeJA 处理 1 d; 2d MeJA/10: 10 μmol·L-1 MeJA 处理 2 d; 3d MeJA/10: 10 μmol·L-1 MeJA 处理 3 d; 6h
MeJA/100: 100 μmol·L-1 MeJA 处理 6 h; 12h MeJA/100: 100 μmol·L-1 MeJA 处理 12 h; 1d MeJA/100: 100 μmol·L-1 MeJA 处理 1 d; 2d
MeJA/100: 100 μmol·L-1 MeJA 处理 2 d; 3d MeJA/100: 100 μmol·L-1 MeJA 处理 3 d。
2 MeJA处理的白桦细胞中持家基因表达变化
由图 2 表明, 经过 IS培养基诱导愈伤组织, 再
在B5培养基中进行悬浮培养的白桦细胞, 在培养中
期(第 7天)加入不同浓度(10 μmol·L-1 和 100 μmol·L-1)
MeJA 或 MeJA 合成的专一性抑制剂 IBU (500
μmol·L-1)后不同时间取样, 结果表明, Tu 基因在 10
μmol·L-1和100 μmol·L-1 MeJA分别处理12 h及 IBU
处理 1 d 时, Ct 值极显著高于其他处理; UbQ 基因
在 IBU 处理 6 h、12 h、2 d 时, 10 μmol·L-1 MeJA
处理2 d和100 μmol·L-1 MeJA处理6 h, Ct值显著低
于其他处理; 而 Tu+UbQ的Ct值也仅在 IBU处理 1
d和 10 μmol·L-1 MeJA处理 12 h和 1 d时, 极显著高
于其他处理外, 其他处理间 Tu、UbQ 和 Tu+UbQ
的Ct值均基本表现稳定, 结合Tu、UbQ和Tu+UbQ
的Ct值的变异系数分别为0.075, 0.070和0.054 (表
2), 可以确定 Tu、UbQ 和 Tu+UbQ 在各处理间表
植物生理学通讯 第 46 卷 第 10 期, 2010 年 10 月 1065
图 3 一年生白桦植株不同部位持家基因 Tu 和 UbQ 的 Ct 值变化
Fig.3 The Ct value of housekeeping genes Tu and UbQ in different tissues of white birch
达变化很小, 且以Tu+UbQ同时使用时变异系数最
低, 可以明确同时使用这 2 个持家基因组合作为
MeJA及其抑制剂IBU处理的白桦细胞基因定量表
达的内参对照效果最佳。
3 白桦植株中持家基因表达变化
在整个生长季节(哈尔滨) 6~10 月期间, 一年
生白桦植株中根皮、叶片和茎皮中持家基因Tu和
UbQ 的表达略有变化, 如 Tu 基因在 6 月、7 月茎
皮及8月根中表达量较高(Ct值低于其他处理)外, 其
他处理间相对稳定; UbQ 基因在 6 月叶、根, 7 月
和 10月叶中, Ct 值较高; 而 Tu+UbQ基因Ct 值在 6
月叶和根中表现高于其他处理, 其他时间各部位 2
个持家基因的表达量相对稳定, T u、U b Q 及
Tu+UbQ 基因各处理表达量的变异系数分别为
0.092、0.083 和 0.070, 因此, 可以明确在不同生长
季节内白桦植株中各部位2个内参基因的表达量基
本稳定 , 但在进行基因定量表达研究时使用
Tu+UbQ 组合作为内参对照, 能够更好的对表达量
进行平衡化(图 3、表 2)。
对不同树龄白桦茎皮中持家基因Tu和UbQ的
Ct 值检测结果表明, 一年生、四年生、六年生和
八年生的白桦茎皮中Tu基因及Tu+UbQ基因Ct值
植物生理学通讯 第 46 卷 第 10 期, 2010 年 10 月1066
变异系数分别为0.150和0.094, 显著高于单独使用
UbQ基因的变异系数0.047, 且Tu基因的Ct值在八
年生的茎皮中显著高于其他树龄, 而UbQ基因在不
同树龄茎皮间的表达变化不显著, 说明检测不同树
龄茎皮中基因的定量表达变化仅需UbQ基因作为
内参对照(图 4、表 2 )。
图 4 不同树龄白桦茎皮中持家基因Tu 和UbQ 的Ct 值变化
Fig.4 The Ct value of housekeeping genes Tu and UbQ in
stem skin of white birch at different ages
树龄茎皮中某些基因的定量表达变化, 仅需UbQ基
因作为内参对照(图 4、表 2)。最终明确白桦持家
基因Tu和UbQ在不同诱导子处理的白桦细胞和不
同部位及生长时期白桦植株的表达量均较稳定, 可
以作为白桦内参基因在荧光定量基因表达中应用。
参考文献
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本研究中使用来自2种培养条件下(IS和NT培
养基)的白桦悬浮细胞, 并分别利用来源于细胞中的
内源性诱导子进行处理, 可以明确2种培养条件下
的白桦细胞中持家基因 Tu 和 UbQ 表达基本稳定,
且以 Tu+UbQ共同使用对于平衡 qRT-PCR数据效
果最佳。同时对生长季节内一年生白桦植株各部
位 2个内参基因表达分析的结果表明, 在进行基因
定量表达研究时, 使用Tu+UbQ组合作为内参对照
能更有效地对表达量进行平衡化, 而如果检测不同