全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月 125
小麦成熟胚脱分化过程CDPKs基因的差异表达分析
雷志华 1,2, 崔琰 1, 赵一丹 1, 陈军营 1, 陈新建 1,*
1 河南农业大学农学院, 郑州 450002; 2 郑州师范高等专科学校生命科学系, 郑州 450044
提要: 用Affymetrix小麦基因芯片检测小麦成熟胚脱分化过程中 CDPKs基因的表达变化的结果表明, 在检测到的 16个
CDPKs基因中, 有 15个基因在小麦成熟胚脱分化过程中发生了有意义变化, 其中上调表达基因有 12个, 上调 2~7.5倍, 下
调表达基因有 2个, 下调 3~6.1倍, 在不同时点既有上调又有下调的 1个。根据已知CDPKs生物功能和它们表达变化趋势
以及这些变化趋势与脱分化过程中的吻合程度分析结果, 推测CPK2A、CPK2B、CPK6和Os12g0169800基因参与了小麦
成熟胚脱分化过程的启动和愈伤组织的形成。
关键词: 蛋白激酶; CDPKs; 基因芯片; 脱分化
Analysis of Different Expression of CDPKs Genes in the Dedifferentiation of
Mature Wheat Embryo
LEI Zhi-Hua1,2, CUI Yan1, ZHAO Yi-Dan1, CHEN Jun-Ying1, CHEN Xin-Jian1,*
1College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2Life Sciences Department, Zhengzhou Teachers
College, Zhengzhou 450044, China
Abstract: Expression profiles of CDPKs genes were analyzed by Affymetrix Microarray technique during
wheat mature embryo dedifferentiation. Out of 16 CDPKs genes detected by microarray, 15 genes were signifi-
cantly changed in expression pattern during dedifferentiation of mature wheat embryo. Furthermore, 12 genes
were up-regulated by 2–7.5 times, 2 genes were down-regulated by 3–6.1 times, and 1 gene was up- or down-
regulated at the different stages of dedifferentiation. According to the known functions of CDPKs, their changed
trend and the coincidence of the trend and the dedifferentiation degree, it was predicted that CPK2A, CPK2B,
CPK6 and Os12g0169800 might play roles in the initiation of dedifferentiation of mature wheat embryos and the
formation of calli.
Key words: protein kinases; CDPKs; gene microarray; dedifferentiation
收稿 2008-11-06 修定 2008-12-24
资助 国家转基因植物研究与产业化专项基金(JY03-B-19-2)和
河南省杰出人才创新基金(02 21 00 09 0)。
* 通讯作者 ( E -m a i l : x i n j i a n @ 3 7 1 . n e t ; T e l : 0 3 7 1 -
6 3 5 5 4 9 6 0 )。
CDPKs是一类依赖钙而不依赖钙调素的蛋白
激酶(calcium-dependent and calmodulin-independent
protein kinases)或类钙调素结构域的蛋白激酶
(calmodulin-like protein kinases), 是目前植物中研究
较多、了解较为清楚的一类蛋白激酶。CDPKs 最
先是在豌豆(Pisum sativum)中检测到的, 在大豆
(Glycine max; Harmon 等 1987)中第一次得到纯化
和鉴定。植物中 CDPKs 广泛分布于茎、叶、花、
果实和种子中; 在分生细胞、木质部细胞、花粉
细胞、保卫细胞和胚细胞中均有发现(Li 等 1998;
Nishiyama等1999); 在细胞中的亚细胞定位涉及到
所有的细胞器(Schenk 和 Snaar-Jagalska 1999)。
CDPKs是目前所知的钙信号的主要效应器——蛋
白激酶中最重要的一类(Stone 和 Walker 1995), 它
与植物中 Ca2+ 信号的进一步传递密切相关。现已
证实CDPKs参与植物激素信号及胁迫信号的转导,
在调节植物生长发育和细胞骨架中也有生理功能作
用。在植物的防御反应、碳氮代谢以及离子通道
的调节中, 也涉及 CDPKs 基因的表达(Cheng 等
2002)。
小麦是禾谷类作物, 其外植体组织培养的再生
能力极差, 严重影响了生物技术在小麦遗传改良中
的应用。目前被公认的最好的基因转化受体是小
麦幼胚, 但获得幼胚受季节、发育状态等的严重制
约。相比之下, 成熟胚则具有发育状态一致、取
材方便、操作简单、不受季节限制等优点而倍受
关注(陈军营等 2006), 但和幼胚相比其分化、再生
植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月126
能力仍然较差。因此研究小麦成熟胚脱分化和再
分化的分子机制对实现小麦成熟胚再生的人工调控
有重要意义。
基于 CDPKs 在植物生理功能中的重要性, 推
测CDPKs很可能在小麦胚脱分化过程中起关键性
作用。迄今, 小麦中蛋白激酶的研究尚处于起步阶
段, 有关CDPKs在小麦不同生理生化过程中的作用
及与其相关的研究仍然是一个空白。本文以小麦
成熟胚为材料, 在2,4-D的作用下诱导其脱分化, 采
用芯片分析技术检测CDPKs基因在小麦成熟胚中
的表达情况, 分析该类型的蛋白激酶在小麦成熟胚
脱分化过程中的表达差异, 以期能揭示CDPKs在成
熟胚脱分化过程中的作用。
材料与方法
小麦(Triticum aestivum L.)品种 ‘ 豫麦 18’, 由
河南农业大学小麦遗传育种组提供。成熟种子用
75%乙醇表面消毒30 s, 再用0.1% HgCl2表面消毒
15~20 min后, 用无菌水冲洗4~5次, 成熟胚在无菌
操作台上用解剖刀切下培养在含有 2 mg·L-l 2,4-D
的MS培养基上, 以 0 h为对照, 小麦成熟胚在培养
基上分别培养 2、6、12、24、7 2 h 后, 立即
用液氮处理并放到-80 ℃冰箱中保存备用。
按 Invitrogen公司的Trizol试剂盒操作程序提
取总 RNA。向小麦成熟胚诱导后的组织中加入
Trizol 试剂后, 于冰浴中匀浆, 离心, 上清液中加入
氯仿和异戊醇抽提总 R N A 。总 R N A 纯化按
QIAGEN公司的RNeasy mini试剂盒操作程序进行,
用琼脂糖凝胶电泳(100 V, 0.5 h)检测总RNA的28S
和 18S 比例, 以评估总 RNA 的完整性; 在波长 260
nm处测定总 RNA 的含量, 利用 260 nm/280 nm吸
光值的比值检测 RNA 的纯度。
用Affymetrix公司的One-Cycle cDNA Synthe-
sis 和 IVT Labeling Kits 分别制备 cDNA 和 cRNA。
合成 cDNA 时, 模板量为 1~8 µg总 RNA。合成生
物素标记的 cRNA时, 取 12 µL上述 cDNA 溶液作
模板。cDNA和cRNA纯化按基因芯片分析样品纯
化操作程序进行。两者的浓度、纯度和质量检测
方法同上。
cRNA片断化和芯片杂交与扫描检测时取15
µL浓度为 1 µg·µL-1 的 cRNA, 加 6 µL 5×片段化缓
冲液(mmol·L-l: Tris 200, KOAc 500, MgOAc 150)、
加入9 µL无RNA酶水混匀后放入94 ℃温浴35 min,
得到长度为35~200 bp的cRNA片断。按Affymetrix
公司提供的配方配制杂交液, 然后将杂交液加至经
预杂交处理的 Affymetrix wheat GeneChip® 中, 于
45 ℃、60 r ·min- 1 杂交 16 h, 吸去杂交液, 用
GeneChip全自动洗涤工作站 450 (Affymetrix公司,
USA)洗涤和染色芯片。用高分辨芯片扫描仪3000
(Affymetrix 公司, USA)扫描芯片, 获得基因表达信
号值 。
数据分析用Affymetrix基因芯片处理软件, 以
不同时点的荧光信号值除以0 h荧光信号值并取以
2为底的对数, 对数值小于-1或大于 1为有意义下
调或上调差异表达, 其他视为表达差异不显著。
随机选取 Os12g0169800 进行实时 PCR 分析,
使用 Premier 5软件设计特异性引物, 上游引物: 5-
GTGTCGCATCGCATTCTT-3 , 下游引物: 5-
CTCATCATAGCCGCAAA-3, 其产物长度: 171 bp。
按照 TaKaRa Two Step Real Time PCR 反应试剂盒
配制反转录体系和扩增体系扩增。PCR 仪的型号
为 Ratio-gene 2000 Real-Time Cycler。扩增条件:
95 ℃预变性10 s, 扩增35个循环, 95 ℃变性5 s, 55
℃延伸 35 s。
实验结果
1 CDPK基因在小麦胚脱分化过程中的表达丰度
目前 NCBI 中登记的在植物中发现的 CDPKs
相关基因有 100 个。利用 Affymetrix wheat gene
microarray检测了小麦成熟胚在 2,4-D 诱导下的脱
分化过程中 CDPK 相关基因差异表达。结果表明,
在含有 61 127 个探针组, 代表了 55 085 个基因的
小麦基因组表达芯片上, 我们共检测到CDPK相关
基因16个, 各个基因在成熟胚愈伤组织脱分化过程
中的表达情况并不一致(表1), 其中呈上调表达的基
因 12 个, 下调表达的基因 2个, 在不同的时间段呈
上调或下调表达的基因1个, 表达差异不显著的基
因 1 个(CDPK, 登录号: CK205841)。成熟胚中它
们的上调范围为对照的 2~7.5 倍, 下调范围为对照
的3~6.1倍, 因此, 初步确认这些基因在脱分化过程
中起作用。
2 不同CDPK类似基因表达水平的差异性分析
已有的研究表明, 小麦成熟胚的脱分化过程分
为 4 个时期, 即 0~2 h 为刺激期(stage of signal
植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月 127
表 1 CDPKs 基因在小麦成熟胚脱分化过程中的表达丰度
Table 1 Expression abundance of CDPKs genes during mature wheat embryo
基因名称 GenBank 登录号 表达丰度 基因描述
CDPK1* CK214731 7.5 ↑ CDPK1 蛋白
BG905296 4.6 ↑ CDPK1 蛋白
BJ286005 2 ↑ CDPK1 蛋白
BG908738 5.7 ↓ CDPK1 蛋白
CK211705 3 ↑ CDPK1 蛋白
BJ274015 7 ↑ CDPK1 蛋白
CK211496 5.7 ↑ CDPK1 蛋白
Os12g0169800 BQ280973 4.3 ↑ 弱相似于 NP_565411.2, CPK6
CPK2B AW448037 2.6 ↑ 中等相似于 NP_565411.2, CPK6
CPK2A BJ235492 2.6 ↑ 中等相似于 NP_565411.2, CPK6
CDPK2* CA654806 2.6 ↑ CDPK2
CA630162 2 ↑, 2.6 ↓ CDPK2
Os05g0585500 BJ255487 2.3 ↑ 中等相似于 NP_196779.1, 推定的 CDPK
Os12g0230200 BJ246895 6.1 ↓ 弱相似于 OSJNBa0060M17.7
CPK6 BJ245418 5.7 ↑ 中等相似于 XP_463964.1, 推定的 CDPK
CDPK CK205841 0.8 CDPK
* 表示该基因有多个 GenBank 登录号; ↑表示最高上调倍数, ↓表示最高下调倍数。
图 1 CDPKs 基因的表达变化趋势
Fig.1 The changing trends of different CDPKs genes expression
transduction, SST)、2~12 h 为响应期(stage of sig-
nal response, SSR)、12~24 h 为细胞重塑期(stage
of cell remodification, SCR), 24~72 h为脱分化后期
(stage of calli formation, SCF) (陈军营等 2009)。
从图1可以看出, CDPKs相关基因主要在刺激
期和响应期起始表达。7 个 C D P K 1 基因中 ,
CK214731在 2~6 h和24 h上调; BG905296在2~72 h
均上调; BJ286005在24 h上调; BG908738在24~72 h
下调; CK211705 在 24 h 上调; BJ274015 在 2 h 和
24~72 h上调; CK211496在 2~72 h均上调(图 1-a)。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月128
4 个 CPK6 基因中, Os12g0169800 (BQ280973)在
2~24 h 上调; CPK2B (AW448037)和 CPK2A
( B J 2 3 5 4 9 2 )均在 2 ~ 1 2 和 7 2 h 上调; C PK 6
(BJ245418)在 6~72 h上调(图 1-b)。2个CDPK2基
因中, CA654806在2 h上调; CA630162在2 h上调,
12 h下调(图 1-c)。1 个 Os05g0585500 (BJ255487)
在 2~6 h上调; 1 个 Os12g0230200 (BJ246895)在 2
h、12 h 和 72 h 下调(图 1-d)。
3 小麦成熟胚脱分化过程中Os12g0169800 (BQ280973)
基因的定量PCR分析
为了验证芯片结果的准确性, 我们随机选取
Os12g0169800 进行定量 PCR 分析。结果如图 2,
其表达趋势与本芯片中表达变化趋势(图 1-b)基本
一致, 说明本芯片的结果是可靠的。
图 2 Os12g0169800 基因的定量 PCR 反应
Fig 2 Real time PCR of Os12g0169800 gene
讨 论
本文结果显示, 4 个类似拟南芥(Arabidopsis
thaliana) CPK6 基因(CPK2A、CPK2B、CPK6 和
Os12g0169800) (图1-b), 在成熟胚脱分化过程中均
呈上调表达, 表达模式虽然有差异, 但整体上较为
一致。在拟南芥中已有的研究表明 CPK6 基因的
表达与气孔的ABA信号转导有关, 但其作用机理并
不清楚(Mori 等 2006)。在水稻幼苗中, CPK6 基因
能在脱水和热休克胁迫的诱导下上调表达, 这与
ABA信号的响应有密切的联系(Wan等 2007)。我
们推测这 4 个基因很可能参与 ABA 信号的转导。
已有研究发现适当浓度的ABA有助于胚性愈伤组
织的形成, 认为ABA在胚性愈伤组织形成中可能作
为一种 “ 信号 ” 在起作用(陈军营等 2006), 由于
CDPKs 信号传递途径与其他信号途径之间存在交
叉转导作用(cross-talk) (Ludwig等 2004), 这 4个基
因在成熟胚脱分化过程中是否参与该“信号”的转
导尚需进一步研究。
另外, 本文所涉及到的其他 6 个 CDPK1 类似
基因( C K 2 1 1 7 0 5、B J 2 86 0 0 5、C K 2 1 4 7 3 1、
CK211496、BG905296和BJ274015)、2个CDPK2
类似基因 ( C A 6 5 4 8 0 6 和 C A 6 3 0 1 6 2 ) 和
Os05g0585500 (BJ255487)基因, 它们的表达趋势整
体上是上调的, 它们很可能参与该上调时间段钙信
号的转导过程, 但也不排除这9个基因参与了脱分
化过程中的其他事件。
小麦成熟胚脱分化过程是及其复杂的, 目前对
此所知甚少, 本研究所锁定的这13个基因在成熟胚
的脱分化过程中有着活跃的表达变化, 并且变化的
趋势和脱分化的过程相吻合, 暗示这些基因产物可
能参与调控了脱分化的进程, 其具体作用有待进一
步研究。
参考文献
陈军营, 文付喜, 何盛莲, 陈新建, 许海霞, 程西永(2006). ABA 和
AgNO3 对小麦幼胚愈伤组织诱导和分化的影响. 麦类作物学
报, 26 (2): 46~48
陈军营, 马平安, 赵一丹, 朱雪萍, 白华举, 陈新建(2009). 小麦成
熟胚脱分化过程中植物激素相关基因的表达研究. 作物学报
(印刷中)
Cheng S, Willmann MR, Chen H, Sheen J (2002). Calcium signal-
ing through protein kinases. The Arabidopsis calcium-depen-
dent protein kinase gene family. Plant Physiol, 129 (2): 469~485
Harmon AC, Putnam-Evans C, Cormier MJ (1987). A calcium-
dependent but calmodulin-independent protein kinase from
soybean. Plant Physiol, 83: 830~837
Li J, Lee YRJ, Assmann SM (1998). Guard cells possess a calcium-
dependent protein kinase that phosphorylates the KAT1
potassium channel. Plant Physiol, 116: 785~795
Ludwig AA, Romeis T, Jones JDG (2004). CDPK-mediated sig-
nalling pathways: specificity and cross-talk. J Exp Bot, 55
(395): 181~188
Mori IC, Murata Y, Yang Y, Munemasa S, Wang Y, Andreoli S,
Tiriac H, Alonso JM, Harper JF, Ecker JR et al (2006).
CDPKs CPK6 and CPK3 function in ABA regulation of guard
cell S-type anion- and Ca2+-permeable channels and stomatal
closure. PLoS Biol, 4 (10): e327
Nishiyama R, Mizuno H, Okada S, Yamaguchi T, Takenaka M,
Fukuzawa H, Ohyama K (1999). Two mRNA species encod-
ing calcium-dependent protein kinases are differentially ex-
pressed in sexual organs of Marchantia polymorpha through
alternative splicing. Plant Cell Physiol, 40 (2): 205~212
Schenk PW, Snaar-Jagalska BE (1999). Signal perception and
transduction: the role of protein kinases. Biochim Biophys
Acta, 1449 (1): 1~24
Stone JM, Walker JC (1995). Plant protein kinase families and
signal transduction. Plant Physiol, 108 (2): 451~457
Wan B, Lin Y, Mou T (2007). Expression of rice Ca2+-dependent
protein kinases (CDPKs) genes under different environmen-
tal stresses. FEBS Lett, 581 (6): 1179~1189