全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 4 期，2009 年 4 月 385
收稿 2008-12-24 修定 　2009-02-18
资助 黑龙江省攻关重点项目(GB06B303)和国家科技支撑项
目(200 6BAD01A1 603、2006BAD 24B05)。
* 通讯作者(E-mail: chli0@163.com; Tel: 0451-82190607)。
白桦成熟合子胚快速不定芽诱导体系的建立
张瑞萍, 刘桂丰, 姜静, 杨传平, 李成浩 *
东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 以白桦成熟合子胚为外植体, 建立了白桦合子胚快速不定芽诱导体系: 合子胚经消毒纵切后, 在培养基WPM+2.0 mg·L-1
6-BA+0.2 mg·L-1 NAA中, 可直接诱导形成不定芽, 诱导率最高为93.3%, 不定芽诱导数为8.7个; WPM+4.0 mg·L-1 TDZ上也
有较好的诱导效果, 不定芽诱导率为90.2%, 不定芽诱导数为7.6个, 这表明WPM+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA是白桦成
熟合子胚不定芽诱导的较优培养基。NAA能有效促进嫩茎生根, 其最佳浓度为0.2 mg·L-1。
关键词: 白桦; 合子胚; 不定芽诱导
Establishment of Rapid Adventitious Bud Induction from Mature Zygotic Em-
bryos of Birch (Betula platyphylla Suk.)
ZHANG Rui-Ping, LIU Gui-Feng, JIANG Jing, YANG Chuan-Ping, LI Cheng-Hao*
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology of Ministry of Education, Northeast Forestry University,
Harbin 150040, China
Abstract: Rapid adventitious bud induction of Betula platyphylla was establinshed from mature zygotic embryos.
After disinfect, the zygotic embryos were cut vertically, and induced adventitious buds directly. In the media of
WPM+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA, the rate of adventitious buds induction was 93.3%, and number of
adventitious buds was 8.7. In the media of WPM+4.0 mg·L-1 TDZ, the rate was 90.2%, and the number was 7.6.
These results indicated that WPM+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA was better for induction of adventitious
buds. And NAA could promote the rooting of adventitious shoots, the optimum concentration was 0.2 mg·L-1.
Key words: Betula platyphylla; zygotic embryos; adventitious bud induction
白桦是东北地区具有应用价值和发展潜力的
树种之一。在白桦种源区划和亲缘关系(朱翔等
2001; 姜静等 2001)、强化育种(杨传平等 2004)、
杂交育种(李开隆等2006)等方面都做了大量的研究
工作。但由于白桦育种周期长, 改良进程缓慢, 改
良效率低, 传统的白桦育种技术已经满足不了当前
生产的需要。因此, 积极开展白桦基因工程育种研
究已引起人们的关注, 但实现基因工程育种的前提
是要建立高效组培再生体系。到目前为止, 人们对
茎轴、茎段(带腋芽)、无菌苗、下胚轴及成年树
一年生剥皮茎段等外植体进行了白桦不定芽诱导的
研究(陶静等 1998; 祖元刚等 2001; 詹亚光等 1998,
2002; 詹亚光和杨传平 2002)。并且以叶片、叶
柄和茎段为受体, 采用根癌农杆菌介导法, 向白桦
转入Bt抗虫基因(詹亚光等2003, 2006)和甜菜几丁
质酶基因(Hanna-Leena 等 2005)。但是, 以叶片、
叶柄、茎段等外殖体建立的白桦再生体系一般都
要采用经由愈伤组织培养诱导不定芽形成的方法,
不定芽诱导周期长、诱导率较低, 使得白桦基因工
程育种的进程缓慢。而由成熟合子胚直接形成器
官的途径能够克服这一不足, 可快速诱导不定芽的
形成, 进而获得再生植株(Ellis 等 1991; Mehta 等
2000), 为此, 本文选用白桦成熟合子胚为外植体,
对其不定芽诱导和植株再生进行了研究, 并建立了
白桦组培的再生体系, 现报道如下。
材料与方法
白桦(Betula platyphylla Suk.)成熟种子采自本
校白桦强化育种棚，种子保存于 -20℃冰箱内。
作6-BA与NAA影响白桦合子胚不定芽诱导的
试验时，将种子用自来水冲洗 5~7 d，种子充分
吸水变得饱满，即将露出芽点时，置于超净工作
台上，用 70% 乙醇浸泡 30 s，再用 30% H2O2 进
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行表面消毒处理 15 min，最后用灭菌蒸馏水冲洗
4~5 次。接着纵切合子胚(图 1-a、b、c)，分别
接种于附加不同浓度的6-BA和NAA组成不定芽诱
导培养基中，其中 6-BA 的浓度分别为 0、1.0、
2.0、3.0、5.0 mg·L-1，NAA 的浓度分别为 0、
0.1、0.2、0.3 mg·L-1，每个生长调节素处理设
重复 3 次，上述培养基均用 1 mol·L-1 NaCl 或调至
pH 为 5.8，经高压灭菌 20 min。接种后，培养
室内温度为(24±1)℃，光照 16 h·d-1、光照度为
40~50 μmol·m-2·s-1。培养期间观察不定芽诱导形
成时间，并于培养 4 周后，统计不定芽诱导率和
不定芽数。
作TDZ与NAA影响白桦合子胚不定芽诱导的
试验时, 以 WPM 为基本培养基, 附加不同浓度的
TDZ和NAA组成不定芽诱导培养基, 其中TDZ的
浓度分别为 0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1, NAA
的浓度分别为 0、0.1、0.2 mg·L-1, 纵切合子胚,
每皿约100粒种子, 每个生长调节素处理3次重复,
培养条件同上节, 4 周后, 统计不定芽诱导情况。
白桦不定芽伸长培养参见詹亚光等(1998)文中
的方法, 在培养基 WPM+1.0 mg·L-1 6-BA继代培养
2 次, 期间观察不定芽伸长情况, 当不定芽长到超
过 3 cm 时, 进行生根培养。
作生根培养试验时, 将生长旺盛的芽茎保留3
cm 转入生根培养基中诱导生根, 基本培养基为
WPM, NAA 浓度为 0.1、0.2、0.3 mg·L-1, 每个处
理至少 30 个外植体, 重复 3 次, 于 25 ℃下培养 4
周后检测生根情况。
图 1 白桦成熟合子胚快速不定芽诱导和植株再生
Fig.1 Rapid adventitious bud induction from mature zygotic embryos and plant regeneration of B. platyphylla
a: 白桦成熟种子; b: 纵切成熟合子胚; c: 合子胚接种至培养基; d: 培养 9 d 后诱导的不定芽; e: 培养 9 d 后诱导的不定芽(图 1-d 的
放大图像); f: 不定芽伸长培养; g: 不定芽生根培养。
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结果与讨论
1 6-BA与NAA组合对白桦合子胚不定芽诱导的
影响
成熟白桦种子经消毒处理后, 纵切带皮种子, 取
出合子胚, 分别接种于附加不同浓度 6-BA与NAA
组合的 WPM 培养基中。培养 4 d 左右时, 下胚轴
开始膨大; 9 d 后开始陆续出现不定芽。形成不定
芽的同时, 膨大的下胚轴也开始形成愈伤组织, 但
是未观察到从愈伤组织中诱导的不定芽, 因此, 认
为不定芽是由合子胚直接诱导形成的。其中, 在培
养基 WPM+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA 中最
早诱导形成不定芽; 2周后, 培养基WPM+2.0 mg·L-1
6-BA+0.1 mg·L-1 NAA 也可见不定芽形成(图 1-d、
e)。培养 4 周后统计的结果(表 1)表明, 只有 6-BA
时, 在培养 4 周后仅见有愈伤组织形成, 不定芽分
化率为 0; 而与 NAA 配合时, 可以直接诱导不定芽
形成。培养基 WPM+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1
NAA的不定芽再分化率最高可达93.3%, 不定芽诱
导数达 8.7 个。在该培养条件下继代培养 2 次, 不
定芽的增殖效果良好, 不定芽增殖数量达40~60个。
表 1 6-BA与 NAA对白桦合子胚不定芽诱导的影响
Table 1 Effects of 6-BA and NAA on adventitious bud
induction from zygotic embryos of B. platyphylla
6-BA 浓度 / NAA 浓度 / 不定芽数 / 平均不定芽诱
mg·L-1 mg·L-1 个 导率 /%
0 0 0 0j
1.0 0 0 0j
1.0 0.1 1.2 41.3i
1.0 0.2 1.7 47.6h
1.0 0.3 2.0 53.7g
2.0 0 0 0j
2.0 0.1 5.1 78.8b
2.0 0.2 8.7 93.3a
2.0 0.3 6.0 72.9d
3.0 0 0 0j
3.0 0.1 4.5 63.5e
3.0 0.2 4.8 76.5c
3.0 0.3 3.5 57.5f
　　Duncan 方法多重比较, 不同字母表示在 0.05 水平上差异显著。
下表同此。
NAA组合的WPM培养基中。培养第 8天, 在只添
加 TDZ 的培养基上即可见有不定芽形成, 这表明
TDZ 能够促进白桦合子胚不定芽快速形成。培养
4 周后, 不论是单独添加 TDZ, 还是同时添加 TDZ
和NAA均有不定芽产生(表2), 其中, 单独添加TDZ
的不定芽诱导效果较好, 添加 4.0 mg·L-1 TDZ 的白
桦合子胚不定芽的诱导率最高, 为 90.2%; 当 TDZ
和NAA配合使用时外殖体愈伤化严重, 不定芽的诱
导率很低(<40%)。由此, 我们筛选出 WPM+4.0
mg·L-1 TDZ 为白桦合子胚不定芽诱导的较优培养
基, 其不定芽数为 7.6 个(表 2)。
2 TDZ与NAA组合对白桦合子胚不定芽诱导的影
响
纵切合子胚, 分别接种于附加不同浓度TDZ与
表 2 TDZ 与 NAA对白桦合子胚不定芽诱导的影响
Table 2 Effect of concentration of TDZ and NAA
on adventitious bud induction from zygotic
embryos of B. platyphylla
TDZ 浓度 / NAA 浓度 / 不定芽数 / 平均不定芽诱
mg·L-1 mg·L-1 个 导率 /%
1.0 0 1.6 10.7k
1.0 0.1 2.0 79.4c
1.0 0.2 5.6 82.9d
2.0 0 5.2 75.9d
2.0 0.1 4.0 30.8f
2.0 0.2 4.0 35.2e
3.0 0 6.4 83.5b
3.0 0.1 4.0 30.5f
3.0 0.2 2.6 23.3g
4.0 0 7.6 90.2a
4.0 0.1 2.2 8.3i
4.0 0.2 1.0 5.5j
　　
另据周春娜等(2006)报道, 白桦茎段最容易诱
导不定芽分化; 根较难诱导不定芽分化, 且分化所
需时间长; 叶片和叶柄诱导不定芽再生的时间较
短。但叶盘的不定芽诱导率最高仅为 64%, 平均
不定芽数为 6 个(石福臣等 2001), 明显低于成熟白
桦合子胚的不定芽诱导率, 这说明白桦成熟合子胚
不定芽诱导的高效性。6-BA和TDZ均能促进白桦
合子胚不定芽快速形成, 但值得注意的是, 只有同
时添加6-BA和NAA的白桦不定芽的诱导效果较好
(表 1); 而单独添加 TDZ就能高效诱导不定芽形成
(表 2), 因此认为, 在进行不定芽快速诱导时, 确定
适合的生长调节物质及其配比是进行定向诱导的基
础。
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表 3 不同浓度 NAA对白桦嫩茎生根的影响
Table 3 Effect of NAA concentration on rooting of adventi-
tious shoots of B. platyphylla
NAA 浓度 /mg·L-1 生根数 / 条 生根率 /% 主根长度 /cm
0 5.0c 100 2.7±0.04
0.1 10.7b 100 3.7±0.03
0.2 16.0a 100 4.2±0.06
0.3 7.7c 100 3.1±0.45
　　
3 不定芽的伸长与生根
在不定芽诱导 4周后, 切取带有 3~5个芽的小
块, 转接入培养基 WPM+1.0 mg·L-1 6-BA 培养, 不
定芽明显伸长(图 1-f)。当其长度超过 3 cm时, 切
取 3 cm 嫩茎进行生根培养。
将生长状态良好的嫩茎接入含不同浓度NAA
的生根培养基中培养4周后, 统计生根结果(表3)生
长调节物质表明, 嫩茎生根率均为100%。其中, 在
有 NAA 作用下 5 d 时就有根生出。然而, 在培养
基 WPM+0.1 mg·L-1 NAA 中, 根生长缓慢; WPM+
0.2 mg·L-1 NAA 中生根效果最好, 主根和须根数量
均较多, 且生长较快; 而培养基 WPM+0.3 mg·L-1
NAA 生根效果也较好, 其主根粗壮, 但数量少, 且
须根数量也较少; 在不加NAA的培养基中, 嫩茎则
在培养 12 d 后才产生不定根, 生根延迟, 数量少,
且细弱。 这很可能会影响移栽后的成活率(詹亚光
等 1998)。这表明 NAA 能有效促进不定根生成,
WPM+0.2 mg·L-1 NAA是白桦嫩茎生根培养的最佳
培养基。
综上所述, 以白桦成熟合子胚为外殖体能够快
速诱导不定芽形成(诱导时间为 8~9 d)。而以叶片
或茎段为外殖体诱导不定芽则需要 2~3 个月(詹亚
光等 1998)。并且, 白桦成熟合子胚作为外植体有
很多优点, 即不论是在通风条件、常温密封条件,
还是在冷冻密封条件下均可以长时间保存, 这样不
定芽的诱导可不受季节的限制, 随时取用。
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