全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (1): 75~80 75
收稿 2011-11-04　　修定 2011-12-02
资助 国家自然科学基金(30300195和31071410)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: mengfanrong73@yahoo.com.cn; Tel:
0371-63555790)。
小麦甲基转移酶基因TaDnMT2的克隆及特性分析
凌娜1,*, 刘浩1,*, 贾海英1, 闫延涛2, 尹钧2, 李永春2, 孟凡荣1,**
河南农业大学1生命科学学院, 2国家小麦工程技术研究中心, 郑州450002
摘要: 依赖于DNA甲基化的基因表达调控在植物生长发育过程中发挥重要功能, 而DNA甲基转移酶是调节DNA甲基化
模式的功能蛋白之一。本研究采用RACE技术克隆了小麦甲基转移酶基因TaDnMT2的包含完整编码区的cDNA序列, 并
系统分析了该基因的结构特征及其在小麦生长发育过程中的表达特性。结果表明, TaDnMT2的cDNA序列为1 321 bp
(GenBank登录号: JN642641), 其中5′-和3′-UTR (非翻译区)分别为84和115 bp、ORF (开放阅读框) 1 122 bp; TaDnMT2编
码的氨基酸序列包含2个S-腺苷甲硫氨酸结合域(I和X)、甲基转移酶活性位点(IV)、靶胞嘧啶结合位点(VI)、中和DNA
骨架负电荷域(VIII)和靶位点识别区(IX) 6个高度保守域, 属于DNA甲基转移酶家族的DnMT2亚类; 三维结构预测显示,
TaDnMT2蛋白可以形成包括7个β-折叠和4个α-螺旋的特定空间结构。表达特性分析的结果表明, TaDnMT2基因在‘京
841’小麦不同发育时期的叶中表达量均较高, 且其在三叶龄期和五叶龄期的表达量受春化处理的影响; 在种子发育过程
中, 该基因在授粉后5 d的种子中表达量较高, 随着种子发育进程的推进其表达水平呈逐渐下降趋势; 在不同发育时期的
根系中, TaDnMT2基因均具有较高水平的表达, 且在分蘖期根系中的表达量最高。推断TaDnMT2基因可能在小麦生长发
育过程中发挥重要功能。
关键词: 甲基转移酶; 基因克隆; 序列特征; 表达
Cloning and Characterization of Methyltransferase Gene TaDnMT2 in Wheat
(Triticum aestivum L.)
LING Na1,*, LIU Hao1,*, JIA Hai-Ying1, YAN Yan-Tao2, YIN Jun2, LI Yong-Chun2, MENG Fan-Rong1,**
1College of Life Sciences, 2National Engineering Research Centre for Wheat, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: DNA methylation-dependent regulation of gene expression plays important roles during the
growth and development of plant, and DNA methyltransferase is one of the key regulators which manipu-
late the patterns of DNA methylation. In this study, the cDNA (including complete coding region) of a
wheat (Triticum aestivum) DNA methyltransferase gene TaDnMT2 was cloned by using the RACE technol-
ogy, and the structural characteristics of the gene, as well as its expression patterns during the growth and
development of wheat were analyzed. The cDNA length of TaDnMT2 was 1 321 bp (GenBank accession
No. JN642641), which including 84 bp of 5′-UTR (untranslated region), 115 bp of 3′-UTR and 1 122 bp of
ORF (open reading frame). The further analysis indicates that the deduced protein TaDnMT2 contains 6
highly conserved motifs, which including 2 AdoMet binding motifs (I and X), methyltransferase active site
(IV), target cytosine binding motif (VI), DNA neutralization motif (VIII) and the target recognition domain
(IX). Phylogenetic analysis indicates that TaDnMT2 is sorted to the DnMT2 sub-class of the plant DNA
methyltransferase family. The 3D structure prediction showed that TaDnMT2 could fold to a specific spa-
tial structure including 7 β-sheets and 4 α-helixes. The expression analysis of TaDnMT2 indicated that the
gene was highly expressed in leaves at different developing stages in wheat variety ‘Jing841’ and it’s ex-
pression levels were changed at three- and five-leaf stages due to the vernalization treatment. In developing
seeds, the TaDnMT2 was highly expressed at the time point of 5 d after pollination and it’s expression lev-
el was gradually decreased during the seed development. In roots, the expression of TaDnMT2 was gener-
ally higher and the highest expression was detected at tillering stage. It is deduced that the TaDnMT2 may
play important roles during the wheat growth and development.
Key words: methyltransferase; gene cloning; sequential characterization; expression
DNA甲基化是植物基因组广泛存在的一种表
观遗传修饰, 在植物的生长发育调控过程中发挥
重要的生物学功能(Zhang等2010; Saze等2008;
Bird 2002)。DNA甲基转移酶(methyltransferase)是
调控DNA甲基化模式的主要因子, 植物中DNA甲
植物生理学报76
基转移酶主要包括MET1 (methyltransferase 1)、
CMT (chromomethyltransferase)、DRM (domain-
rearranged methyltransferase)和Dnmt2 (DNA meth-
yltransferase homologue 2) 4类(Pavlopoulou和Ko-
ssida 2007), 其中MET1属于维持性DNA甲基转移
酶(Cao等2003)。研究发现, 拟南芥的MET1抑制表
达后, 转基因植株表现出顶端优势丧失、矮化、
叶片变形、开花时间改变及育性下降等发育不正
常现象(Kankel等2003; Finnegan等1998), 表明
MET1在维持拟南芥正常的生长发育过程中发挥
重要的作用; CMT和DRM家族只在植物中发现,
CMT家族具有维持CpNpG位点甲基化的作用 ;
DRM的作用是在RNA指导下, 催化胞嘧啶从头甲
基化, 并且维持非CpG位点的胞嘧啶甲基化修饰
(Wada等2003; Cao和Jacobsen 2002); 关于植物
Dnmt2家族DNA甲基转移酶的研究还较少, 初步研
究发现植物Dnmt2与小鼠、细菌及酵母的高度同
源, 都缺失N-末端活性结构域(Chen和Li 2004)。目
前 , 关于小麦甲基转移酶的相关研究仍非常有
限。本研究在前期获得小麦甲基转移酶基因TaD-
nMT2部分序列的基础上, 拟系统分析该基因及其
编码蛋白的特征, 并探讨其在小麦发育过程中的
表达特性, 为进一步分析该基因在小麦生长发育
过程中的生物学功能奠定基础。
材料与方法
小麦(Triticum aestivum L.)品种‘京841’于温室
(13~26 ℃)种植, 分别剪取一叶期、三叶期、五叶
期、七叶期和九叶期(主茎叶龄)小麦的叶片, 迅速
用液氮冷冻后于-80 ℃保存, 用于RNA的提取。在
花期挂牌, 分别取授粉后5、10、15、25 d种子用
于基因表达分析。用于根系取材的小麦植株种植
在花盆中, 分别选择生长发育一致的三叶期、分
蘖期、拔节期、抽穗期植株, 用水冲洗出根系, 液
氮速冻后于-80 ℃保存备用。春化处理时, 小麦种
子用70%酒精消毒30 s, 0.1%氯化汞消毒7 min, 无
菌水冲洗4次, 然后于25 ℃萌动12 h, 再于0~2 ℃春
化处理30 d, 于温室播种。
利用Trizol试剂盒提取植物叶中的总RNA, 提
取方法按照试剂盒说明书进行。依据我们前期获
得的小麦甲基转移酶TaDnMT2的部分序列, 设计
嵌套引物, 采用TaKaRa公司的5和3 RACE试剂盒
进行cDNA序列的克隆, 具体操作步骤根据试剂盒
说明书进行。试验中基因特异引物GP1 (5′-GG-
AATCTTCAGCCATCATCTC-3′)和GP3 (5′-TTC-
CCCACCGTTCAATCAAG-3′)分别与3′和5′ RACE
试剂盒提供的Outer Primer组合进行扩增, 而GP2
(5′-TGAGTGAGTTGGGTCTACGGTT-3′)和GP4
(5′-CGTTTCTGAAGTCCTTGCCGTGT-3′)则与对
应的Inner Primer组合。扩增片段经DNA凝胶回收
试剂盒回收, 连接到pGEM-T Easy载体上, 转化后
选择阳性克隆, 经鉴定后进行测序分析; cDNA序
列的初步分析、氨基酸翻译及比对分析运用
DNAMAN软件, 蛋白质序列以及结构分析通过
ExPaSy (http://www.expasy.org)进行(Bordoli等2009;
Arnold等2006)。二级结构的预测采用PredictPro-
tein (http://www.predictprotein.org/)分析(Rost等
2004)。根据已获得TaDnMT2基因的cDNA序列,
设计特异引物用于实时定量PCR分析, 引物序列
分别为: 5′-GAGTTCTACAGCGGTATCGG-3′和
5′-CTCGTAGTGTTCAATGTTAGGC-3′。内标基
因为Ubiquitin (GenBank登录号: AY297059), 引物
序列分别为: 5′-ATCCAGGACAAGGAGGGCA-3′
和5′-CGGAGACGGAGCACCAAG-3′。3次重复,
PCR反应体系及程序按照Li等(2008)的方法进
行。
实验结果
1 小麦TaDnMT2全长cDNA的克隆及其序列特征
分析
将RACE克隆到的3′端和5′端序列与该基因已
克隆部分序列(拼接后序列的第335~1 050 bp)进行
整合, 最终获得了小麦甲基转移酶基因TaDnMT2
的cDNA全长。序列分析显示, TaDnMT2的包含完
整编码区的cDNA序列为1 321 bp (GenBank登录
号: JN642641), 其中, 5′-UTR (非翻译区) 84 bp, 3′-
UTR 115 bp, ORF (开放阅读框) 1 122 bp。TaDn-
MT2基因可编码的373个氨基酸中, Leu、Ser和Pro
的含量较高, 分别占总氨基酸的10.2%、9.4%和
7.0%。TaDnMT2蛋白的分子式为C1876H2895N495O559S20,
分子量为42 kDa, 理论等电点为5.62, 负电荷氨基
酸(Asp+Glu)总数为39, 正电荷氨基酸(Arg+Lys)总
凌娜等: 小麦甲基转移酶基因TaDnMT2的克隆及特性分析 77
数为33; 不稳定参数为41.16, 属于稳定蛋白。
2 TaDnMT2蛋白的高级结构分析
TaDnMT2蛋白的结构域分析显示, 该蛋白包
括6个保守域(图1-A和B), 即2个S-腺苷甲硫氨酸结
合域(I和X)、甲基转移酶活性位点(IV)、靶胞嘧啶
的结合位点(VI)、中和DNA骨架负电荷(VIII)和靶
位点识别区域(IX)。另外, TaDnMT2还包含多个翻
译后修饰位点, 包括8个O型β-乙酰葡萄糖胺糖基
化位点(第22、85、93、161、255、292、333、
373位氨基酸)、11个蛋白激酶C磷酸化位点(第
25、100、141、196、275、282、284、294、298、
301、337位氨基酸)、3个酪蛋白激酶II磷酸化位
点(第129、236、314位氨基酸)和4个蛋白激酶A磷
酸化位点(第22、190、292、314位氨基酸)。
小麦TaDnMT2的二级结构分析显示, 该蛋白
可形成由α-螺旋(H)、β-折叠(E)和无规卷曲组成
的特定结构, 这3种结构分别占整个氨基酸序列的
18.50%、10.19%和71.31% (图1-A)。蛋白三级结
构预测结果显示, TaDnMT2可以形成由多个α-螺
旋和β-折叠组成的特定空间结构, 而且在β-折叠
群的两侧分别可形成由2个α-螺旋组成的对称性
结构(图1-C)。
图1 TaDnMT2的结构特征分析
Fig.1 Analysis of the structural characteristics of TaDnMT2
A: TaDnMT2的6个保守域(I、IV、VI、VIII、IX和X)及二级结构预测。H: α-螺旋; E: β-折叠; 空白处为无规则卷曲。B: 植物DNA
甲基转移酶的DnMT2亚族成员AtDnmt2L、OsDnmt2L、TaDnMT2和ZMET4在6个最保守域的序列logo分析。不同颜色表示氨基酸的
特性: 黑色的为疏水氨基酸; 彩色为亲水氨基酸, 其中红色为酸性氨基酸, 蓝色为碱性氨基酸, 绿色为中性氨基酸。氨基酸代码的大小
比例代表其在该亚族中出现的比率。C: TaDnMT2的三级结构预测。
植物生理学报78
3 小麦TaDnMT2与其他植物甲基转移酶的比较
用ClustalW软件将小麦的TaDnMT2与来源于
水稻、玉米和拟南芥的植物DNA甲基转移酶进行
氨基酸序列比对和聚类分析的结果显示, TaDn-
MT2与ZMET4 (玉米)、OsDnmt2L (水稻)和AtDn-
mt2L (拟南芥)的亲源关系最近, 同属于甲基转移
酶的Dnmt2亚类(图2)。氨基酸序列比对分析表明,
TaDnMT2蛋白与Dnmt2亚类其他成员ZMET4、
OsDnmt2L和AtDnmt2L的序列一致性较低, 分别为
66%、65%和52%。不过, 进一步分析发现, TaDn-
图2 TaDnMT2与其他植物甲基转移酶的聚类分析
Fig.2 Phylogenetic analysis of TaDnMT2 and other plant methyltransferases
甲基转移酶的GenBank登录号分别为AtMETI (AAA32829)、AtMETIIa (NP_193150)、AtMETIIb (NP_192638)、AtMETIII
(NP_193097)、AtCMT1 (AAC02660)、AtCMT2 (AAK69757)、AtCMT3 (AAK71870)、AtDRM1 (NP_197042)、AtDRM2 (AAF66129)、
AtDRML (AAN12982)、AtDnmt2L (NP_568474)、OsMET1-1 (AAP44671)、OsMET1-2 (DAA01513)、OsCMTL (XP_476210)、Os-
MET2a (NP_912505)、OsZmet3 (AAN61474)、OsDnmt2L (NP_917641)、OsDMT106 (AAT85176)、ZmMET1 (AAG15406)、ZmMET2
(AAK11516)、Zmet3 (AAF68437)、ZMET4 (AAK40306)、ZmMET5 (AAM28227)和ZmDMT106 (AAM93211)。
凌娜等: 小麦甲基转移酶基因TaDnMT2的克隆及特性分析 79
MT2与DNA甲基转移酶Dnmt2亚类的其他成员间
在6个保守域的序列一致性仍然很高(图1-B)。
4 小麦发育过程中TaDnMT2的表达特性
采用实时定量RT-PCR分析TaDnMT2基因在
叶中的表达特性, 结果显示, 在春化处理30 d的条
件下, TaDnMT2基因的表达量在七叶期前均较高,
九叶期后其表达量迅速下降; 而在未春化处理条
件下, 该基因在三叶期和五叶期的表达量显著下
降(图3-A)。可见, TaDnMT2基因在冬小麦‘京841’
的发育过程中存在表达差异, 且其表达水平受春
化处理的影响。对TaDnMT2基因在种子发育过程
中的表达特性分析显示, 授粉后5 d的种子中该基
因的表达量较高, 随着种子发育进程的推进其表
达水平呈逐渐下降趋势, 在种子发育后期(特别是
在成熟的干种子中)该基因的表达量显著下降(图
3-B)。在不同发育时期小麦的根中, TaDnMT2基因
的表达水平总体较高, 特别是在分蘖期的根中该
基因的表达量显著高于其他时期(图3-C)。总体来
看, TaDnMT2基因在不同发育时期的叶、种子和
根系中均有较高水平的表达, 且其表达动态与发
育进程有一定的关系。由此推断, TaDnMT2可能
在小麦生长发育过程中发挥着某种调控作用。
讨　　论
DNA甲基转移酶是调控真核基因组DNA甲
基化模式的重要功能蛋白, 在基因表达调控方面
发挥重要功能。本研究中克隆了小麦甲基转移酶
基因TaDnMT2的包含完整编码区的cDNA序列, 分
析发现该基因编码的蛋白具有甲基转移酶特有的
6个保守域, 其中, 保守域I和X是参与S-腺苷甲硫氨
酸的结合重要位点, 保守域IV是C5甲基转移酶的
活性位点, 保守域IX在识别靶标胞嘧啶过程中发
挥重要功能(图1-A); 进一步分析显示, 小麦甲基转
移酶TaDnMT的6个保守域与植物DNA甲基转移酶
DnMT2亚类其他成员的序列具有很高的一致性
(图1-B)。由此推测, 本研究中克隆的小麦TaDnMT
可编码具有DNA甲基转移酶活性的功能蛋白, 有
关该基因的原核表达及其活性鉴定方面的工作将
是进一步深入研究的重要内容。
营养生长向生殖生长的转变过程是植物生
长发育的重要环节, 而植物的春化是调控这一过
程的重要因素之一。研究发现, 春化作用促进开
花与低温诱导的基因组甲基化水平降低密切相关,
DNA甲基化和脱甲基化作用可能参与了春化相
关基因的启动或关闭(Sherman和Talbert 2002;
Burn等1993)。本研究中发现, 三叶期和五叶期‘京
841’小麦叶中, TaDnMT2的表达量与是否经过春化
处理密切相关, 未春化处理的叶中该基因的表达
量显著降低, 而这一时期正好是小麦由营养生长
向生殖生长转变的关键时期。结合已有的研究结
果可得出以下推测: 在春化处理条件下, 低温积累
诱导了基因组DNA的甲基化水平降低, 从而促进
营养生长向生殖生长的转化, 不过, 在这一过程中
TaDnMT2的表达并没有下降, 可能这一时期的甲
基化水平的降低受其他蛋白(如DNA脱甲基酶等)
调控; 而在未经春化处理条件下, TaDnMT2在由营
图3 TaDnMT2在小麦生长发育过程中的表达特性
Fig.3 The expression patterns of TaDnMT2 during the growth and development in wheat
A: 小麦叶中TaDnMT2基因的表达。L1~L9分别指主茎叶龄为1、3、5、7和9。B: 小麦种子发育过程中TaDnMT2基因的表达。
S1~S5分别为授粉后5、10、15、25 d和成熟的干种子。C: 不同时期根中TaDnMT2基因的表达。R1~R5分别为萌动48 h、三叶期、分
蘖期、拔节期和抽穗期的根系。
植物生理学报80
养生长向生殖生长转变过程中的表达水平降低,
这似乎与该时期基因组DNA低甲基化水平的需求
相吻合。当然, 小麦发育过程中DNA甲基化模式
的变化及其调控蛋白的表达动态仍不清楚, 关于
TaDnMT2在小麦发育过程中的生物学功能有待
于进一步深入研究。
种子发育是决定小麦产量和品质的关键时期,
关于种子发育过程的基因表达调控研究具有重要
意义。研究发现, 植物种子的胚乳中普遍存在基
因组印记现象, 而这与依赖于DNA甲基化的基因
表达调控密切相关(Kinoshita 2007; Adams等
2000)。例如, 拟南芥的MEA和FWA是胚乳发育的
关键因子, 这2个基因在胚乳中均存在受DNA甲基
化调控的基因组印记现象。Day等(2008)的研究也
发现, 一些与DNA甲基化调控相关的基因(如AtD-
MT5、AtDMT6、AtMBD11和AtMBD13等)在拟南
芥胚乳发育的早期就有较高水平的表达(张问等
2009)。本研究中也发现, TaDnMT2基因在授粉后5
d的种子中表达量较高, 随着种子的不断发育其表
达水平逐渐下降, 在成熟种子中的表达量很低。
由此推断, TaDnMT2的表达可能与小麦种子的发
育调控有关。
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