全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 10 期，2009 年 10 月 995
收稿 2009-08-25 修定 　2009-09-29
资助 福建省自然科学基金项目(20 08 J0 4 01 1)、福建省高校
服务海西建设重点项目(A1 0 1 )、福建省教育厅科技计
划(2007JA07151)、泉州市科技局技术研究与开发项目
(20 07 N 6)、泉州师范学院重点学科建设经费、泉州师
范学院大学生基金(2008DA008 和 2008DA009)。
* 通讯作者(E-ma i l : dwf3 2 0 @1 6 3 .co m; T e l : 0 5 9 5 -
2 2 9 1 9 5 6 3 )。
甘草肌动蛋白基因GuActin2的克隆和表达分析
王芳 *
泉州师范学院化学与生命科学学院, 福建泉州 362000
提要: 以乌拉尔甘草根为材料, 从中提取总 RNA, 根据植物肌动蛋白的 5和 3末端设计简并引物。采用 RT-PCR技术和
5 RACE试剂盒, 从乌拉尔甘草根中克隆到一个肌动蛋白基因编码区全长cDNA序列(GenBank登录号GQ 404511), 长度为
1 137 bp。该基因编码一个由 377个氨基酸残基组成的蛋白质。甘草 GuActin2具有肌动蛋白(YVGDEAQs.KRG和
WISKgEYDE)和肌动蛋白类似物(LLTEApLNPkaNR)的特征信号序列。Northern blot分析表明, GuActin2在甘草的根、茎、
叶组织中都有表达, 在根中, 尤其在胚根中的表达强于茎和叶中的表达。该基因属于营养型亚类。
关键词: 肌动蛋白; 基因表达; 基因克隆; 乌拉尔甘草
Molecular Cloning and Expression Analysis of An Actin Gene GuActin2 from
Chinese Licorice (Glycyrrhiza uralensis Fisch.)
WANG Fang*
School of Chemistry and Life Science, Quanzhou Normal College, Quanzhou, Fujian 362000, China
Abstract: A PCR-based homologous cloning strategy was used to identify actin genes from the roots of Chinese
licorice (Glycyrrhiza uralensis). Sequence analysis indicated that a 1 137 bp cDNA with an open reading frame
encoding a 377 amino acids actin ortholog, GuActin2, was successfully cloned and characterized (GenBank
accession No. GQ 404511). The GuActin contained the actin family signature sequence (YVGDEAQs.KRG and
WISKgEYDE) and actin-related proteins signature sequence (LLTEApLNPkaNR). Analysis by Northern blot
showed that GuActin2 was abundantly expressed in roots, particularly in radicles than in stems or leaves. These
results suggested that GuActin2 might be a member of the vegetative subfamily in the actin family.
Key words: actin; gene expression; gene cloning; Chinese licorice (Glycyrrhiza uralensis)
肌动蛋白(actin)是真核生物中普遍存在的一种
古老的蛋白质, 由 375~377 个氨基酸残基组成, 分
子量为 42 kDa 左右, 是构成细胞骨架的主要成分。
肌动蛋白在植物的生长和发育及许多生理活动中起
作用, 如胞质环流、细胞器运动和定位、细胞极
性建成、细胞形状的确定、细胞分裂、细胞伸
长、细胞壁的沉积、顶端生长以及细胞对诸如病
原侵蚀等外界刺激的应答和雌蕊花粉的不育等
(Kost 等 1999; Nick 1999; Meagher 等 2000; Staiger
2000; Wasteneys 2000)。
根据核苷酸和氨基酸序列, 高等植物肌动蛋白
基因是由一个祖先进化而来。陆生植物肌动蛋白
基因在进化早期形成两个古老的亚类: 营养型和生
殖型, 形成多基因家族, 从而产生了多种肌动蛋白
异型体(Hightower 等 1986; Meagher 和 Williamson
1994; McDowell 等 1996; Kandasamy等 1999)。植
物肌动蛋白异型体虽然在一级结构上同源性很高,
但时空表达调控方式不同(Meagher等1999a; Kumar
1997; Fyrberg等 1998; Kandasamy等 2002)。营养
型肌动蛋白表达具有组织和器官特异性, 因而可能
执行不同的功能(Meagher 等 1999b)。多种肌动蛋
白的并存, 有利于细胞对环境变化做出灵活和动态
的应答(Meagher 1991)。因此, 对于每一个肌动蛋
白异型体结构与功能的研究来说都是有意义的。
乌拉尔甘草是豆科甘草属的多年生草本植
物。目前, 对甘草肌动蛋白基因的研究尚未见报
道。本文报道乌拉尔甘草一种肌动蛋白基因的分
子克隆、结构分析和表达模式的研究结果。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 10 期，2009 年 10 月996
材料与方法
乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)种子
由内蒙古自治区通辽市农业科学研究院自野外采集
并馈赠。pCR®2.1-TOPO 载体购自 Invitrogen 公
司。大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α为东北师范
大学提供菌种。EcoRI及其缓冲液购自TaKaRa公
司; T4 DNA 连接酶及连接缓冲液购自 BBI 公司;
Taq DNA聚合酶及缓冲液购自 Invitrogen公司。总
RNA 提取试剂盒、mRNA 纯化试剂盒、PCR 凝
胶回收试剂盒和质粒精提试剂盒均购自 QIAGEN
公司; cDNA 合成试剂盒和 RT-PCR 扩增试剂盒购
自Invitrogen公司; 5 RACE试剂盒购自CLONTECH
公司。其它生化和分子生物学试剂均为国产分析纯。
简并引物序列为: 5 端引物P1, 5 ACCATGG-
CGGA(ACT)G(CAG)(AT)G(AG)(GA)GA(TA)(AG)T
3; 3 端引物 P2, 5 TTAGAAGCA(TC)TTCC(TG)-
GTG(GC)AC 3。特异性引物: 5 端引物 SP1, 5
ACCATGGCGGATGGAGAAGATG 3; 3 端引物
SP2, 5 TTAGAAGCATTTCCGGTGGAC 3。由上
海生物工程技术服务有限公司合成。
甘草种子消毒后, 于40 ℃水中浸泡12 h, 然后
于25 ℃恒温培养箱中暗催芽3 d。胚根长至0.5 cm
时, 移到光照培养箱中培养, 营养液为 Hoagland营
养液[5 mmol·L-1 Ca(NO3)2、5 mmol·L-1 KNO3、2
mmol·L-1 MgSO4、0.025 mmol·L-1 FeSO4-EDTA],
光 / 暗为 16 h/8 h, 光照强度为 100 μmol·m-2·s-1, 昼
夜温度为 24 ℃/22 ℃, 相对湿度为 70%。培养期
间无任何水分胁迫。培养 7 d后提取根总RNA, 电
泳检测其完整性、紫外分光光度法检测纯度后用
于基因克隆。继续培养 40 d 后提取根、茎、叶的
总 RNA 用于 Northern blot 分析。
甘草根用液氮速冻后, 采用TRIZOL法从中提
取总 RNA。Oligotex mRNA Mini Kit (QIAGEN)纯
化 mRNA 后进行逆转录反应合成 cDNA。参照
5 RACE试剂盒说明书进行cDNA的纯化和加尾后
作为 RT-PCR 的模板。在 50 μL 的 PCR 反应体系
中依次加入 5 μL 10× 缓冲液、2 μL 50 mmol·L-1
dNTPs、1.5 μL 50 mmol·L-1 MgCl2、100 μmol·L-1
P1 和 100 μmol·L-1 P2 各 2 μL、0.8 μL Taq 聚合
酶、2 μL 模板 cDNA, 其余用 ddH2O 补齐。PCR
反应条件为: 预变性94 ℃, 5 min; 变性94 ℃, 1 min;
退火 45 ℃, 1 min; 延伸 72 ℃, 1 min, 进行 35 个循
环; 72 ℃延伸, 7 min。取 5 μL PCR 产物进行电泳
检测。将预期大小的 PCR 产物凝胶回收后亚克隆
到 pCR®2.1-TOPO载体中, 由上海生物工程技术服
务有限公司测序。
甘草肌动蛋白基因cDNA序列的分析时, 首先,
用VectNTI软件包对所克隆的甘草肌动蛋白基因的
3 和 5 末端序列结果进行拼接, 获得全长。然后,
用 DNA Strider 1.2 对肌动蛋白 cDNA 序列、开放
阅读框(open reading frame, ORF)、氨基酸编码序
列、蛋白质疏水图进行分析。序列相似性及进化
地位分析用ClustalX 1.8进行多序列比对, MEGA3.0
建立表示亲缘关系的系统进化树。蛋白修饰位点
的预测采用 Prosite 软件。
甘草肌动蛋白基因的mRNA在甘草不同组织
部位的表达通过 Northern blot 进行分析。各取 20
μg 的甘草胚根、叶、茎和根的总 RNA 进行 1.2%
变性琼脂糖凝胶电泳后, 将RNA转移到Hybond-N+
尼龙膜上。尼龙膜在 RapidHyb 快速杂交液中于
68 ℃下预杂交 1 h, 然后用 32P 标记的 GuActin2 的
全长编码区 cDNA 序列片段制作的探针杂交 1 h。
尼龙膜用 0.2×SSC/0.1% SDS于 68 ℃洗 15 min, 重复
3 次。用双层增敏屏于-80 ℃下放射自显影 16 h。
结果与讨论
1 甘草肌动蛋白基因GuActin2的分子克隆
以甘草胚根 cDNA为模板进行RT-PCR, 扩增
产物电泳检测, 在分子量相当于 1 100 bp左右位置
存在 1 条清晰的泳带(图 1-a)。该泳带的大小与已
知植物肌动蛋白 Actin 的大小相近, 推断其为甘草
肌动蛋白Actin的序列。PCR产物凝胶回收后克隆
到 pCR®2.1-TOPO载体中, 质粒经载体上多克隆位
点EcoRI单酶切鉴定, 电泳结果显示, 2和3泳道有
2 条泳带(图 1-b), 分别长 3 900 bp 和 300 bp 左右,
2条带大小再加300 bp左右的总和与质粒预期大小
接近, 预示可能在基因编码区 cDNA 中存在 2 个
EcoRI 酶切位点。用 M13 Forward 引物和 M13
Reverse引物分别对质粒测序后, 将2 个cDNA片段
用 Vector NTI Suite 6.0 进行拼接, 有一个完整的
ORF, 表明得到 Actin 基因的完整编码区 cDNA 序
列。根据所拼接序列重新设计特异性引物用以扩
增所克隆基因全长编码区 cDNA序列。RT-PCR和
植物生理学通讯 第 45 卷 第 10 期，2009 年 10 月 997
质粒EcoRI单酶切鉴定的电泳结果如图2。挑选阳
性克隆再次测序的结果表明, 测得的序列与拼接的
序列一致(图 3-a)。该基因全长 1 137 bp, 包含 3 bp
的 5 非编码区、1 134 bp的 ORF, 编码一个由 377
个氨基酸残基组成的蛋白质, 预期分子量约 4 2
kDa。基因编码区 cDNA 序列在 379 和 766 bp 处
存在EcoRI酶切位点。该基因命名为GuActin2, 其
全长编码区 cDNA序列已登录GenBank, 登录号为
GQ 404511。
2 甘草肌动蛋白基因GuActin2全长编码区 cDNA
序列的生物信息学分析
将推断的肌动蛋白Actin2基因编码的氨基酸序
列在GenBank上进行Blast检索的结果表明, 其具有
图 1 甘草肌动蛋白基因GuActin2 全长编码区 cDNA的克隆
Fig.1 Molecular cloning of an actin gene
cDNA from G. uralensis
a: PCR 产物凝胶电泳图谱; b: 质粒酶切鉴定凝胶电泳图谱。
M: λ-HindIII+ϕX174-HaeIII DNA 分子量标准; 1: PCR 产物; 2 和
3: 质粒经 EcoRI 酶切鉴定。
图 2 用特异性引物对甘草肌动蛋白基因 GuActin2 全长编码区 cDNA的克隆
Fig.2 Molecular cloning of an actin gene cDNA from G. uralensis with special primer
a: PCR 产物凝胶电泳图; b: 质粒酶切鉴定凝胶电泳图。M1: DL2000DNA 分子量标准; M2: λ-HindIII+ϕX174-HaeIII DNA 分子
量标准; 1: PCR 产物; 2~6: 质粒经 EcoRI 酶切鉴定。
Actin家族典型的结构域(图 3-d)。采用ClustalX1.8
程序分析多序列相似性的结果(图 3-c和图 4)显示,
所得序列与GenBank中注册的Actin基因序列的相
似性均在 85% 以上。其中与蓖麻的核苷酸序列的
相似性为 94%, 与杨树的相似性为 92%, 与亮叶桦
的相似性为 89%, 与番茄、白桦、葡萄的相似性
均为 88%。用 CLUSTALW 聚类分析后, 采用相邻
连接法绘制进化树(图3-c)的结果显示, GuActin2与
番茄的 Actin 属同一种进化分支。
通过DNA Strider 1.2软件对甘草GuActin2的
氨基酸进行疏水性分析的结果表明, 其亲水氨基酸
含量很高, 具有很强的亲水性(图 3-b), 不具备明显
的跨膜区。
Prosite 软件分析显示, 甘草肌动蛋白 Actin 序
列具有肌动蛋白的特征信号序列YVGDEAQs.KRG
(55~65)和 WISKgEYDE (358~366), 以及肌动蛋白
和肌动蛋白相关蛋白的特征序列LLTEApLNPkaNR
(106~118); 同时, 存在可能的磷酸化位点: 4个丝氨
酸残基(Ser62、Ser147、Ser326、Ser340)和 3 个
苏氨酸残基(Thr68、Thr196、Thr231)。其中,
Ser340 可能是 cAMP 和 cGMP 依赖的蛋白激酶Ａ
(protein kinase A, PKA)磷酸化位点; Ser62、
Ser147、Ser326 和 3 个苏氨酸残基可能是蛋白激
酶C (protein kinase C, PKC)磷酸化位点; 另外, 还有
2 个潜在的酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase,
TPK)磷酸化位点和4 个酪蛋白激酶II (casein kinase
II, CKII)磷酸化位点以及糖基化(glycosylation)位点
和 N- 豆蔻酰化(N-myristoylation)位点。这表明,
GuActin2在蛋白水平上可能存在复杂的修饰和调控
作用。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 10 期，2009 年 10 月998
图 3 甘草肌动蛋白基因 GuActin2 全长编码区 cDNA序列的生物信息学分析
Fig.3 Bioinformatic analysis of actin gene cDNA from G. uralensis
a: GuActin2 基因的完整编码区 cDNA 序列和推断的氨基酸序列(GenBank 登录号为 GQ 404511); b: 推断的蛋白序列疏水图; c: 推
断的蛋白序列进化树分析; d: 甘草肌动蛋白基因 GuActin2 推断的蛋白序列保守结构域。
3 甘草肌动蛋白基因GuActin2在甘草不同组织部
位的表达
Northern blot 分析 GuActin2 在甘草根、茎和
叶中转录水平(图5)的结果表明, GuActin2在甘草的
根、茎、叶组织都有表达, 在根中, 尤其在胚根
中的表达强于在茎和叶中的表达。
总之, 荒漠植物甘草肌动蛋白基因 GuActin2
全长编码区 cDNA序列得到克隆。Northern blot分
析表明, 该基因的表达模式也与拟南芥肌动蛋白基
因Actin7相似, 拟南芥肌动蛋白基因Actin7属于营
养型亚类(Wasteneys 2000)。因此认为, 甘草肌动
蛋白基因 GuActin2 可能属于营养型亚类。有关
GuActint2在甘草发育过程中的功能和调控模式, 我
们准备将该基因用于拟南芥中正义超表达、反义
或 RNA 干扰的表达抑制方法对其进行研究。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 10 期，2009 年 10 月 999
图 4 甘草肌动蛋白基因 GuActin2 全长编码区推断的蛋白序列同源比对分析
Fig.4 Multiple sequence analysis of G. uralensis derived GuActin2 with the best scoring results
from similarity searches of sequence databanks
比对序列为甘草 GuActin2 (GenBank 登录号为 GQ 404511)、蓖麻(Ricinus communis, GenBank 登录号为 AY360221)、杨树
(Ponulus hopeiensis, GenBank 登录号为 XM002331844)、亮叶桦(Betula luminifera, GenBank 登录号为 FJ410442)、番茄(Solanum
lycopersicum, GenBank 登录号为 BT013524)、白桦(Betula platyplylla, GenBank 登录号为 EU588981)、葡萄(Vitis vinifera, GenBank
登录号为 XM0 02 28 2 48 0)。黑色区域表示相对保守部分, 浅色区域表示变异部分(颜色越深表示氨基酸同源性越高)。
植物生理学通讯 第 45 卷 第 10 期，2009 年 10 月1000
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图 5 甘草肌动蛋白基因 GuActin2 在胚根和
生长 40 d 幼苗的不同器官中的表达
Fig.5 Expression of GuActin2 in radicals and various organs
of 40-day-old G. uralensis seedlings
1: 叶; 2: 茎; 3: 胚根; 4: 根。