全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 7期, 2010年 7月 731
农杆菌介导的大麦Mlo反义基因转化小麦获得抗白粉病后代
赵同金 1,*, 刘恒 1,2,*, 赵双宜 1, 陈惠民 1, 夏光敏 1,**
1山东大学生命科学学院, 植物细胞工程与种质创新教育部重点实验室, 济南250100; 2山东中医药大学科研中心, 济南250355
提要: 从大麦 ‘斯特林 ’幼叶总 RNA中分离Mlo基因 cDNA完整编码区, 反向连接到植物双元载体(pBI-121.2) 35S启动子
下游, 通过农杆菌介导的苗端转化法获得两种小麦基因型(‘烟优2801’和 ‘烟优361’)的转基因小麦。T0代405株中有55株
PCR检测阳性, 平均转化率达到 13.58%, T0和T1基因组DNA Southern杂交可以证明大麦Mlo基因片段已整合到小麦基因
组中并可传递到后代。两种基因型的转基因小麦T0和T1植株在温室及大田中均表现出对白粉病抗性的提高。农杆菌介导
的苗端转化法可以简单、快速、高效地获得转基因株系; 排除体细胞变异对转基因植株的影响; 克服基因型对农杆菌转化
的限制, 是小麦遗传转化的一种实用方法。
关键词: 转基因小麦; 农杆菌转化; 白粉病; 大麦Mlo反义基因
Transgenic Wheat Progenies Resistant to Powdery Mildew Generated by
Agrobacterium Transformation of Barley Mlo Anti-Sense Gene
ZHAO Tong-Jin1,*, LIU Heng1,2,*, ZHAO Shuang-Yi1, CHEN Hui-Min1, XIA Guang-Min1,**
1The Key Laboratory of Plant Cell Engineering and Germplasm Innovation, Ministry of Education, School of Life Sciences,
Shandong University, Jinan 250100, China; 2Centre of Scientific and Research, Shandong University of Traditional Chinese
Medicine, Jinan 250355, China
Abstract: Complete coding region sequence of Mlo cDNA from barley cultivar ‘Stirling’ was cloned and
inserted into the BamHI site of binary vector pBI121.2, driven by 35S promotor in reverse direction. Two wheat
(Triticum aestivum L.) genotypes ‘Yanyou2801’ and ‘Yanyou361’ were transformed by Agrobacterium tumefaciens
with shoot apical meristem transformation method. A total of 55 T0 transgenic plants were obtained, and the
average transformation frequency was as high as 13.58%, Southern blot proved Mlo gene was integrated into T0
wheat genome and inherited to T1 progenies. The T0 and T1 transgenic plants of both genotypes showed higher
resistance to powdery mildew than the controls in both green house and field. The shoot apical meristem
transformation with A. tumefaciens is a simple, dependable and efficient method to generate transgenic wheat.
It can overcome the difficult of the restriction to transformation of different wheat genotypes, and can get rid of
the somoclonal variations due to tissue culture of immature embryos and calli.
Key words: transgenic wheat; Agrobacterium transformation; powdery mildew; barley Mlo anti-sense gene
收稿 2010-05-03 修定 　2010-05-11
资助 国家 “863”项目(2001AA241032)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-ma i l : x ia gm@sdu.edu .cn; T el : 05 3 1 -
8 8 5 6 4 5 2 5 )。
真菌性病害对植物的生长和发育可造成巨大
的威协, 严重影响其产量和品质。白粉病是由白粉
菌引起的真菌性病害, 能侵染650多种单子叶植物
和 9 000多种双子叶植物(Schulze-Lefert和Vogel
2000)。麦类白粉病能危害小麦、大麦及燕麦等,
尤以小麦受害最严重。小麦感染白粉菌后, 可导致
叶细胞死亡, 光合作用下降, 呼吸作用加强, 减产
10%到 15%, 严重者可达 20%以上。常规抗病育
种在小麦育种中发挥着重要的作用, 但是由于育种
周期长、对白粉病的抗性单一、抗性弱, 加之白
粉菌生理小种繁多、变异快, 严重影响小麦品种的
使用周期。在小麦及其近缘种中已定位了多个白
粉病抗性基因, 并已应用到常规抗病育种中。大麦
Mlo基因是通过Co60等诱变处理获得的一种广谱、
持久抗白粉病的突变体, Büschges等(1997)通过图
位克隆法获得其基因及其 cDNA, 对其基因结构、
功能和作用机理的研究结果表明: 该基因编码一个
七次跨膜蛋白, 有钙离子结合区、酪氨酸激酶区、
核定位信号, 可能与钙信号传递有关。但是它与己
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知的抗病基因所具有的典型的信号分子结构无明显
的同源性, 因而是一种新的抗病基因(Devoto等
1999, 2003; Elliott等 2002)。该基因隐性突变后可
引起叶细胞壁次生加厚, 导致部分叶细胞自发性的
编程死亡, 诱导植株的系统获得性抗性, 并可合成
一种酚类杀菌物质(pcHA), 该物质在体内和体外试
验中均表现出很强的抗真菌活性(Kim等 2002)。
小麦是大麦的近缘种, 其Mlo基因之间有92%的同
源性, 可能有着相同或类似的抗病作用机理, 通过
大麦Mlo基因双链RNA轰击小麦培养细胞, 确实可
以大大增强小麦对白粉菌的抵抗力(Schweizer等
2000)。本研究采用反义RNA技术, 向普通小麦基
因组中导入大麦Mlo反义表达基因, 期望在转录水
平上产生广谱抗白粉病的转基因小麦。
农杆菌 Ti 质粒介导的基因转移具有操作简
单、成本低、整合位点较稳定、拷贝数低、转
化效率高、整合后外源基因结构变异较小等优点,
该方法自创建以来,在双子叶植物遗传转化中得到
广泛应用。后来随着对农杆菌转化植物细胞原理
的深入认识, 通过添加外源信号物质如乙酰丁香酮
(AS)及其衍生物等也可以实现农杆菌对单子叶植物
的转化。近年来, 农杆菌转化玉米(Chan等 1993)、
水稻(Grimsley等 1987)及小麦(Xia等 1999; Xue等
2004)都有成功的报道。虽然人们已经实现了农杆
菌转化小麦的突破, 但由于小麦离体培养受基因型
的影响大, 易发生体细胞无性系变异等原因(薛哲勇
等2004a, b), 使得农杆菌介导的幼胚和愈伤组织转
化仍然受到很大的限制。本文报道利用农杆菌介导
的苗端转化法(国家发明专利号: ZL200410075774.7),
成功地实现了大麦Mlo反义基因转化小麦, 获得抗
白粉病转基因后代。
材料与方法
1 材料
小麦(Triticum aestivum L.)基因型 ‘烟优 361’
(‘济麦 19’)和 ‘烟优 2801’为优质高产推广品种和
品系, 但对白粉病较为敏感, 由烟台农科院小麦育
种室提供; 大麦(Hordeum vulgare L.) ‘斯特林’由济
南卢堡啤酒有限公司提供。植物表达载体 pBI121.2
为本室自存。RT-PCR试剂盒、平端连接试剂盒
购自TaKaRa公司; DNA片段回收试剂盒购自MBI
公司; ECL标记及检测试剂盒购自 Roche公司, 其
他试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 大麦Mlo基因 cDNA的分离及反义表达载体
的构建 取常温光照培养 7 d大麦幼叶材料 20 g, 采
用Piffanelli等(2002)报道的一步法提取总RNA, 按
TaKaRa公司的RNA PCR Kit (AMV) Ver2.1的要求
进行反转录, 克隆引物根据报道的Mlo基因序列设
计(Büschges等 1997) (P1: GTGCATCTGCGTG-
TGCGTA; P2: CAGAAACTTGTCTCATCCCTG)。
PCR反应条件为: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 20 s, 56.7 ℃ 20 s,
72 ℃ 2 min, 循环 32次; 72 ℃延伸 7 min。大麦
Mlo-PCR产物与 pBI-121.2载体反向连接, 新载体
命名 pBI-Mlo。
2.2 农杆菌介导小麦的转化 农杆菌介导的小麦遗
传转化采用苗端转化法(Zhao等 2006)。将含有
pBI-Mlo质粒的农杆菌菌株接种到 20 mL含有 50
mg·L-1卡那霉素 +50 mg·L-1利福平的YEP液体培
养基中, 于 28 ℃、170 r·min-1振荡培养 12~24 h,
10 000 r·min-1离心 3 min, 弃上清液。用加有 100
μmol·L-1 AS的MB2液体培养基重悬菌体, 稀释至
OD值 1.0左右。小麦种子经升汞表面消毒后室温
萌发2~3 d, 于4 ℃春化处理30 d, 幼苗长到2~5 cm
后, 切去胚芽鞘及一半的子叶, 露出生长点, 用 tip
从切口处滴加带有目的基因的农杆菌菌液, 在弱光
潮湿条件下 20 ℃左右恢复生长 5~6 d, 新叶片长出
后移栽并正常管理。
2.3 转基因植株的 PCR分析 以大麦Mlo基因设
计引物, P1: TATCCCTGCTCCTCATCGT; P2:
CGGACCTCCTCCTGTCGTTA。PCR条件为: 94
℃ 3 min; 94 ℃ 20 s, 56.7 ℃ 20 s, 72 ℃ 2 min, 循环
32次; 72 ℃延伸 7 min。
2.4 转基因植株的基因组 Southern杂交 pBI-Mlo
质粒DNA 0.1 μg, 转基因植株及阴性对照小麦的基
因组DNA 30 μg, 经限制性内切酶HindIII和EcoRI
双酶切后, 0.8%的琼脂糖凝胶电泳 16~18 h (15 V,
4 ℃), 转移到尼龙膜上, 按照Roche公司的Random
prime labeling and detection system进行杂交, 探针
为随机引物法(Zhao等 2006)标记的大麦Mlo基因
特异片段。
2.5 转基因植株的抗病性分析 选取转基因植株的
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后代在温室及田间种植, 以未转基因的植株间隔为
对照。对以上植株作白粉病接种, 并在苗圃的中央
用高感白粉病的品种‘辉县红’做白粉病的诱发区,
按病斑的多少计反应型。抗感标准分为 5级: 0级
为免疫, 无病斑; 1级为高抗, 基部叶有 1~3处病斑;
2级为中抗, 中部叶有少量病斑; 3级为中感, 上部
叶及穗部有较多病斑; 4级为高感, 叶及穗部有大
量病斑。统计植株发病情况, 计算反应级数。
实验结果
1 大麦Mlo基因的克隆及反义表达载体的构建
Mlo基因序列与Büschges等(1997)报道的序列
一致, 序列号为: Z83834.1。pBI-Mlo载体见图 1。
2 小麦转基因植株的PCR分析
将上述载体转入农杆菌菌株 AGL1, 分别对两
种受体小麦 ‘烟优 2801’和 ‘烟优 361’进行遗传转
化, 利用PCR对所得植株(T0代)的目的基因进行检
测, 结果见表 1。对 ‘烟优 361’小麦阳性植株 23号
(图 2-B)的后代 13株T1代株系进行PCR分析, 9株
表现出阳性(图3), 可以证明大麦Mlo基因已经整合
到小麦基因组中并遗传给后代。
3 小麦转基因植株的基因组 Southern杂交分析
pBI-Mlo质粒经HindIII和EcoRI双酶切, 可切
图 3 转基因植株 T1代Mlo基因的 PCR分析
Fig.3 PCR analysis of the Mlo transgenic T1 plants
M: 分子量标准 λDNA/HindIII+EcoRI; +: 质粒 DNA扩增
片段(1 322 bp); 1、2、5、6、7、8、11、12、13: ‘烟优 3 6 1 ’
T0代阳性株系 23 号的后代转基因阳性植株; －: 非转基因对照
植 株 。
图 2 转基因植株 T0代Mlo基因的 PCR分析
Fig.2 PCR analysis of the Mlo transgenic T0 plants
M: 分子量标准 λDNA/HindIII+EcoRI; +: 质粒DNA扩增片
段(1 322 bp)。A: 转基因植株 ‘ 烟优 2801’; 46、56、64、69 :
转基因阳性植株; －: 非转基因对照植株。B: 转基因植株 ‘ 烟
优 3 6 1 ’ ; 2、1 6、1 7、1 8、2 2、2 3、3 3、3 8 : 转基因阳性
植株; －: 非转基因对照植株。
图 1 pBI-Mlo质粒 T-DNA区结构图
Fig.1 T-DNA region of the plasmid pBI-Mlo
LB和 RB 为 T-DNA左右边际序列, Pnos和 Tnos为 nos基因的启动子和终止子, 35S为 35S启动子, NptII为卡那霉素抗性基因,
Mlo为大麦Mlo 反义基因, gus 为大肠杆菌葡萄糖苷酸酶基因。
表 1 转大麦Mlo反义基因 T0代植株 PCR检测结果
Table 1 PCR positive analysis of T0 transgenic wheat
实验植株数 阳性植株数 转化率 /%
批次
‘ 烟优 ‘ 烟优 ‘ 烟优 ‘ 烟优 ‘烟优 ‘ 烟优
2801’ 361’ 2801’ 361’ 2801’ 361’
第 1批 19 70 3 6 15.79 8.57
第 2批 127 84 1 4 1 1 11.02 13.09
第 3批 64 41 1 4 7 21.88 17.07
合计 210 195 3 1 2 4 14.76 12.31
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下 4.8 kb左右的片段。转基因植株和对照小麦基
因组DNA经HindIII和EcoRI双酶切后进行Southern
杂交分析。结果表明: ‘烟优 2801’的 T0代和 T1代
转基因植株46和69植株中均出现4.8 kb的杂交带;
‘烟优 361’的 T0代转基因的 2、16和 23植株中均
出现 4.8 kb的杂交带。‘烟优 2801’的 T1代转基因
植株的 Southern杂交表明, 46-1、46-2、69-7和
69-8均有 4.8 kb杂交信号(图 4)。转基因植株和非
转基因植株在 4.0 kb、3.5 kb和 2.0 kb均出现
杂交信号, 很可能是小麦基因组DNA经HindIII和
EcoRI双酶切后, 其Mlo基因片段因与大麦Mlo
cDNA同源性较高, 发生杂交的结果所致。
4 转基因植株外源基因的表达及抗病性分析
分别对转基因植株的T0和T1代进行温室和田
间的白粉病抗性分析, 以白粉病敏感品种 ‘辉县红 ’
为抗原来源, 从苗期(两叶一心期)到开花灌浆期, 均
可观察到小麦白粉病的发生。‘烟优 2801’和 ‘烟
优361’对照在温室中的发病比较明显, 特别是在开
花期和成熟期, 而大麦Mlo转 ‘烟优 2801’和 ‘烟优
361’的 T0代阳性植株对白粉病的抗性明显高于亲
本对照 1到 2个级别(表 2), 虽然未达到免疫水平,
但也普遍达到高抗水平。部分抗性植株的下部叶
片有少量病斑, 旗叶也有零星感染, 但总体比亲本
对照发病延迟, 症状减轻。由同一 T0植株产生的
T1株系其抗病程度发生明显分离, 少部分株系表现
为对白粉病敏感, 有部分株系的分离比符合单基因
图 4 Mlo转基因植株的基因组 Southern杂交分析
Fig.4 Genomic Southern analysis of the Mlo transgenic plants
M: 分子量标准 λDNA/HindIII+EcoRI; +: HindIII和 EcoRI双酶切的 pBI-Mlo质粒。A: ‘烟优 2801’ T0代; 46、69: 转基因植株;
－: 非转基因对照植株。B: ‘烟优 361’ T0代; 2、16 和 23: 转基因植株; －: 非转基因对照植株。C: ‘烟优 2801’ T1代; 46-1、46-
2、69-7 和 69-8 分别为 46 和 69 的两个转基因植株后代; －: 非转基因对照植株。
表 2 T0代Mlo转基因植株的白粉病抗性分析
Table 2 Resistance analysis of T0 Mlo transgenic
plants to Powdery mildew
植株 反应级数
‘烟优 2801’ 对照植株 2.76
阳性植株 1.20
‘烟优 361’ 对照植株 2.50
阳性植株 1.73
遗传。大田中的部分 T1代株系也表现为明显提高
的抗病表型(图 5)。
讨　　论
抗病育种是作物育种学家的重要目标之一, 而
小麦白粉病的抗性育种具有重要理论和实践意义。
由于病原微生物和植物的长期进化和适应, 抗性基
因与病原微生物的激活物应特异性识别, 才能引发
植物的抗病性反应(Dale等 1989)。因这种识别是
特异性的, 目前所分离的绝大多数抗病基因对病原
菌的抗性均具有很强的专一性, 这就决定了其不能
识别其他生理小种所产生的激活物, 导致其抗病谱
较窄, 而不同病原菌生理小种的快速变异往往使这
些抗性基因失效。许多抗病基因的产物均具有
NBS-LRR结构域, 这就为分离其编码基因提供了有
利条件(Marks等 1989)。但植物中有部分病原菌
生理小种产生广谱性和强抗性的突变, 例如来自
植物生理学通讯 第 46卷 第 7期, 2010年 7月 735
簇毛麦的 Pm21、拟南芥的 Rpw8.1和 Rpw8.2、大
麦的Mlo等。它们对白粉病的抗性反应显然不符
合基因 -基因假说, 而且从其基因结构、蛋白产物
的性质分析也与已知的典型抗病基因无明显的同源
性, 这说明植物对白粉病的广谱抗性可能有着完全
不同的机理。
大麦Mlo基因产物定位于质膜上, 是一个具有
7个跨膜区的膜蛋白, 含有钙结合区、激酶作用区
和NBS位点。虽然我们尚不清楚Mlo基因的隐性
突变或缺失如何导致植物对白粉病产生广谱而持久
的抗性; 只存在于植物界的Mlo基因产物的作用是
什么; 其突变后是如何引起植物细胞壁的次生加
厚、合成并积累 pCHA物质、引起叶细胞的编程
死亡、诱发整个植株产生系统获得性的抗性
(Schweizer等 2000), 但 Schweizer等(2000)将Mlo
大麦RNA双链引入小麦培养细胞, 己经实现了单细
胞水平对白粉病的抗性, 结合我们用大麦反义Mlo
转化小麦的结果, 说明由Mlo基因的缺失、突变
和抑制其表达而获得的对白粉病的广谱抗性在植物
界可能具有相同的机理。
图 5 T1代Mlo转基因植株田间白粉病抗性分析
Fig.5 Resistance analysis of T1 Mlo transgenic
plants to Powdery mildew
A: 非转基因对照小麦 ‘烟优 2801’; B: 转基因 ‘烟优 2801’
T1 6 9-1 株系。
虽然已报道有多种方法可以成功转化小麦, 但
比较常用的方法还是以基因枪法和农杆菌感染法为
主。基因枪法转化小麦虽然操作简单, 不受小麦基
因型的影响, 但转化效率较低, 且容易产生多拷贝
插入而引起目的基因沉默现象(Zhao等 2006)。农
杆菌介导的遗传转化法已成功的实现了原生质体、
胚性愈伤组织、幼胚、花序的转化, 获得的转基
因植株也多为单拷贝插入, 表现为孟德尔遗传, 但
目的基因的转化率一般在 3%以下。更重要的是
许多广范栽培的小麦品种难以建立高效的再生体
系, 因而小麦的农杆菌转化还受到小麦基因型的严
格限制(薛哲勇等 2004a, b)。由于受到体细胞无性
系变异、染色体削减等影响, 所获得的转基因植株
可能出现不育而无法获得转基因后代(薛哲勇等
2004a)。我们通过农杆菌感染幼苗生长点将大麦
Mlo反义基因导入两种不同基因型的栽培小麦基因
组中, T0代平均转化率可达 13.71%, 通过 PCR和
基因组DNA Southern blot验证, 大麦Mlo基因已
整合到小麦基因组中并遗传到T1代, 使受体小麦对
白粉病的抗性明显提高。同样, 本课题组采用相同
的方法也实现了葡聚糖酶和几丁质酶基因对小麦的
转化, 转基因小麦对白粉病的抗性也有明显提高
(Zhao等 2006)。由于小麦种子萌发 1~4 d的幼苗
生长点较小, 在农杆菌感染部分细胞后, 只有少数
能产生纯合系, 其他的容易发育成嵌合体, 这就要
求在进一步的工作中对阳性植株进行抗生素筛选,
以获得较多的转基因纯系(Zhao等 2006)。
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