全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 3 期，2009 年 3 月 253
收稿 2008-12-12 修定 　2009-01-16
资助 国家自然科学基金(20776058)和 2006 年教育部新世纪
优秀人才支持计划(N CET-06 -0 64 6)。
* 通讯作者(E-mail: yulj@hust.edu.cn; Tel: 027-87792264)。
红豆杉细胞稳定生产紫杉醇中的同步化协同诱导作用
李丽琴, 付春华, 赵春芳, 王圣, 余龙江 *
华中科技大学生命科学与技术学院, 武汉 430074
提要: 同步化协同诱导可以稳定提高曼地亚红豆杉细胞培养物中紫杉醇含量。细胞培养周期第8 d的低温同步化处理可促
使细胞达到最高同步化率(20.4%), 而茉莉酸甲酯(MJ)的协同诱导可提高紫杉醇产量, 使紫杉醇产量最高值达到54.7 mg·L-1。
在细胞生长周期第 8 d, 未经低温同步化的红豆杉细胞中的关键酶基因DXR、HMGR、GGPPS和DBAT的表达量在MJ诱
导 24 h后均迅速下降, 但在低温同步化的细胞中紫杉醇表达量下降缓慢, 60 h后仍维持较高的水平。低温同步化和MJ协
同诱导的红豆杉细胞中, 紫杉醇合成关键酶基因高效稳定的表达可能是引起紫杉醇产量稳定提高的原因之一。
关键词: 同步化; MJ诱导; 曼地亚红豆杉; 紫杉醇
Effects of Synchronization and Synergistic Induction on Taxol Content in Taxus
Cells
LI Li-Qin, FU Chun-Hua, ZHAO Chun-Fang, WANG Sheng, YU Long-Jiang*
Department of Biological Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China
Abstract: Synchronization and synergistic induction could increase taxol content in Taxus media cv. Hicksii
cells steadily. Cold treatment could improve the synchronization rate of cultured cells, the highest synchroniza-
tion rate reached 20.4% in the 8th d of a cell cycle. In the cells with cold treatment in the 8th d, the taxol content
could be further increased by the induction of methyl jasmonate (MJ), and the maximal taxol content reached
54.7 mg·L-1. In the 8th d, the expression levels of DXR, HMGR, GGPPS and DBAT decreased rapidly after 24 h
induced by MJ in cells untreated with cold. On the contrary, these genes expression decreased slowly in cells
with cold treatment, and the genes expression maintained higher levels after 60 h induced by MJ. Altogether, in
cells with cold synchronization treatment and MJ induction, the high and steady expression of taxol biosynthetic
pathway key genes maybe one reason for the steady improvement of taxol content.
Key words: synchronization; MJ induction; Taxus media cv. Hicksii; taxol
紫杉醇(taxol)是来源于红豆杉属植物树皮或枝
叶中具有良好抗肿瘤活性的天然药物( Wa ni 等
1971)。然而, 由于红豆杉树生长缓慢且树皮中的
紫杉醇含量甚微, 以致紫杉醇药源短缺与需求量迅
速增加之间的矛盾日益尖锐。采用红豆杉细胞培
养技术生产紫杉醇是最有希望解决这一矛盾的途径
之一。迄今, 有关细胞培养法生产紫杉醇的研究已
取得较大进展, 采用茉莉酸甲酯(MJ)、真菌诱导子
(Yari Khosroushashi 等 2006)、苯丙氨酸(Yuan 等
2001)、赤霉素(Zhang 等 2004)等对红豆杉细胞进
行代谢调控都能有效提高紫杉醇产量。但是, 红豆
杉中紫杉醇合成的不稳定性仍然是制约其工业化生
产的瓶颈。从外植体分离得到的植物细胞有广泛
的异质性和变异性。这种不均一性在离体细胞培
养过程中常表现为部分细胞的形态颜色发生变化、
不同小细胞团的生长速率不一致、细胞有丝分裂
周期不同步、合成次生代谢产物能力发生变化等
现象(Yanpaisan等 1998)。产生这种不均一性的原
因、机制和解决策略仍缺乏系统的研究。Yu 等
(2002)的研究表明, 红豆杉细胞同步化培养能促进
紫杉醇的产量在一定时期内保持稳定。Naill 和
Rroberts (2005)提出茉莉酸甲酯诱导的红豆杉细胞
在提高紫杉醇产量的同时也可提高G0/G1期红豆杉
细胞的比例。同时, 紫杉醇在细胞有丝分裂的
G2-M期促进微管蛋白装配成微管并抑制微管解聚,
具有调控细胞周期的能力。据此, 我们推测细胞的
周期活性可能与红豆杉细胞合成紫杉醇的能力有
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关, 并在本文进行了探讨。
材料与方法
以我们实验室继代培养的曼地亚红豆杉(Taxus
media cv. Hicksii)悬浮培养细胞系为材料, 培养基
为我们实验室研制的改良B5培养基(杨秦等2006),
其中含 0.1 mg·L-1 2, 4-D、0.5 mg·L-1 6-BA 和 0.5
mg·L-1 NAA, pH 为 5.8。红豆杉细胞在转速 120
r·min-1、温度(24±1) ℃的摇床上暗培养。
以细胞接种到下一次, 继代间隔的24 d为1个
细胞生长周期。诱导处理时, 在 1个细胞生长周期
中, 每 4 d取样一次检测细胞同步化率, 同时用 100
µmol·L-1 MJ 诱导 12 d, 每 3 d 取样一次测量紫杉醇
含量。低温同步化方法参照 Yu 等(2002)方法, 采
用 4 ℃低温处理 24 h。在 1个细胞生长周期中, 每
4 d取样一次进行低温同步处理后检测细胞同步化
率, 恢复培养 12 d, 每 3 d 取样一次测量紫杉醇含
量。低温同步化与 MJ 协同诱导时, 在 1 个细胞生
长周期中, 每 4 d 取样一次, 进行低温同步处理后
用 100 µmol·L-1 MJ 诱导 12 d, 每 3 d 取样一次测量
紫杉醇含量。以上 3 组实验均重复 3次取平均值。
同步化率检测采用以下方法, 以 0.1 mol·L-1磷
酸盐缓冲液(pH=6.8)清洗细胞后用细胞裂解液破壁,
加50 mg·L-1碘化丙啶(PI) (含0.1% RNase A), 25 ℃
避光孵育 30 min。染色后的细胞用 FACSort 流式
细胞仪(Becton Dickinson)检测。Cell Quest soft-
ware 软件计算 G2-M 期的细胞比例。每组实验均
重复 3 次取平均值。
细胞紫杉醇含量用高效液相色谱(HPLC)法测定,
具体方法参见Zhang和 Fevereiro (2007)。鲜细胞冷
冻干燥至恒重, 用甲醇/二氯甲烷(CH3OH-CH2Cl2) 混
合液浸泡超声(功率 300 W, 40 min)。取浸提液加
二氯甲烷、双蒸水、硫酸铵饱和溶液萃取, 收集
二氯甲烷层液体, 40 ℃下真空干燥, 甲醇重新溶解
蒸干残留物后进行检测。HPLC 仪为美国 Agilent
1200 全自动高效液相色谱仪, 色谱柱为 reverse-
phase Eclipse XDB-C18 column (4.6 mm×150 mm,
Agilent, USA), 柱温 25 ℃, 检测波长 227 nm, 流动
相为甲醇:水=7:3, 流速 1.0 mL·min-1, 紫杉醇标准品
由美国 NCI 提供。
DXR、HMGR、GGPPS 和 DBAT 基因表达
量用实时荧光定量 P C R 技术检测。D X R 、
HMGR、GGPPS和DBAT基因的定量 PCR引物序
列及荧光定量 PCR 技术方法参见 Li 等(2009)。总
RNA 提取采用 Trizol (Invitrogen, USA)试剂。
SuperScriptTM Ⅱ Reverse Transcriptase (Invitrogen,
USA)合成 cDNA 第一链。采用 DyNAmo SYBR
Green qPCR Kit (Finnzymes, Finland) 进行荧光定量
PCR 反应。定量 PC R 仪为 Roter -Gene 3000
(Corbett, Australia)。18S rDNA 和 HMGR 的反应
条件为94 ℃ 25 s, 48 ℃ 25 s, 72 ℃ 25 s, 40个循环;
DXR、DBAT 和 GGPPS 的反应条件为 94 ℃ 25 s,
50 ℃ 25 s, 72 ℃ 25 s, 40 个循环。目标基因表达
量先用内标基因 18S rDNA 的表达量进行校正, 校
正公式为 ∆Ct (specific gene)=Ct (specific gene)-Ct
(18S rDNA), 根据实验中目标基因最低的∆Ct值作
为标准来计算其他样品中目标基因的相对表达量,
计算公式为 100×2-∆∆CT, ∆∆CT=∆Ct (specific gene)-
∆Ct (specific gene) the lowest level。每个反应重复 6 次,
2 个生物学重复, 3 个平行样品。
结果与讨论
1 不同时期低温同步化处理对细胞同步化率的影响
第0~16天的低温同步化处理能不同程度地提
高细胞同步化率, 第 8天达到最大值。随着培养时
间的延长, 同步化率逐渐下降。在第 20~24天进行
低温同步化不能有效提高细胞同步化率(图 1)。
图 1 同步化前后红豆杉细胞的 G2-M 期细胞比例
Fig.1 The percentage of cells in G2-M phase with cold
treatment or not
a: 两组数据具有显著性差异(P<0.05, n=3); b: 两组数据无显
著性差异(P>0.05, n=3)。- -: 同步化处理后的细胞样品; - -: 未
经同步化处理的细胞样品。
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2 低温同步化与MJ协同诱导对紫杉醇含量的影
响
低温同步化与MJ协同诱导可提高红豆杉细胞
合成紫杉醇的产量。在细胞生长周期的第 8 天进
行低温同步化处理, 红豆杉细胞的同步化率可达到
最高值(20.4%) (图 1)。在细胞生长周期的第 8 天
进行低温同步化后再进行MJ诱导, 诱导后的第6天
紫杉醇含量达到最大值 54.7 mg·L-1 (图 2-b)。在
细胞生长周期的第 0~16 天进行低温同步化后, MJ
诱导后的第3天, 紫杉醇产量均明显低于相应的未
经过同步化的细胞。同时, 低温同步化后的细胞在
MJ诱导后的第6~12天紫杉醇产量与相应的未经低
温同步化的样品相比均有不同程度的提高。但是,
在细胞生长周期的第 20~24 天进行低温同步化与
MJ协同诱导的细胞并没有出现与上述在第0~16天
进行低温同步化与MJ协同诱导细胞同样变化趋势
(图 2 - e、f )。
此外, 低温同步化与MJ协同诱导还提高了紫
杉醇合成的稳定性。没有经过低温同步化的细胞
在生长周期的不同时间段内只用 MJ 进行诱导, 紫
杉醇含量达到最大值的时间为诱导后的第3或6天,
但并无一定的规律性(图 2)。并且, MJ 诱导后的
图 2 不同时期诱导或同步化处理对培养细胞中紫杉醇含量的变化
Fig.2 Taxol content with synchronization cold treatment and/or MJ induction
a ~ f 分别代表在细胞周期的第 4、8、1 2、1 6、2 0、2 4 天进行处理。- - : 低温同步化与 MJ 协同诱导组; - - : MJ 诱导组;
- -: 低温同步化组; 每组实验均重复 3 次。
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6~12 d紫杉醇含量显著下降, 0~12 d的紫杉醇含量
的波动幅度很大(图 2)。然而, 低温同步化与MJ协
同诱导的细胞的紫杉醇含量均在MJ诱导后的第 6
天达到峰值, 而且大部分细胞的紫杉醇含量到第12
天仍维持较高水平(图 2-a~d)。但是在细胞生长周
期的第 20、24 天低温同步化与 MJ 协同诱导的细
胞无相似的变化趋势(图 2-e、f)。这可能是由于
处于此时期的红豆杉细胞的同步化率较低。
与诱导组和低温同步化 MJ 协同诱导组相比,
单纯的低温同步化组红豆杉细胞合成紫杉醇的能力
变化不大(图 2)。
3 DXR、HMGR、GGPPS和DBAT基因的表达
量变化
结果 1、2表明在细胞生长周期的第 8天进行
低温同步化后, 红豆杉细胞的同步化率显著提高并
达到整个生长周期的最大值(图 1), 在低温处理 8 d
后用 MJ 诱导处理, 紫杉醇的含量在第 6 天达到了
生长周期中的最高值(图 2-b)。为了进一步研究细
胞生长周期第8天的同步化率影响紫杉醇含量的作
用机理, 我们利用实时荧光定量PCR技术在生长周
期第 8 天检测了 MJ 诱导组和低温同步化与 MJ 协
同诱导组细胞在 0~60 h内DXR、HMGR、GGPPS
和DBAT基因的表达量。红豆杉细胞cDNA经PCR
扩增后得到 18S rDNA、DXR、HMGR、GGPPS
和 DBAT 基因产物。经琼脂糖凝胶电泳检测与目
标片段大小一致(图 3)测序无误后, 实时荧光 PCR
定量检测的结果表明, 经过 MJ 诱导后 4 个紫杉醇
合成关键基因的表达量在 24 h 内均明显上升。但
低温同步化与 MJ 协同诱导组细胞中, 这 4 个关键
基因表达量的上调时期和上调幅度都发生了明显的
改变, 说明低温同步化对紫杉醇生物合成途径中从
上游IPP前体合成到下游紫杉醇母核形成的许多关
键酶基因的表达都有调控作用(图 4)。未经低温同
步化的细胞中的关键酶基因表达量在诱导 24 h 后
均迅速下降(图 4-a)。但低温同步化与 MJ 协同诱
导的细胞中, 这些关键基因的表达量下降减缓, 诱
导 60 h 后仍维持较高水平(图 4-b)。这说明, 红豆
杉细胞低温同步化可促使紫杉醇合成关键酶基因高
水平表达并维持更长的时间, 因此红豆杉细胞低温
同步化与MJ协同诱导可能是促进紫杉醇产量稳定
的原因之一。当然, 在低温同步化与 MJ 协同诱导
图 3 红豆杉细胞紫杉醇合成关键酶
基因的琼脂糖胶电泳图谱
Fig.3 Real time PCR of taxol biosynthetic
pathway key genes in Taxus cells
1: 2 000 bp DNA ladder; 2: HMGR; 3: DBAT; 4: GGPPS; 5:
18S rDNA; 6: DXR。
图 4 细胞生长周期第 8 天 MJ 诱导后红豆杉细胞中 DXR、HMGR、 GGPPS 和 DBAT 在 0~60 h 内的表达量变化
Fig.4 Relative transcript levels of DXR, HMGR, GGPPS and DBAT by MJ induction for 0~60 h
after the cold treatment in the 8th day
a: 未经低温同步化处理, 只进行 MJ 诱导处理; b: 低温同步化与 MJ 协同诱导处理。
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过程中, 除了紫杉醇合成关键酶基因的表达量发生
变化之外, 植物细胞中其他与温度调控和细胞周期
调控相关的基因、相关的蛋白的表达变化都可能
是代谢产物含量变化的物质基础, 所以尚需要更深
入的研究。
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