全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 1期，2009年 1月 6 3
分光光度法测定叶绿素含量及其比值问题的探讨
袁方, 李鑫, 余君萍, 王学奎 *, 徐久玮, 张立新
华中农业大学植物科技学院中心实验室, 作物生理与栽培研究中心, 武汉, 430070
Methodological Study on Determination of Chlorophyll Contents and Ratio of
Chl a/Chl b by Spectrophotometry
YUAN Fang, LI Xin, YU Jun-Ping, WANG Xue-Kui*, XU Jiu-Wei, ZHANG Li-Xin
Crop Physiology and Production Center, Central Laboratory of College of Plant Science & Technology, Huazhong Agricultural
University, Wuhan 430070, China
提要: 本文以水稻、棉花、玉米以及喜荫植物吉祥草为材料, 采用分光光度法比较了不同性能的分光光度计对叶绿素含量
及其比值测定的影响。结果表明, 狭缝宽度过小或过大均导致叶绿素定量结果的相对误差增大, 但仪器的波长偏移是引起
测定结果误差的主要原因。波长偏差超过1 nm时会影响混合溶液中叶绿素b的定量结果以及叶绿素的相对比值(Chl a/Chl
b), 波长 “蓝移 ”引起Chl a/Chl b偏高, 波长 “红移 ”则导致Chl a/Chl b偏低。波长偏移及波长重现性差是造成Chl a/Chl b比
值偏离其“理论比值”、导致测定数据之间缺少可比性的原因。选择具有波长自动校准功能、波长精度高、狭缝宽度在1~2
nm的分光光度计用于叶绿素含量及其比值的测定则可获得可比性强、重现性好、准确度高的结果。
关键词: 分光光度法; 叶绿素含量; 叶绿素比值
收稿 2008-09-08 修定 2008-12-04
资助 大学生科技创新项目和湖北省高等学校教学研究项目
(2 0 0 4 0 1 4 4 )。
* 通讯作者(E-mail: wang-xuekui@mail.hzau.edu.cn; Tel:
02 7-87 28 21 30 )。
叶绿素是绿色植物光合作用的基础物质, 可反
映植物的生长发育状况、生理代谢变化以及营养
状况, 并且可作为环境生理研究的参考指标。因
此, 叶绿素含量以及叶绿素 a、b的相对比值常常
用作研究植物生长发育的生理指标。
测定叶绿素含量的方法有离体法(如分光光度
法)和活体法(如叶绿素仪法) (苏正淑和张宪政
1989)。分光光度法具有准确度高的特点, 是叶绿
素含量测定过程中应用最广泛的方法。由于生产
分光光度计的厂家众多, 不同型号仪器间的性能差
异很大, 在测定叶绿素含量, 尤其是在叶绿素 a与
叶绿素 b相对比值的测定过程中存在较大差异(杨
善元1983; 刘秀丽等1999; 牟晓玲2004), 因此影响
了叶绿素作为植物生长发育参考指标的可比性。
本文探讨了不同厂家的性能不同的分光光度
计对测定植物叶绿素含量以及叶绿素 a、b之间相
对比值的影响, 以供相关研究者参考。
材料与方法
1 实验材料
实验材料为水稻(Oryza sativa L.)、棉花
(Gossypium hirsutum L.)、玉米(Zea mays L.) (分别
由本校水稻组、棉花组和玉米组提供)和喜荫植物
吉祥草(Reineckia carnea Andr. Kunth) (由本校园林
公司提供)。利用上述实验材料的功能叶片测定叶
绿素含量。
2 实验方法
2.1 叶绿素的分离与纯化 以水稻剑叶作为分离、
纯化叶绿素的材料。叶绿素的提取和分离参照果
秀敏等(2000)的方法并进行适当修改。将水稻功
能叶片(剑叶)置于石油醚(30~60 ℃)-无水乙醇(3:2,
V/V)混合溶液中研磨成浆状, 转移至分液漏斗中, 加
入等体积的蒸馏水洗去水溶性物质和乙醇, 静置分
层(必要时加少量的饱和NaCl溶液), 取出含色素的
石油醚溶液并置于暗中备用。将硅胶G60 (青岛海
洋化工厂, 薄层层析用)与蒸馏水按1:3的比例研磨
成浆状后涂布薄层板, 晾干, 于110 ℃下活化1~2 h
后用于叶绿素的薄层分离。流动相为石油醚
(30~60 ℃)-丙酮 -苯(2:1.5:2, V/V)混合液。分离
后的叶绿素 a、b分别用丙酮抽提, 在暗中真空干
燥后作为参照品。
2.2 叶绿素含量测定 在暗中用80%丙酮提取叶绿
素后用分光光度法测定叶绿素含量(王学奎2006)并
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计算叶绿素 a、b的相对比值, 重复 3次。
实验中采用的分光光度计分别来自尤尼柯
(UNICO, 上海)、日立(HATACHI)、北京瑞利、
上海上分和上海光谱 5个厂家, 前两种分别为固定
狭缝(1.8 nm)、波长精度为 ±0.5 nm和可调狭缝
(0.1~5 nm)、波长精度为 ±0.3 nm的具有波长自
动校准功能的双光束分光光度计, 后三种分别为狭
缝宽度 2、4、6 nm (波长精度均为 ±2 nm)的单
光束分光光度计。
实验结果
1 叶绿素的分离与纯化
水稻叶片的混合色素经硅胶G60薄层分离后可
得到7种不同的色素斑点(图1), 从展开剂端至点样
端依次为: β-胡萝卜素、去镁叶绿素 a、叶绿素
a、叶绿素 b、叶黄素、紫黄质和新黄质, 这与
已有的研究结果(彭光华等1998; 果秀敏等2000)相
吻合。将分离得到的叶绿素 a和叶绿素 b分别用
80%丙酮抽提后测定其在红光区的吸收光谱(图2),
其峰型对称, 与相应的标准图谱一致, 说明经层析
分离得到的叶绿素 a、b具有较高的纯度, 再于暗
中低温真空干燥后得到的粉状物作为叶绿素 a、b
“ 标准品 ” 的参照品。
将层析、纯化、真空干燥后的叶绿素 a、b
分别溶于80%丙酮中, 在其最大吸收波长处于不同
狭缝(可调狭缝、双光束分光光度计)下测定吸光
度后, 参照相应的摩尔吸光系数计算出实测浓度(表
1)。结果表明, 较小的狭缝宽度(0.1和 0.5 nm)下
测定结果的标准差(SD)较大, 狭缝宽度等于或大于
1 nm时测定结果的标准差小; 但随着狭缝宽度
的增加, 测定结果呈现减小的趋势; 狭缝宽度小于
0.5 nm或大于 4 nm时, 测定结果的相对误差均较
大。
表 1 狭缝宽度对叶绿素测定的影响
狭缝宽度 /nm
叶绿素 a 叶绿素 b
实测浓度 /mg·L-1
相对误差 /%
实测浓度 /mg·L-1
相对误差 /%
平均值 ±SD 平均值 ±SD
0.1 6.53 0.55 0.46 7.09 0.67 1.29
0.5 6.52 0.11 0.31 7.06 0.16 0.86
1 6.51 0.01 0.15 7.03 0.01 0.43
2 6.51 0.01 0.15 7.01 0.01 0.14
4 6.43 0.01 1.08 6.93 0.01 1.00
5 6.39 0.01 1.69 6.87 0.01 1.86
表中叶绿素 a和叶绿素 b的配制浓度分别为 6.5 mg·L-1和 7.0 mg·L-1。
图 1 水稻叶片叶绿素层析分离图谱
1: β-胡萝卜素; 2: 去镁叶绿素 a; 3: 叶绿素 a; 4: 叶绿素 b; 5:
叶黄素; 6 : 紫黄质; 7: 新黄质。
图 2 叶绿素 a和叶绿素 b的红光区吸收光谱
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2 波长偏移对叶绿素含量及其比值的影响
选取C3植物水稻、C4植物玉米和喜荫植物吉
祥草的功能叶片, 用80%丙酮研磨抽提得到叶绿素
混合溶液, 采用 2种具有波长自动校正功能的双光
束分光光度计测定叶绿素含量的结果(表2)表明, 对
于最大吸收波长为 663 nm的叶绿素 a而言, 波长
偏差在 2 nm以内时, 对定量测定值的影响不显著;
但波长偏向长波(665 nm)时, 对叶绿素 a测定值的
影响程度明显大于短波(661 nm)偏离的影响。
就叶绿素混合液中最大吸收波长为645 nm的
叶绿素 b (80%丙酮溶液中)而言, 波长偏离会严重
影响含量的测定。波长偏离 1 nm时, 虽然对叶绿
素 b含量测定的影响程度尚未达到显著差异水平,
但与 645 nm下的测定结果相比, 其相对偏差达到
4%~7%; 一旦波长偏差达到 2 nm时, 则叶绿素 b
含量测定结果的相对偏差大于 10%, 差异显著。
表 2 波长偏差对叶绿素含量测定的影响
波长 /nm
水稻 玉米 吉祥草
叶绿素 a含量 /mg·L-1 叶绿素 b含量 /mg·L-1 叶绿素 a含量 /mg·L-1 叶绿素 b含量 /mg·L-1 叶绿素 a含量 /mg·L-1 叶绿素 b含量 /mg·L-1
661 10.274 (98.22)a 6.682 (98.21)a 5.587 (98.69)a
662 10.427 (99.68)a 6.782 (99.68)a 5.650 (99.81)a
663 10.460 (100.00)a 6.804 (100.00)a 5.661 (100.00)a
664 10.340 (98.85)a 6.737 (99.02)a 5.598 (98.89)a
665 10.055 (96.13)a 6.560 (96.41)a 5.439 (96.08)a
643 3.002 (88.48)d 1.634 (88.18)d 2.403 (90.14)d
644 3.189 (93.99)cd 1.736 (93.69)cd 2.535 (95.09)cd
645 3.393 (100.00)bc 1.853 (100.00)bc 2.666 (100.00)bc
646 3.597 (106.01)ab 1.977 (106.69)ab 2.807 (105.29)ab
647 3.817 (112.50)a 2.101 (113.38)a 2.949 (110.62)a
表中数据系采用具有波长校准功能的双光束分光光度计U-3010 (狭缝 2 nm)和 UV-4802 (固定狭缝 1.8 nm)平行测定的平均值, 重
复 3 次; 数字右侧的小写字母不同表示 5%水平上的显著性差异; 括号内的数据是以最大吸收波长下测得的叶绿素含量为基础计算的
百分比( % )。
波长偏差对叶绿素b含量测定的影响显著大于
叶绿素 a含量的测定, 因此相应地影响了Chl a/Chl
b的比值, 波长红移时引起Chl a/Chl b的值偏低, 波
长蓝移时引起Chl a/Chl b的值偏高, 当波长偏差达
到 2 nm时, 会导致Chl a/Chl b产生显著偏离(表 3)。
无论是玉米(Chl a/Chl b≈3.7)还是水稻(Chl a/Chl b
≈3), 叶绿素混合溶液在红光区的吸收光谱(图3)都
只呈现一个明显的吸收峰, 只是在短波方向的半峰
表 3 波长偏差对叶绿素 a与叶绿素 b相对比值的影响
植物
波长偏移 /nm
-2 -1 0 +1 +2
水稻 3.42a 3.27ab 3.08bc 2.87cd 2.63d
玉米 4.10a 3.91ab 3.67bc 3.41cd 3.12d
吉祥草 2.33a 2.23ab 2.12bc 1.99cd 1.84d
表中波长偏移以叶绿素 a和叶绿素 b的最大吸收波长为基础
表示, “-”和 “+”分别表示短波方向和长波方向的偏离; 数字右侧
的小写字母表示 5 % 水平上的显著性差异。
宽明显增加; 即使是对于Chl a/Chl b接近 2的喜荫
植物吉祥草而言, 叶绿素 b在红光区的吸收也只出
现一个不很明显的肩峰(图 3曲线 3)。除了叶片中
叶绿素 b的含量相对较低外, 其他原因就是叶绿素
b在红光区的摩尔吸光系数明显小于叶绿素a且两
者的吸收峰之间相互重叠。因此, 从叶绿素混合溶
图 3 混合叶绿素溶液在红光区的吸收光谱
1: 玉米; 2 : 水稻; 3 : 吉祥草。
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液来说, 在波长 “蓝移 ”的情况下会导致 Chl a/Chl
b偏高, 当波长 “红移 ”时则引起Chl a/Chl b偏低。
表 4是不同类型的分光光度计对不同植物叶
绿素含量及其比值测定的结果。从表 4可见, 具有
波长自动校准功能的双光束分光光度计对叶绿素含
量及其 Chl a/Chl b比值的测定结果之间具有较好
的可比性; 而波长精度为±2 nm的单光束分光光度
计测定的数据之间有较大甚至显著的差异, 缺乏可
比性, 并且导致 Chl a/Chl b与其相应的 “理论值 ”
之间出现较大出入。
表 4 不同仪器测定的不同植物的叶绿素含量及其比值
仪器 狭缝宽度 ± 水稻 棉花 玉米 吉祥草
类型 波长精度 /
nm
Chl a Chl b Chl a/ Chl a Chl b Chl a/ Chl a Chl b Chl a/ Chl a Chl b Chl a/
Chl b Chl b Chl b Chl b
双光束 1.8±0.5 3.168b 1.044b 2.98c 1.529a 0.458b 3.34c 1.786b 0.491bc 3.65b 1.683a 0.809ab 2.08bc
2±0.3 3.327b 1.073b 3.10bc 1.604a 0.502ab 3.20cd 1.868ab 0.508ab 3.68b 1.766a 0.871a 2.03bc
单光束 2±2 3.938a 0.646c 6.09a 1.624a 0.348d 4.67a 2.015a 0.471c 4.27a 1.821a 0.639c 2.85a
4±2 3.120b 1.121a 2.78bc 1.497a 0.512a 2.92d 1.753b 0.556a 3.19c 1.664a 0.881a 1.89c
6±2 3.178b 0.956b 3.32b 1.523a 0.409c 3.73b 1.776b 0.468c 3.83b 1.703a 0.761b 2.24b
表中叶绿素 a (Chl a)和叶绿素 b (Chl b)的单位为mg·g-1 (FW); 数字右侧的小写字母不同表示 5%水平上的显著性差异。
讨 论
叶绿素的含量变化与植物生长发育状况以及
环境变化密切相关, 因此在研究中涉及叶绿素含量
及其比值测定的报道或综述文献很多, 由于试验材
料的差异以及实验中使用的分光光度计的性能不
同, 导致实际研究过程中测得的叶绿素含量等结果
之间存在很大差异, 特别是Chl a/Chl b的相对比值
差异更大。对于Chl a/Chl b理论值≈ 3的C3植物,
已有报道的测定值低的甚至小于 1 (牟晓玲 2004),
高的则远大于 3 (杨善元 1983; 刘秀丽等 1999), 本
实验中也同样出现水稻和棉花 Chl a/Chl b的测定
值分别大于 6、大于 4的情况(表 4), 以致测定数
据之间不具相互可比性。
无论是C3植物(水稻)还是C4植物(玉米), 使用
具有波长自动校准功能、波长精度较高的双光束
分光光度计时, 实际测得的Chl a/Chl b的相对比值
不仅与相应的理论值接近, 且叶绿素定量结果之间
也有较好的可比性和重现性。本文的研究结果表
明, 使用波长精度和波长重现性相对较差的单光束
分光光度计测定叶绿素含量及其比值时, 其结果之
间缺乏可比性(表 4), 同时 Chl a/Chl b相对比值也
与相应的 “理论比值 ”存在较大偏差。分光光度法
定量测定叶绿素时, 通常根据混合溶液中叶绿素 a
和叶绿素b在红光区最大吸收波长处的吸光度值、
按 Arnon公式计算出叶绿素含量。虽有报道称
Arnon公式也会引起测定结果的偏差(段光明1992;
唐银凤 1996), 但这种方法上的系统误差不至于引
起Chl a/Chl b相对比值严重偏离其 “理论值 ”的问
题。除了波长精度和杂散光之外, 分光光度计的实
际透光率也会显著影响定量结果。
因此, 选用波长精度高、波长重现性好、具
有波长校准和定位功能的分光光度计进行叶绿素定
量测定, 是保证研究结果之间具有可比性的前提。
参考文献
段光明(1992). 叶绿素含量测定中 Arnon公式的推导. 植物生理
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果秀敏, 翟彤宇, 牛延锋(2000). 薄层色谱法分离菠菜叶片中色
素的研究. 河北农业大学学报, 23 (2): 101~104
彭光华, 李忠, 张声华(1998). 薄层色谱法分离鉴定枸杞子中的
类胡萝卜素. 营养学报, 20 (1): 76~78
刘秀丽, 宋平, 孙成明(1999). 植物叶绿素测定方法的再探讨. 江
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苏正淑, 张宪政(1989). 几种测定植物叶绿素含量的方法比较. 植
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唐银凤(1996). 叶绿素含量测定中Arnon公式的系数误差对结果
的影响. 江苏农业科学, (3): 26~27
王学奎(2006). 植物生理生化实验原理和技术(第 2版). 北京: 高
等教育出版社, 134~136
杨善元(1983). 关于叶绿素含量及 a:b值等若干问题. 植物生理学
通讯, (4): 61~62