全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (2): 177–186　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0549 177
收稿 2015-10-16　　修定 2016-01-06
资助 国家自然科学基金(31360094、31470464和31160088)。
* 通讯作者(E-mail: yangyingli2006@sohu.com)。
盐胁迫下黄花补血草幼苗ROS代谢酶活性的变化
马婷, 滕玉瑾, 李翠祥, 杨颖丽*
西北师范大学生命科学学院, 兰州730070
摘要: 用不同浓度NaCl (0、25、50、100和150 mmol·L-1)处理盐生植物黄花补血草(Limonium aureum)幼苗, 探究幼苗叶片
中抗氧化酶和多胺氧化酶活性等生理指标变化与其耐盐性的关系。研究表明: 黄花补血草幼苗叶片中羟自由基(·OH)含量
仅在150 mmol·L-1NaCl处理下明显增加, 而其他盐浓度均导致该指标降低; 不同的是, 高浓度NaCl (100和150 mmol·L-1)处理
下过氧化氢(H2O2)含量显著增加; 所有盐浓度均诱导幼苗叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过
氧化物酶(APX)、二胺氧化酶(DAO)和多胺氧化酶(PAO)活性增强; 盐胁迫使细胞壁结合态POD活性降低; 此外, 幼苗叶片
中的过氧化氢酶(CAT)活性在低盐胁迫下增强, 高盐胁迫下受到抑制。以上结果说明黄花补血草幼苗可响应盐胁迫, 使幼
苗叶片中抗氧化酶和多胺代谢酶活性增强, 且高盐诱导叶片中H2O2和·OH增加, 这可能与幼苗对盐环境的适应有关。
关键词: 黄花补血草; 盐胁迫; 活性氧; 抗氧化酶
土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的一
个重要因素。有研究报导, 土壤中的致害盐类以
中性盐NaCl为主(郭慧娟等2012)。活性氧(ROS)的
积累是植物对盐胁迫的主要反应之一。过量的
ROS会破坏生物大分子 , 对细胞产生毒害效应
(Halliwell等1987)。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧
化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧
化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶等构成了植物体
内抵御和清除ROS的主要酶促清除系统。其中,
SOD通过将超氧阴离子(O2¯· )歧化为过氧化氢(H2O2)
来保护植物免受氧化伤害(Zeng等2010); CAT可直
接诱导H2O2分解为H2O和O2, 在ROS解毒过程中必
不可少(刘零怡等2009); POD可以催化酚类物质和
抗氧化物质的氧化来分解H2O2 (刘零怡等2009);
APX作为植物体内清除H2O2的重要抗氧化酶之一,
利用抗坏血酸做为电子供体来清除H2O2 (马进等
2015)。已有的研究表明, 提高植物体内抗氧化酶
活性及增强抗氧化酶代谢水平是增强植物耐盐性
的途径之一(李彦等2008)。除了抗氧化酶, 还有其
他酶类也涉及植物体内ROS水平的调节, 例如, 细
胞壁结合态POD以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)
为电子供体介导H2O2的产生(Lin和Kao 2002), 二胺
氧化酶(DAO)和多胺氧化酶(PAO)被认为通过多胺
代谢参与植物细胞间H2O2的产生过程(Cvikrová等
2012; Talaat和Shawky 2012)。然而, 有关盐胁迫影
响这3种酶活性进而参与植物体内ROS水平调控的
研究报道很少。
我国西北六省(自治区)盐渍化土地占全国盐
渍化土地面积的69.03% (田长彦等2000), 蕴涵着极
为丰富且种类繁多的盐生植物资源, 为研究植物
的抗盐性提供了很好的材料。黄花补血草是白花
丹科(Plumbaginaceae)补血草属多年生泌盐草本植
物(中国科学院中国植物志编辑委员会1987), 广泛
分布于我国西北地区、东北西部以及华北北部,
可以防风固沙、改善局部环境, 对改良盐碱土壤
具有重要的生态作用。近年来, 有关黄花补血草
的研究越来越受到重视。周幸文等(2013)在对黄
花补血草化学成分进行研究的同时注重生物碱成
分的提取。倪细炉等(2012)利用扫描电镜和石蜡
切片法观察了黄花补血草叶片营养器官中盐腺的
分布、密度、结构及发育过程。我们在近期的研
究中发现, 黄花补血草幼苗对低浓度的盐具有一
定的耐受性, 但高浓度盐对根、叶造成明显氧化
损伤, 从而抑制幼苗的生长(尤佳等2013)。然而,
到目前为止, 有关黄花补血草对盐环境的适应机
理和盐胁迫对该植物的毒害机理仍不清楚。本试
验以室内培养的黄花补血草为材料, 主要开展不
同浓度NaCl处理下幼苗叶片抗氧化酶活性胶染色
及细胞壁POD、DAO和PAO活性检测, 以期从生
理生化的角度研究揭示其耐盐机理。
材料与方法
1 材料培养
荒漠植物黄花补血草[Limonium aureum (L.)
植物生理学报178
Hill.]种子由甘肃省民勤县沙生植物园提供。籽粒
饱满的种子用10%的次氯酸钠溶液浸泡10 min后,
无菌水连续冲洗3次, 75%的乙醇浸泡30 s, 再用无
菌水冲洗5~7次。将种子接种于1/4 Hoagland固体
培养基上萌发4 d后, 挑选生长状况一致的幼苗分
别转入含0、25、50、100和150 mmol·L-1 NaCl的
1/4 Hoagland固体培养基, 置于恒温光照培养箱中,
昼夜温度(25±2)°C, 光暗周期12 h/12 h, 光照强度
300 μmol·m-2·s-1。处理3周后取叶片进行相应指标
的检测。
2 测定方法
2.1 酶液提取
取0.5 g叶片加入0.8 mL预冷的含1%聚乙烯吡
咯烷酮、1 mmol·L-1乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的
50 mmol·L-1磷酸缓冲液(PBS, pH 7.8)中, 冰浴研磨,
20 000×g离心20 min, 取上清液备用。以上操作均
在4°C进行。
2.2 可溶性蛋白SDS-PAGE
蛋白含量的检测采用Bradford (1976)的方法,
用考马斯亮蓝G-250作显色剂, 在波长595 nm处用
分光光度计测定OD值。
采用4%浓缩胶与10%分离胶制备凝胶板。取
等量可溶性蛋白加入等体积的样品缓冲液[0.5
mol·L-1 Tris-HCl, pH 6.8, 10%十二烷基硫酸钠
(SDS), 20%甘油, 10% β-巯基乙醇和0.04%溴酚蓝],
沸水浴3 min, 瞬间离心, 冷却后上样20 µL。电泳
开始时稳压80 V, 样品进入分离胶后稳压120 V。
停止电泳后, 将胶板浸于考马斯亮蓝染色液中染
色30 min, 倾去染色液, 加脱色液脱色至谱带清晰,
置于凝胶成像仪内照相分析。
2.3 二氨基联苯胺(DAB)染色检测H2O2的产生
依据Thordal-Christensen等(1997)的方法, 利用
DAB染色法检测黄花补血草幼苗叶片H2O2含量变
化。将叶片浸入DAB染色液, 黑暗抽真空3次, 每次
5 min, 使染色液渗透18 h, 然后转移至70°C预热的
90%乙醇溶液中直至叶片叶绿素完全被破坏, 而后
静止2~4 h, 移至70%甘油溶液中保存或拍照。
2.4 羟自由基(·OH)含量测定
·OH的测定参照Halliwell等(1987)的方法, 0.5
g叶片加入5 mL含2 mmol·L-1 2-脱氧-D-核糖的10
mmol·L-1 PBS (pH 7.4)中冰浴研磨, 12 000×g离心
15 min, 吸取200 μL上清液加入3 mL含0.5%硫代巴
比妥酸的2.5 mmol·L-1NaOH溶液和1 mL冰乙酸, 分
别经100°C水浴30 min和4°C冰浴10 min后, 于532
nm处测定吸光值, 单位为nmol·g-1 (FW)。
2.5 活性胶电泳及染色
活性胶制备参照Laemmli (1970)的方法, 采用
4%浓缩胶, SOD和APX采用10%分离胶, CAT和
POD采用7.5%分离胶, 电泳均在4°C进行, 电泳条
件同上。
SOD活性染色根据Beauchamp和Friclorich
(1971)的方法, 先将胶浸在含0.24 mmol·L-1氯化硝
基四氮唑蓝 (NBT)和28 µmol·L -1核黄素的50
mmol·L-1 PBS (pH 7.8)中, 黑暗中放置20 min后, 在
含有28 mmol·L-1四甲基乙二胺(TEMED)的50
mmol·L-1 PBS (pH 7.8)中, 强光下显色。
POD活性染色采用醋酸联苯胺染色法(何忠
效和张树政1999)。用蒸馏水漂洗后, 将凝胶移入
染液(A液: 0.4 g联苯胺中加入3 mL冰醋酸, 80°C溶
解后加入17 mL蒸馏水; B液: 4% NH3Cl; C液: 5%
EDTA; D液: 3% H2O2; A、B、C、D和蒸馏水以体
积比1:1:1:1:9混匀)中, 37°C恒温水浴5~10 min, 待
酶带清晰后用蒸馏水冲洗30 min。
CAT活性染色参照Chandlee和Scandalios等
(1984)的方法, 先将胶浸在含有0.01% (V/V) H2O2的
重蒸水中10 min, 然后蒸馏水中漂洗2次, 移入含有
1%的三氯化铁和1%的铁氰化钾溶液中显色, 待酶
带呈无色透明后立即停止反应。
APX活性染色依据Lee和Lee (2000)的方法,
将凝胶浸入含2 mmol·L-1抗坏血酸的50 mmol·L-1
PBS (pH 7.0)中30 min (每10 min更换一次溶液), 随
后将凝胶浸于含4 mmol·L-1抗坏血酸和2 mmol·L-1
H2O2的50 mmol·L
-1 PBS (pH 7.0)中20 min, 最后将
凝胶置于含28 mmol·L-1 TEMED和2.4 mmol·L-1
NBT的50 mmol·L-1 PBS (pH 7.8)中显色, 待酶带清
晰后, 用蒸馏水漂洗终止反应。
2.6 细胞壁结合态POD活性测定
细胞壁的提取参照Lee和Lin (1995)的方法, 取
0.5 g黄花补血草幼苗叶片, 加入2 mL 50 mmol·L-1
PBS (pH 5.8)提取液冰浴研磨, 1 000×g离心10 min,
用提取液洗涤沉淀2~3次, 倾去上清, 加入2 mL 1
mol·L-1 NaCl溶液后30°C摇床孵育2 h, 1 000×g离心
马婷等: 盐胁迫下黄花补血草幼苗ROS代谢酶活性的变化 179
10 min后, 取上清并依照Dos Santos (2008)的方法
测定细胞壁结合态POD的活性, 100 μL上清液加入
2.9 mL含7.2 mmol·L-1愈创木酚的50 mmol·L-1 PBS
(pH 5.8), 以11.8 mmol·L-1 H2O2启动反应, 470 nm处
扫描2 min。
2.7 DAO和PAO活性测定
DAO活性测定参照Naik等(1981)的方法。1 g
叶片用含20 mmol·L-1愈创木酚的50 mmol·L-1 PBS
(pH 7.0)提取, 16 000×g离心20 min. 取酶液加入含
10 mmol·L-1腐胺和0.1 mmol·L-1磷酸吡哆醛的50
mmol·L-1 PBS (pH 7.8), 30°C孵育1 h, 以1 mL 20%
三氯乙酸启动反应 , 30 min后, 5 000×g离心15
min。吸取上清液加入1 mL茚三酮复合物(250 mg
茚三酮溶于6 mL乙酸和4 mL磷酸), 100°C水浴30
min后加入1 mL冰乙酸, 测定510 nm处吸光值。
参照Asthir等(2002)的方法检测PAO的活性。
1 g叶片中加入2 mL含5 mmol·L-1二硫苏糖醇的100
mmol·L-1 PBS (pH 7.0)冰浴研磨, 16 000×g离心20
min。倾去上清液, 以含1 mmol·L-1 NaCl的100
mmol·L-1 PBS (pH 7.0)洗涤沉淀后, 16 000×g离心
20 min, 取450 μL酶液中加入反应液(50 U CAT和
0.1% 2-氨基苯甲醛), 以250 μL10 mmol·L-1亚精氨
启动反应, 30°C孵育3 h后, 加入1 mL 10%高氯酸终
止反应, 6 500×g离心10 min, 取上清于430 nm处测
定吸光值。
以上所有的酶活性均以U·mg-1 (蛋白)为单位。
3 数据分析
各组处理和对照均设置3个重复, 每样均重复
测定3次, 取平均值, 数据以x
__
±s表示, 采用SPSS
17.0进行统计分析, 并用Duncan检验法对差异显著
性(P<0.05)进行多重比较。Origin 7.5软件作图,
Adobe Photoshop CS4软件对图片进行处理。
采用BIO-RAD Mini-PROTEAN Tetra Cell伯
乐小型垂直电泳槽164-8001进行凝胶电泳, BIO-RAD
GelDoc 2000凝胶成像系统和BIO-RAD Quantity
One软件进行凝胶图像采集、分析和处理。
实验结果
1 盐胁迫对黄花补血草幼苗叶片可溶性蛋白的影
响
如图1所示, 将黄花补血草幼苗叶片可溶性蛋
白进行SDS-PAGE, 可分辨出21~22条区带, 根据其
相对迁移率(Rf)可划分为3个区。I区包括3条蛋白
带(a、b和c): a谱带宽且染色深, 在NaCl处理下没
有发生明显的变化; b带宽但染色相对较浅, 在100
mmol·L-1 NaCl处理时, 谱带弱于其他处理组; c带
染色较深, 其中50和100 mmol·L-1 NaCl胁迫下谱带
弱于0、25和150 mmol·L-1 NaCl处理组。II区包括
9条带, 其中d、e、f、g、h、i、j和k均为比较窄、
染色较浅的蛋白带, 而f和j带染色稍深于其余6条
带; h带在100、150 mmol·L-1 NaCl胁迫下和i带在
150 mmol·L-1 NaCl胁迫下, 染色均比对照组和低浓
度处理组深; k谱带在对照组中没有观察到, 但在
25、50、100和150 mmol·L-1 NaCl处理时, k带出
现, 并可清楚识别; 另外, l谱带为所有条带中最宽
且染色最深的蛋白带, 此带中50 mmol·L-1 NaCl处
理时的条带明显窄于其他处理组。III区包括9条
带(m、n、o、p、q、r、s、t和u), 均为条带窄且染
色较浅的蛋白带; p谱带在25 mmol·L-1 NaCl处理时
染色深于其他4组; q、r和u带在25和50 mmol·L-1
N a C l处理下染色均浅于对照组、 1 0 0和 1 5 0
mmol·L-1 NaCl处理组; 另外, s和t带在对照组出现,
25和50 mmol·L-1 NaCl处理下消失, 在100和150
mmol·L-1 NaCl处理时又可观察到微弱的条带。
图1 黄花补血草幼苗叶片可溶性蛋白的SDS-PAGE图
Fig.1 SDS-PAGE map of soluble proteins of L. aureum
seedling leaves
图中0、25、50、100和150均为NaCl处理浓度(mmol·L-1), Rf
为相对迁移率。
植物生理学报180
2 盐胁迫对黄花补血草幼苗叶片H2O2和·OH含量
的影响
由于细胞颗粒中的过氧化酶能将H2O2中的氧
释放出来, 进而氧化DAB形成金黄色沉淀并定位
于过氧化酶活性的部位。因此, 可通过DAB染色
沉淀颜色的深浅和数量反映H2O2的多少(王东平
2007)。如图2所示, 25和50 mmol·L-1 NaCl处理下
幼苗叶片H2O2含量相比于对照组略有增加, 而100
和150 mmol·L-1 NaCl处理时, 叶片中的H2O2含量显
著增加。
图2 DAB染色检测不同浓度NaCl诱导的黄花补血草幼苗叶片H2O2的产生
Fig.2 H2O2 production estimated by DAB staining in leaves of L. aureum seedlings exposed to different NaCl concentrations
A、B、C、D和E分别为经0、25、50、100和150 mmol·L-1 NaCl处理的叶片。
·OH是一种活性最强的活性氧, 对植物细胞的
生命活动极为有害, 可直接引发脂质过氧化, 严重
时导致植物细胞死亡(杨淑慎和高俊凤2001)。与
对照组相比, 25、50和100 mmol·L-1 NaCl处理的幼
苗, 叶片中·OH含量分别降低约39%、58%和64%,
而150 mmol·L-1 NaCl处理诱导叶片·OH含量显著
升高, 且高于对照组约19% (图3)。这些结果表明,
低浓度的NaCl胁迫下黄花补血草幼苗叶片·OH含
量减少, 而高浓度NaCl胁迫下·OH的含量增加。
3 盐胁迫对黄花补血草幼苗叶片抗氧化酶的影响
由图4-A可以看出, 黄花补血草幼苗叶片SOD
同工酶有2条主酶带SOD1和SOD2。与对照组比
较, 25、50、100和150 mmol·L-1 NaCl胁迫下SOD1
和SOD2同工酶酶带颜色逐渐变亮, 酶带变宽, 增
强的幅度随着NaCl浓度的增加而增大, 其中100和
150 mmol·L-1 NaCl处理下的酶带显色最深。说明
黄花补血草幼苗叶片的SOD活性随着NaCl浓度的
增大而逐渐增强。
黄花补血草幼苗叶片POD有2条主酶带(图
4-B), 不同浓度盐胁迫使POD酶带呈现先增强后减
弱的变化趋势。与对照相比, 25和50 mmol·L-1
NaCl胁迫下, POD1和POD2酶带变宽, 染色加深, 2
条POD酶带在100和150 mmol·L-1 NaCl处理组相比
较于25和50 mmol·L-1 NaCl处理组酶带明显减弱,
图3 不同浓度NaCl诱导黄花补血草幼苗叶片·OH含量的变化
Fig.3 Changes of ·OH content induced by different NaCl
concentrations in the leaves of L. aureum seedlings
各柱形上用不同小写字母标识表示数据间差异显著(P<0.05)。
但POD1酶带仍强于对照组。说明NaCl作用诱导
黄花补血草幼苗叶片POD的活性增强, 且低浓度
NaCl的诱导效应更强。
从图4-C可以看出, 黄花补血草幼苗叶片CAT
仅1条酶带, 且NaCl胁迫诱导酶带亮度呈现出先增
强后减弱的趋势。与对照相比较, 25和50 mmol·L-1
NaCl处理时, CAT酶带亮度增强, 酶带变宽, 而在
马婷等: 盐胁迫下黄花补血草幼苗ROS代谢酶活性的变化 181
强并强于对照组。APX2酶带呈现出随处理NaCl
浓度的升高而逐渐增强的变化趋势。此外, 与对
照组比较, NaCl处理下的APX3酶带均有不同程度
增强, 在25和100 mmol·L-1 NaCl处理时染色较浅,
而在50和150 mmol·L-1 NaCl处理时酶带显著变
亮。这些结果说明随着盐浓度的升高, 黄花补血
草幼苗叶片APX的活性总体呈现增强的趋势。
4 盐胁迫对黄花补血草幼苗叶片细胞壁结合态
POD、DAO和PAO活性的影响
从表1可以看出, 随着NaCl浓度的升高, 黄花
补血草幼苗叶片细胞壁结合态POD活性与对照
相比呈现降低的变化趋势, 且差异显著。25和50
mmol·L-1 NaCl处理的幼苗叶片中, 细胞壁结合态
POD活性相比于对照组分别降低约40%和37%, 但
二者之间差异不显著; 而100和150 mmol·L-1 NaCl胁
迫诱导细胞壁结合态POD活性显著降低, 分别低
于对照组约77%和82%, 且降低的幅度明显大于25
和50 mmol·L-1 NaCl处理组。
黄花补血草幼苗叶片DAO活性随盐浓度增加
呈缓慢上升趋势(表1)。与对照组相比, 25、50、
100和150 mmol·L-1 NaCl处理的幼苗叶片DAO活
性分别增加约18%、43%、83%和114%, 差异均达
到显著水平。PAO的活性在盐胁迫下不断增强, 其
中25 mmol·L-1 NaCl胁迫对幼苗叶片PAO的活性没
有明显影响, 而50、100和150 mmol·L-1 NaCl胁迫
下PAO活性显著高于对照组, 分别增加为对照的
2.27、3.64和7.25倍(表1)。
讨　　论
在盐或干旱胁迫条件下, 可溶性蛋白作为植
物中的有机渗透保护物质之一, 有助于适当保持
植物的渗透势, 同时可以稳定和保护生物大分子
图4 黄花补血草幼苗叶片抗氧化酶活性电泳图
Fig.4 Electrophoretic maps of antioxidant enzyme activities
of L. aureum seedling leaves
A、B、C和D分别为SOD、POD、CAT和APX电泳检测; 0、
25、50、100和150均为NaCl处理浓度(mmol·L-1)。
100和150 mmol·L-1 NaCl胁迫下, 酶带亮度减弱, 且
在150 mmol·L-1 NaCl处理时酶带亮度低于对照
组。说明低浓度的NaCl增强了CAT的活性, 高浓
度的NaCl对CAT活性产生抑制作用。
黄花补血草幼苗叶片的APX共有3条酶带
APX1、APX2和APX3 (图4-D)。25和50 mmol·L-1
NaCl胁迫下APX1酶带亮度与对照组比无明显变
化, 而100和150 mmol·L-1 NaCl处理时酶带亮度增
表1 不同浓度NaCl对黄花补血草幼苗叶片细胞壁结合态POD、DAO和PAO活性的影响
Table 1 Effects of different NaCl concentrations on cell wall–bound POD, DAO and PAO activities in L. aureum seedling leaves
NaCl浓度/mmol·L-1 细胞壁结合态POD活性/U·mg-1 (蛋白) DAO活性/U·mg-1 (蛋白) PAO活性/U·mg-1 (蛋白)
0 41.74±1.32a 1.27±0.05e 0.77±0.05d
25 25.24±1.50b 1.50±0.03d 0.52±0.42d
50 26.18±1.83b 1.82±0.30c 1.75±0.14c
100 9.51±0.17c 2.33±0.06b 2.80±0.05b
150 7.58±0.40c 2.72±0.20a 5.58±0.31a
　　表中数据分别为3次重复的x
__
±s, 同列数据间用不同小写字母标识表示差异显著(P<0.05)。
植物生理学报182
的结构和功能(田晓艳等2008)。高浓度的可溶性
蛋白可以使细胞维持较低的渗透势, 帮助植物抵
抗胁迫环境带来的伤害(中国科学院上海植物生理
研究所和上海市植物生理学会1999)。有研究者认
为, 植物在逆境条件下体内某些正常蛋白合成往
往受到抑制,同时诱导出一些新的蛋白或使原有蛋
白含量明显增加(杜长霞2007)。毛桂莲和许兴
(2005)的研究表明, NaCl胁迫下枸杞(Lycium barba-
rum L.)愈伤组织可溶性蛋白含量增加,且诱导产生
了新蛋白。我们在实验中发现, 25和50 mmol·L-1
NaCl胁迫下Rf为0.22、0.18、0.15、0.12和0.09的
可溶性蛋白含量减少, 而100和150 mmol·L-1 NaCl
胁迫诱导Rf为0.82、0.53、0.50、0.40、0.22、
0.18、0.15、0.12和0.09的可溶性蛋白含量明显增
加; 此外, 所有浓度的盐胁迫均诱导产生了Rf为
0.45的新蛋白。这些结果表明, 盐胁迫下黄花补血
草幼苗叶片通过增加某些可溶性蛋白含量来维持
渗透平衡, 这也可能是幼苗能够在盐环境中生存
的原因之一。
在正常生长环境条件下, 植物细胞内活性氧
的产生与清除总是处于动态平衡状态。但当植物
受到逆境胁迫时, 这种动态平衡遭到破坏, 活性氧
大量积累, 对植物造成伤害(王群等2004)。活性氧
H2O2和·OH可直接启动膜脂过氧化反应, 使细胞质
膜的结构、功能紊乱 , 严重时甚至导致细胞死
亡。Rejeb等(2015)的研究表明, 短期的NaCl处理
诱导拟南芥(Arabidposis thaliana)叶片中H2O2浓度
瞬时升高。我们在以前的研究中也发现, NaCl处
理诱导黄花补血草(Limonium aureum)幼苗叶片
O2¯·产生速率增大(尤佳等2013)。过量的H2O2和
O2¯·不仅本身对植物有毒害作用, 更重要的是它们
可通过Fenton和Haber-Weiss反应转化为破坏性极
强的·OH, 启动膜脂过氧化(王凤德等2011)。本实
验中, 低浓度盐胁迫诱导黄花补血草叶片·OH含量
下降, 而高浓度NaCl诱导幼苗叶片H2O2和·OH含量
显著增加。因此, 高浓度盐处理的幼苗叶片中过
量的H2O2和·OH产生会加剧膜脂过氧化反应。这
可能是高盐对黄花补血草幼苗叶片产生氧化胁迫,
进而抑制幼苗生长的原因之一(尤佳等2012)。
植物体内酶促清除系统SOD、POD、CAT和
APX等在活性氧的清除方面起着尤为重要的作
用。各种抗氧化酶的协同作用在维持活性氧代谢
的平衡、保护膜结构、抵御和修复逆境对细胞的
伤害方面发挥着重要作用, 但它们的活性变化可
能因胁迫程度和物种的不同而存在差异(王群等
2004)。此外, 不同植物中抗氧化酶同工酶的数量
是有差别的, 它们既相互依赖, 又各自独立共同维
持植物体内ROS代谢的平衡。例如, 构树(Brous-
sonetia papyrifera)叶片中SOD同工酶显示4条酶带,
且各酶带在盐胁迫下并未出现明显的变化; POD
有3种同工酶带, POD1和POD3酶带在低浓度NaCl
处理下消失, 在高浓度NaCl处理下出现且活性显
著增强(Zhang等2013)。不同的是, 石头花属植物
(Gypsophila oblanceolata Bark.)的叶片SOD被区分
出8种同工酶, 金盏菊(Calendula officinalis)叶片
POD同工酶谱有6条带 , 且这2种植物中SOD和
POD的活性均随NaCl浓度的升高呈先增强后减弱
的变化趋势(刘爱荣等2011; Sekmen等2012)。在我
们的研究中, 黄花补血草幼苗叶片SOD只有2条同
工酶带, 同工酶随NaCl浓度的升高而显著增强, 其
中SOD1同工酶的变化更加显著; POD有2条酶带,
酶活性在低浓度NaCl处理时升高, 高浓度NaCl处
理时活性降低, 但总高于对照。增强的SOD活性
赋予了黄花补血草幼苗较强的O2¯·清除能力, POD
活性的增强有利于及时清除SOD在歧化反应中产
生的H2O2, 维持活性氧代谢的平衡, 由此减缓NaCl
胁迫对植物细胞的伤害。庞彩虹(2004)利用电泳
鉴定发现, 盐地碱蓬(Suaeda salsa)叶片CAT同工酶
有3条酶带, NaCl处理下同工酶数量没有发生改变,
但CAT1同工酶活性随NaCl浓度的增加而增强, 导
致了盐地碱蓬叶片总体CAT活性的增强。Ferreira-
Silva等(2011)的研究中, 腰果(Anacardium occiden-
tale)叶片CAT仅有1条酶带, NaCl胁迫诱导CAT活
性显著增强, 相比较200 mmol·L-1 NaCl处理诱导
CAT活性降低但仍高于对照。与Ferreira-Silva等人
的研究结果相似, 黄花补血草幼苗叶片CAT酶也只
有1条酶带(图4-C), 其活性在低浓度盐胁迫下增强,
高浓度盐胁迫下受到抑制。在逆境条件下, 由于
APX作为参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环清除H2O2的
关键酶, 其活性也标志着H2O2清除能力, 对于保护
叶绿体和其他细胞组分免受H 2O 2及其所产生
的·OH的破坏是必不可少的(段明2012; 赵宝龙等
马婷等: 盐胁迫下黄花补血草幼苗ROS代谢酶活性的变化 183
2015)。在Puyang等(2015)的研究中, 2种早熟禾
(Poa pratensis L.)的APX均有2条同工酶带, 盐胁迫
诱导了2种同工酶活性的增强。在黄花补血草幼苗
叶片中, APX经电泳和活性胶染色后显示出3条同
工酶带, APX1同工酶的活性在100和150 mmol·L-1
NaCl处理时增强, 而APX2和APX3同工酶的活性
均随着盐处理浓度的升高而增强。这些导致了黄
花补血草幼苗叶片中APX的活性总体增强, 可能
是由于该植物在应答盐胁迫时做出应激反应, 启
动了自身保护机制, 提高了幼苗对H2O2的清除能
力。总之, 一定浓度的盐胁迫诱导黄花补血草幼
苗叶片中抗氧化酶活性增强, 提高了ROS的清除
力, 从而缓解了盐胁迫对植物造成的氧化损伤。
除了抗氧化酶系统 , 细胞壁结合态POD、
DAO和PAO也参与植物体内活性氧水平的调节。
文献报道, 细胞壁结合态POD通过NADH的氧化来
产生H2O2 (Lin和Kao 2002)。Wen等(2012)在研究
中发现, 不同浓度的盐胁迫诱导植物H2O2含量的
增加与细胞壁结合态POD活性的增强相关联。与
这些研究结果不同, 黄花补血草幼苗叶片细胞壁
结合态POD的活性在盐胁迫下显著降低, 此效应
在高浓度NaCl (100和150 mmol·L-1)胁迫下表现得
更强。这表明黄花补血草幼苗叶片中细胞壁结合
态POD可能不参与盐诱导的H2O2的积累。多胺类
物质对稳定细胞膜、核酸及蛋白质等大分子物质
的构象有重要的作用, 在植物抵抗生物与非生物
逆境中必不可少(Drolet等1986)。文献报道, 植物
体内DAO在多胺代谢中能氧化腐胺产生H2O2,
PAO通过催化亚精胺和精胺转变为H2O2 (Fan等
2013)。它们通过调节细胞内多胺的水平和生成物
的浓度来参与植物体对多种逆境胁迫的反应和生
长发育过程(Santa-Cruz等1997)。徐呈祥等(2013)
报道, 盐胁迫刺激枣树(Ziziphus jujuba Mill.)叶片
内DAO和PAO活性显著增强。Dai等(2014)也发现,
盐胁迫诱导植物DAO活性的增强。与这些研究结
果相似, 盐胁迫诱导黄花补血草幼苗叶片DAO和
PAO的活性增强, 且增强幅度随胁迫程度加重而增
大。更为重要的是, 植物应对非生物胁迫的H2O2
产生与DAO活性增强有关(Tisi等2008), 在非生物
胁迫下转基因烟草中PAO的过量表达也诱导产生
了高浓度的H2O2 (Moschou等2008)。因此, 盐胁迫
诱导黄花补血草幼苗叶片中DAO和PAO活性的增
强可能与盐诱导的H2O2产生的增加相关。这些结
果也表明, 盐处理下黄花补血草幼苗体内多胺代
谢可能是活跃的。然而, 黄花补血草是否通过多
胺的调节作用来缓解胁迫造成的伤害, 有待于进
一步研究。
综上所述, 盐胁迫诱导黄花补血草幼苗叶片中
H2O2和·OH等积累, 启动了活性氧清除机制, 增强
了SOD、POD、CAT和APX的活性以清除过量产
生的活性氧, 防止氧化胁迫对幼苗造成的过度损
害。此外, NaCl胁迫诱导DAO和PAO活性的增强可
能与黄花补血草幼苗叶片内H2O2的积累有关。
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Changes of ROS metabolizing enzyme activities in Limonium aureum seedlings
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MA Ting, TENG Yu-Jin, LI Cui-Xiang, YANG Ying-Li*
College of Life Sciences, Northwest Normal University. Lanzhou 730070, China
Abstract: Halophyte Limonium aureum seedlings treated with different NaCl concentrations (0, 25, 50, 100
and 150 mmol·L-1) were used to investigate the relationship between the changes of physiological indexes, such
as the activities of antioxidant enzymes and polyamine metabolizing enzymes, and salt tolerance. Except for in-
creased hydroxy radical (·OH) content due to 150 mmol·L-1 NaCl, different salinity concentrations resulted in
the reduction of this paraneter in the leaves. Differently, hydrogen peroxide (H2O2) content significantly rose in
response to 100 and 150 mmol·L-1 NaCl. Further study showed that all salinity concentrations stimulated super-
oxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), ascorbate peroxidase (APX), diamine oxidase (DAO) and polyam-
ine oxidase (PAO) activities, but inhibited cell wall-bound POD activity in the leaves of L. aureum seedling.
Additionally, catalase (CAT) activity rose due to low salinity concentrations but lowered to high NaCl concen-
trations in the leaves. Taken together, L. aureum seedlings could respond to salt stress and exhibited the increas-
es of the activities of antioxidant enzymes and polyamine metabolizing enzymes, and high salinity stimulated
H2O2 and ·OH generation, which might be associated with the adaptation of the seedlings to salt environment.
Key words: Limonium aureum; salinity stress; reactive oxygen species; antioxidant enzymes
Received 2015-10-16 Accepted 2016-01-06
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31360094, 31470464 and 31160088).
*Corresponding author (E-mail: yangyingli2006@sohu.com).