全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (9): 901~908 901
收稿 2012-06-11　　修定 2012-06-28
资助 海南省自然科学基金 (310072)、国家自然科学基金
(30960310)和中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业
务费专项(1630022011024和RC201204)。
* 通讯作者(E-mail: djli.rricatas@gmail.com; Tel: 0898-
23301174)。
利用巴西橡胶树寡核苷酸芯片筛选死皮相关基因
李德军1,*, 覃碧1, 邓治1, 刘向红1,2
1中国热带农业科学院橡胶研究所, 农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室, 海南儋州571737; 2海南大学农学院,
海口570228
摘要: 以健康和死皮巴西橡胶树品系热研7-33-97树皮为实验材料, 利用定制橡胶树寡核苷酸芯片筛选橡胶树死皮相关基
因。在橡胶树寡核苷酸芯片包含的566个基因中, 死皮与健康树树皮差异表达倍数在2倍或2倍以上的有56个, 占筛选转录
本总数的9.9%。在56个死皮相关基因中, 死皮树中上调表达基因有3个, 下调表达基因有53个。这些死皮相关基因共涉及8
个功能分类, “抗性及防御反应”所占比例最高, 接下来是“蛋白质合成、加工及转运”和“代谢和能量”, 以上三类功能基因占
66.07%。此外, 死皮相关基因还涉及“细胞结构、生长及分化”、“细胞信号转导”、“转录相关”、“橡胶生物合成”和“未知
功能”。为验证芯片结果的可信性, 随机选取18个基因进行RT-PCR分析, 结果表明被检测基因表达模式均与芯片结果完全
一致。本研究鉴定并分析了死皮相关基因, 为进一步揭示橡胶树死皮发生机制奠定了基础。
关键词: 巴西橡胶树; 树皮; 死皮分子机制; 死皮相关基因; 寡核苷酸芯片
Identifying the Genes Related to Tapping Panel Dryness by Hevea brasiliensis
Oligonucleotide Microarrays
LI De-Jun1,*, QIN Bi1, DENG Zhi1, LIU Xiang-Hong1,2
1Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture, Rubber Research Institute, Chinese
Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China; 2College of Agriculture, Hainan University, Haikou
570228, China
Abstract: With the barks of healthy and tapping panel dryness (TPD) rubber tree clone (RY7-33-97) as experi-
mental materials, the genes associated with TPD were identified by custom-designed oligonucleotide microar-
rays. Among 566 transcripts related to TPD of the oligonucleotide microarrays, 56 transcripts (about 9.9%) in-
dicated 2-fold or higher expression differences between healthy and TPD rubber trees. Compared with healthy
rubber tree, 3 and 53 genes were up- and down-regulated in TPD rubber tree, respectively. The TPD-related
genes identified in the study were involved in 8 functional classifications. Of them, “stress/defense response”
was the largest classification, followed by “protein synthesis, process and transport”, and “metabolism and energy”,
and these three classifications mentioned above represented 66.07%. In addition, the TPD-related genes were
associated with “cell structure, growth and development”, “cell signal transduction”, “transcription-related”,
“rubber biosynthesis”, and “unknown function”. To validate the microarray results, 18 genes randomly selected
were analyzed with RT-PCR. The results showed that the expression patterns of all the selected genes were con-
sistent with ones from microarray analyses. The genes related to TPD were identified by oligonucleotide mi-
croarrays, which laid foundations for elucidating the molecular mechanism underlying TPD in rubber tree.
Key words: Hevea brasiliensis; bark; molecular mechanism involved in tapping panel dryness (TPD); TPD-re-
lated genes; oligonucleotide microarrays
橡胶树死皮(tapping panel dryness, TPD)是天
然橡胶产业的一个世界性难题, 也是天然橡胶单
产提高的主要限制因子之一。一旦发生死皮, 橡
胶树将因停止排胶而减产。此外, 死皮树因停割
长势旺盛, 与健康树争夺阳光、养分和水分中处
于优势, 间接导致周围健康树产胶量持续下降。
目前, 我国死皮累计发生率在20%~40%之间, 严重
地区在40%以上, 给天然橡胶生产带来了严重的危
植物生理学报902
害。死皮是橡胶树“百年顽症”, 研究者曾从病理、
生理、遗传、土壤和生化等方面进行了探索与研
究, 但其发生机制仍不清楚。目前, 死皮被认为是
一种由伤害(割胶)和强乙烯刺激引起的、复杂的
生理综合症(范思伟和杨少琼1995)。近年来, 运用
分子生物学方法研究TPD发生机制取得了较大进
展, Chen等(2002)克隆了一个死皮抗性相关的转录
因子HbMyb1, 提出“橡胶树死皮是一种细胞程序性
死亡(programmed cell death, PCD)现象”的观点, 并
推测HbMyb1可能是PCD的负调控因子。Peng等
(2011)进一步研究表明: 与健康橡胶树相比, 死皮
橡胶树乳管细胞具有PCD的典型特征, 在烟草中过
表达HbMyb1可抑制逆境诱导的细胞死亡。Venka-
tachalam等(2007)采用抑制消减杂交法(suppression
subtractive hybridization, SSH)鉴定了134个TPD相
关基因 , 并对其在死皮发生中的作用进行了分
析。而后, Venkatachalam等(2009, 2010)又克隆了2
个TPD相关基因HbTOM20和HbTK, 推测HbTOM20
下调使蛋白输入线粒体的速率下降, 引起ATP产生
降低并破坏胶乳合成, 最终导致死皮。Li等(2010)
构建了健康和死皮橡胶树胶乳cDNA文库, 通过
SSH方法鉴定到237个TPD相关基因, 系统分析死
皮相关基因发现逆境/防御反应和代谢与能量相关
基因分别在死皮和健康橡胶树中大量富集并上调
表达, 推测活性氧代谢、泛素-蛋白酶体途径、
PCD及橡胶生物合成途径为TPD发生关键调控途
径, 在橡胶树TPD发生过程中发挥重要作用。
此外, 许多研究者致力于寻找TPD相关蛋白,
并取得了一定的进展(Dian等1995; Oh等1999;
Sookmark等2002)。本研究组用2-DE结合质谱技
术对死皮和健康橡胶树黄色体、C乳清和橡胶粒
子差异表达蛋白进行了分析, 分别鉴定出17、56
和9个差异蛋白, 这些蛋白主要参与活性氧代谢、
PCD、橡胶生物合成和抗逆等途径(闫洁和陈守才
2008; 闫洁等2008; 陈春柳等2010)。可以肯定, 在
TPD发生及发展过程中, 一些蛋白的表达发生了明
显变化, 有些表达增强, 有些表达减弱, 有些新蛋
白出现。但这些蛋白是否参与TPD发生过程？还
是割胶或乙烯刺激引起的胁迫应答蛋白？这些问
题仍有待于深入研究。
众所周知, 橡胶树死皮是一种复杂的生物学
过程, 光从单个基因入手阐明其发生机制比较困
难。相比之下, 用系统生物学的思路和手段大规
模鉴定TPD相关基因并系统分析其参与的调控途
径, 确定TPD发生重要调控途径和关键基因, 从重
要调控途径中关键基因入手将有助于揭示橡胶树
死皮发生分子机制。基因芯片技术使大规模鉴定
TPD相关基因成为可能, 本课题组覃碧等(2012)定
制了566个探针的寡核苷酸芯片, 该芯片代表566
个死皮相关基因。利用定制橡胶树死皮相关寡核
苷酸芯片在胶乳中鉴定到26个死皮相关基因, 其
功能涉及橡胶生物合成、PCD、细胞抗性及防御
反应、活性氧代谢、DNA甲基化、泛素-蛋白酶
体、信号传导、蛋白质合成、加工及转运等调控
途径。死皮相关基因RT-PCR分析进一步证明了芯
片结果的可靠性, 该研究首次利用定制橡胶树寡
核苷酸芯片研究死皮, 为揭示橡胶树死皮发生机
制提供了新观点。
乳管系统是橡胶树体内合成和贮存胶乳的场
所, 其遍布于橡胶树的各个器官, 而与采胶生产直
接相关的是茎干上树皮中的乳管。与健康橡胶树
相比, 死皮橡胶树树皮在组织学和细胞学上都会
发生明显变化, 最终导致橡胶树部分或全部割线
不能正常排胶(吴继林等2008)。尽管橡胶树树皮
与产排胶和死皮密切相关, 但以前对死皮的研究
多集中在胶乳上, 目前仍无用树皮为研究材料大
规模鉴定死皮相关基因的报道。本研究以死皮和
健康巴西橡胶树树皮为材料, 利用定制的橡胶树
寡核苷酸芯片分析死皮与健康巴西橡胶树树皮中
死皮相关基因表达谱, 为大规模鉴定TPD相关基因
和揭示死皮发生分子机制奠定基础。
材料与方法
1 实验材料
巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)品
系热研7-33-97取自中国热带农业科学院实验农场
五队。该材料1990年定植, 1997年开割, 采用4 d一
刀, 1.5%乙烯刺激。为保持条件一致, 死皮发生后
仍采用与健康橡胶树相同的割制, 选取2级死皮(不
排胶长度占总割线长度的1/5~2/5)和健康橡胶树为
实验材料, 各选取5株生长一致的死皮、健康橡胶
树, 采集树皮后立即用0.1% DEPC处理过的蒸馏水
李德军等: 利用巴西橡胶树寡核苷酸芯片筛选死皮相关基因 903
洗净胶乳并用灭菌的滤纸吸干。分别将5株死
皮、健康橡胶树树皮等量混合, 获得死皮、健康
橡胶树树皮材料, 然后投入液氮中快速冷冻用于
总RNA提取。
2 实验方法
2.1 巴西橡胶树树皮RNA的制备
胶乳总RNA提取参照Venkatachalam等(1999)
发表的方法进行, 总RNA通过异丙醇沉淀法浓缩
RNA, 并进一步采用NucleoSpin® RNA clean-up试
剂盒(MACHEREY-NAGEL, Germany)对总RNA进
行过柱纯化, 最后用分光光度计定量, 甲醛变性胶
电泳质检。
2.2 数据分析
芯片用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪(Capi-
talBio公司)进行扫描, 采用LuxScan 3.0图像分析软
件对扫描图进行分析, 删除了荧光信号弱的基因
以及芯片上的阴性对照、内标、外标等冗余数据,
采用Lowess方法对芯片数据进行归一化(Yang等
2002)。两组样品的基因表达差异直接从两种染料
的比值中得到, 即比值=死皮橡胶树树皮标记荧光
(Cy5)/健康橡胶树树皮标记荧光(Cy3)。根据归一
化后的结果得到每张芯片中基因的比值, 再将两
张荧光交换芯片的比值整合, 比值=比值1×比值2,
每个基因有3个重复比值, 用SAM软件进行分析
(Tusher等2001), 将FDR (false discovery rate)控制
在5%以内, 再以上调或下调2倍标准筛选差异表达
基因, 最后将差异表达基因与NCBI的蛋白数据库
进行BlastX比对确定基因功能。
2.3 差异表达基因的RT-PCR验证
随机选取芯片检测中18个差异表达基因, 以
巴西橡胶树18S rRNA为内参, 采用RT-PCR方法对
芯片结果进行验证, 选取的基因及其RT-PCR引物
信息见表1。cDNA第1链的合成参照SMART™
PCR cDNA Synthesis Kit试验手册进行。以反转录
cDNA作为RT-PCR反应的模板, 反应体系为: cDNA
1 μL, 上游和下游引物各(10 μmol·L -1) 0.5 μL,
10×PCR Buffer 2.5 μL, dNTPs (25 mmol·L-1) 0.5 μL,
Taq酶(2 U) 0.5 μL, 加ddH2O至25 μL。PCR扩增条
件为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ (根据不同
基因有所调整) 40 s; 72 ℃ 40 s, 28次循环; 72 ℃延
伸7 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
实验结果
1 巴西橡胶树树皮总RNA质量检测
在芯片杂交中, RNA的质量直接影响荧光标
记的效果并决定最终的实验结果。提取的死皮和
表1 RT-PCR所用基因及其引物序列
Table 1 Genes and primers for RT-PCR analyses
探针编号 EST登录号 正向引物序列(5′→3′) 反向引物序列(5′→3′)
024 GO349150.1 GTGGAGTTCACAACCTGTTC CTTCAGCACGGTGCTTGAG
349 EC602793.1 GATCCCAATCCTAAAACTCG CTCACTATTTTCTGACTGTTC
332 EC604179.1 CCATGCGTCTTCTTGACCAC CATACTCCAATTGCACGATGG
164 JG002641.1 GGAAACGATGTTGATCTCAG CTCCACAATCTGTTCATTGG
417 JG008445.1 GTGGAGACAGTGGAATATAAG GCAAGACAGCATCTCTCAG
253 JG008315.1 CAAATATCTGGAACTCACATCC CATGTGTGTAACAGATCCTTC
421 GO349303.1 CATCTTAGAAAGCCTAGAAATC CAGCTGCCTCAGCAACTAC
502 EC600972.1 GAGAGGAAGCTGCAGGAATG CTCCCATGAGTTTCGGTTTC
156 GO349311.1 GACAAGGCCTCTCTACTTGG GGTGAGCATCCAAAGGACAG
084 EC604865.1 GGTGGAGGAGTATAATAAGAG GCTCAAACGACGTTAGATTC
553 GO349118.1 GACTGGAGCTAAAACGACAG GGAGAATAGAGGATTGAAGG
059 EC606688.1 CTCCTCAAGCCAATACTGAC CACCTCTTCTCCATCTCTTG
140 EC601998.1 GAAGGACAAGTGATTGCTTG AGAAAGTGACATGTGGCATC
391 JG005596.1 GTGAAGAAGAGGTGAATATCC CTGAATAAGCTTGGATAGATG
495 JG004117.1 CTTGTTTACAGCTGCTCCAG GAGGTTAACTTAGAAGGAGG
347 EC609332.1 GTTGCTAGAGAAGGATCCAAC GGAAGTACTCCCTAATATCC
298 EC608788.1 CCAAGTCAAAGAATCACACTG CCTCGGTAGCTGTCTCACC
087 EC604716.1 GGTAAGATTGCTCATGCAACC TGCAACGACGCTGATCTCAC
Hb18S rRNA AB268099 GGTCGCAAGGCTGAAACT ACGGGCGGTGTGTACAAA
植物生理学报904
健康橡胶树树皮总RNA电泳检测如图1所示, RNA
电泳条带清晰, 28S rRNA比18S rRNA条带亮度大
于1:1, 死皮和健康橡胶树总RNA的A260/A280分别为
1.91和1.83, RNA样品总量大于8 μg。以上结果表
明RNA样品在纯度、总量及完整性上都符合要求,
可用于后续芯片实验。
2 芯片杂交结果统计
死皮和健康橡胶树树皮先分别用Cy3和Cy5
标记, 然后进行荧光交换。芯片杂交、清洗后用
LuxScan 10KA双通道激光扫描仪进行扫描。分别
提取死皮和健康橡胶树芯片杂交的荧光数据, 校
正后将两张荧光交换的数据进行整合, 分析死皮
和健康橡胶树树皮间基因差异表达情况。对芯片
杂交结果进行统计分析表明, 点制的566个基因,
有462个基因表达, 检出率约为81.6%。以上调或
下调2倍标准(比值≥2.0或≤0.5)筛选到56个差异
表达基因, 其中上调表达基因3个, 下调表达基因
53个。
3 基因芯片杂交结果的RT-PCR验证
为验证芯片结果的可靠性, 提取同一批实验
材料的总RNA, 反转录成cDNA后, 随机选取18个
基因进行RT-PCR验证, 18个基因共包含6个功能分
类。如图2所示, 18个基因RT-PCR分析的表达模式
均与利用寡核苷酸芯片杂交的分析结果一致, 证
明了采用定制的橡胶树寡核苷酸芯片鉴定橡胶树
TPD相关基因表达谱的可靠性。
4 差异表达基因功能注释
将筛选到的56个差异表达基因与NCBI的非
冗余蛋白质数据库进行BlastX比对分析, 发现这56
个差异表达基因除EC608788.1为未知功能基因外,
其余均具有相应的功能注释(表2), 其功能涉及细
胞抗性及防御反应, 蛋白质合成、加工及转运, 代
谢和能量, 细胞结构、生长及分化, 细胞信号转导,
转录相关, 橡胶生物合成。在死皮相关基因功能
分类中, 细胞抗性及防御反应相关的基因所占比
例最高, 总共有17个, 除了一个编码精氨酸脱羧酶
(arginine decarboxylase)基因在死皮树中上调表达
外, 其余16个基因均在死皮树中下调表达。其次
是11个蛋白质合成、加工及转运相关基因, 这些基
因均在死皮树中下调表达。接下来是9个代谢和
能量相关基因, 这些基因也都在死皮树中下调表
达。以上3个功能分类基因占死皮相关基因的
66.07%, 说明树皮中死皮相关基因在这三类功能
图1 死皮与健康巴西橡胶树树皮总RNA电泳图
Fig.1 Electrophoresis of the total RNA from the bark samples
of TPD and healthy rubber trees
1和2分别为死皮和健康巴西橡胶树树皮总RNA。
图2 差异表达基因RT-PCR验证结果
Fig.2 The expression analyses of differently expressed genes by RT-PCR
Hb18S rRNA为RT-PCR内参。
李德军等: 利用巴西橡胶树寡核苷酸芯片筛选死皮相关基因 905
表2 死皮与健康树树皮差异表达基因
Table 2 The genes differently expressed in the bark samples of TPD and healthy rubber trees
基因功能分类 探针编号 EST登录号 编码蛋白描述 比例(死皮/健康)
抗性/防御反应 024 GO349150.1 精氨酸脱羧酶 2.07
404 EC605306.1 苏氨酸蛋白激酶 0.48
106 JG009957.1 几丁质酶 0.28
376 EC609134.1 吲哚乙酸诱导蛋白ARG2 0.47
564 GO349145.1 DNA甲基转移酶 0.47
565 GO349140.1 胶乳高丰度蛋白1 0.49
117 EC603655.1 吲哚乙酸诱导蛋白ARG2 0.30
372 JG006031.1 脱水蛋白 0.47
119 JG006458.1 胚胎缺陷蛋白2742 0.41
373 HS999680.1 脱水蛋白 0.36
084 EC604865.1 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 0.34
405 GO349130.1 ASR相似蛋白1 0.34
553 GO349118.1 致病相关蛋白4 0.13
330 EC604196.1 IAA氨基酸水解酶ILR1前体 0.38
377 JG011279.1 ASR相似蛋白1 0.34
349 EC602793.1 丝/苏氨酸蛋白激酶 0.47
391 JG005596.1 橡胶延伸因子相似逆境相关蛋白1 0.12
蛋白合成、加工及转运 281 JG013075.1 40S核糖体蛋白S24 0.48
314 EC606310.1 60S核糖体蛋白L35a 0.44
421 GO349303.1 膜泡蛋白分选关联蛋白28 0.44
274 JG001756.1 60S核糖体蛋白L36a/L44 0.41
253 JG008315.1 40S核糖体蛋白S29 0.32
037 GR305683.1 60S核糖体蛋白L5 0.43
356 JG002240.1 泛素相似蛋白5 0.29
550 GO349181.1 泛素家族蛋白 0.30
355 EC600643.1 多聚泛素 0.46
473 EC605878.1 真核翻译起始因子SUI1相似蛋白 0.46
470 EC601256.1 真核翻译起始因子5A同工型I 0.38
代谢和能量 140 EC601998.1 硫氧还蛋白H 0.41
059 EC606688.1 酰基磷酸酯酶 0.46
144 EC600970.1 细胞色素C 0.25
417 JG008445.1 ADP-核糖基化作用因子 0.50
223 EC606991.1 细胞色素P450氧化还原酶 0.50
087 EC604716.1 细胞色素C氧化酶亚基Vc家庭蛋白 0.45
478 EC604586.1 泛醇-细胞色素C还原酶复合物7.8 kDa蛋白 0.43
064 EC608253.1 信息素输出蛋白 0.50
164 JG002641.1 谷胱甘肽过氧化物酶 0.43
细胞结构、生长及分化 149 EC605962.1 黄叶特异性基因8 0.49
448 EC607701.1 MADS盒转录因子2 0.31
203 EC603640.1 叶绿体内膜转位酶亚单元9 0.29
332 EC604179.1 SHAGGY相关激酶 0.45
189 JG006904.1 甘油-3-磷酸乙酰转移酶8 0.49
细胞信号转导 347 EC609332.1 丝/苏氨酸蛋白激酶 2.77
071 EC601377.1 钙调蛋白7 0.36
374 JG005510.1 ASR相似蛋白2 0.48
146 EC602516.1 漆树蓝蛋白 0.47
070 EC601138.1 钙调蛋白7, 钙离子结合 0.49
转录相关 495 JG004117.1 锌指结合蛋白 3.50
156 GO349311.1 bHLH家族蛋白 0.46
514 JG001775.1 C3HC4-型锌指蛋白 0.17
173 JG001315.1 转录因子MYC1 0.19
502 EC600972.1 锌指家族蛋白 0.23
橡胶生物合成 400 EC606460.1 橡胶延伸因子 0.34
389 JG001783.1 橡胶延伸因子 0.34
390 JG007973.1 橡胶延伸因子 0.26
未知功能 298 EC608788.1 功能未知蛋白DUF567 0.49
植物生理学报906
中大量富集。此外, 各有5个基因涉及细胞结构、
生长及分化, 细胞信号转导和转录相关, 除细胞信
号转导和转录相关中各有1个基因在死皮树树皮
中上调表达外, 其余基因均在死皮树树皮中下调
表达。有3个基因与橡胶生物合成直接相关, 均编
码橡胶延伸因子(rubber elongation factor, REF), 并
都在死皮树中下调表达。
讨　　论
本研究利用前期开发和定制的橡胶树寡核苷
酸芯片研究TPD相关基因在死皮与健康橡胶树树
皮中的表达模式, 芯片点制的566个基因均来自橡
胶树胶乳。本次实验共检查到462个基因在树皮
中表达, 少于胶乳中检查到的508个, 2次实验得到
的表达基因数量差异可能与基因的组织表达特异
性有关。覃碧等(2012)研究结果表明, 死皮和健康
橡胶树胶乳中差异表达基因共26个, 其中16个在
死皮橡胶树中表达上调, 10个下调。与胶乳研究
结果不同, 在树皮中共鉴定到56个差异表达基因,
其中3个在死皮橡胶树中表达上调, 53个下调。比
较死皮和健康橡胶树胶乳和树皮差异表达基因,
结果发现死皮树树皮中下调表达基因高达94.6%,
而胶乳中只有38.5%, 说明死皮和健康橡胶树胶乳
和树皮基因表达模式可能存在差异, 即在树皮中
存在显著表达差异的基因在胶乳中可能表达差异
不显著, 反之亦然。利用RT-PCR验证差异表达基
因的表达模式, 结果与树皮芯片杂交结果一致, 进
一步证明了芯片结果的可靠性, 同时也说明该芯
片可用于鉴定橡胶树不同组织的TPD相关基因。
利用定制橡胶树寡核苷酸芯片在死皮与健康
树树皮中共鉴定到56个差异表达基因, 涉及8个不
同的功能分类(表2), 这一结果与我们前期以胶乳
为杂交材料的芯片研究结果基本一致 (覃碧等
2012)。分析死皮与健康树树皮和胶乳的芯片结
果, 均发现差异表达基因中抗性及防御反应途径
相关基因所占的比例最高, 这与Venkatachalam等
(2007)和Li等(2010)通过SSH方法在胶乳中鉴定的
死皮相关基因功能分类结果一致, 说明抗性及防
御反应途径相关基因在橡胶树死皮发生过程中发
挥着重要作用。本次研究中鉴定的抗性及防御反
应途径相关基因主要包括抗病原微生物、基础防
御反应、机械伤害反应及其他非生物胁迫反应相
关的基因(表2)。此外, 有3个基因的表达模式与
Venkatachalam等(2007)通过SSH方法分析得到的
结果一致, 包括编码酰基磷酸酯酶(acylphosphatase)
基因、与活性氧代谢相关的硫氧还蛋白(thiore-
doxin H)基因以及细胞抗性及防御反应相关的类
似REF的胁迫反应相关蛋白1 (REF-like stress relat-
ed protein 1)基因, 这3个基因在死皮树树皮中均下
调表达。以上3个基因在不同橡胶树品种、不同
组织及不同实验方法中得到相同的结果, 表明这
些基因可能在死皮发生过程中扮演着重要角色。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制, 大
量研究结果表明DNA甲基化在不同物种、不同发
育时期及生长阶段、不同组织之间表达的变化是
植物正常生长发育所必需的(Klose和Bird 2006)。
在植物中, DNA甲基化主要参与植物基因表达的
调控, 进而调节植物的生长发育。此外, DNA甲基
化还与植物开花(Burn等1993; Finnegan等1998)、
花器官形成的调控(Sheldon等1999), 以及转基因过
程中的基因沉默有关(Dieguez等1997)。Uthup等
(2011)对不同生态环境下橡胶生物合成过程中的4
个关键基因(HMGR1、HMGS1、FDP和REF)和一
个抗性基因coronatine-insensitive 1的启动子区进
行甲基化模式分析发现, 这些基因的启动子区在
不同生态环境下的甲基化模式不同, 甲基化可能
参与了橡胶树对环境胁迫的响应过程。本研究发
现DNA甲基转移酶(S-adenosylmethionine-depen-
dent methyltransferase)基因在树皮和胶乳芯片中具
有相同的表达模式, 均在死皮树中下调表达(覃碧
等2012), 说明DNA甲基化可能在橡胶树死皮发生
中具有重要作用。橡胶树死皮被认为是一种由强
伤害(割胶)或强乙烯刺激引起的产排胶失衡, 可以
看成是橡胶树产排胶失衡的极端表现。DNA甲基
化显然是死皮这一现象的合理解释, 其在不改变
DNA序列的前提下改变遗传表现。因而, 我们推
测DNA甲基转移酶基因表达模式变化可能引起橡
胶树甲基化模式变化, 这种变化可能是引起死皮
相关基因表达变化的原因之一, 我们课题组正致
力于这方面的研究。
在56个死皮相关基因中, 有3个编码REF的基
因直接参与橡胶生物合成, 这3个基因在死皮树树
李德军等: 利用巴西橡胶树寡核苷酸芯片筛选死皮相关基因 907
皮中均下调表达。Sookmark等(2002)采用2D-
SDS-PAGE分析死皮与健康橡胶树胶乳蛋白质组
中发现, 一个22 kDa的蛋白在死皮树胶乳中显著积
累, 对其测序结果证明该蛋白为REF (Hev b1), 通
过Northern blot对该蛋白编码基因进行表达谱分析
发现, 该基因的表达在死皮与健康橡胶树胶乳中
无显著差异, 据此他们推断, 死皮树胶乳中REF的
积累可能是由于胶乳中黄色体膜破裂释放的物质
促使REF从橡胶粒子中释放出来引起的。我们前
期对死皮和健康橡胶树胶乳芯片结果分析中也未
发现REF基因的显著差异表达(覃碧等2012), 死皮
橡胶树树皮中橡胶延伸因子表达下调可能直接影
响橡胶生物合成, 这些结果还有待于深入研究。
橡胶树死皮是一种非常复杂的生理综合症,
有多个基因及多个调控途径参与其中。胶乳在乳
管内合成和贮存, 而橡胶树树干的树皮与橡胶生
产直接相关。本文通过定制橡胶树寡核苷酸芯片
分析死皮和健康橡胶树树皮死皮相关基因表达模
式及功能分析, 可系统反映TPD相关基因的表达模
式与TPD发生之间的联系, 是橡胶树死皮发生机制
研究的必要补充。此外, Li等(2012)已完成橡胶树
树皮Illumina双向测序数据组装, 并对树皮转录组
特性进行了系统分析, 为本研究鉴定的死皮相关
基因克隆和功能分析奠定了基础。结合我们前期
研究工作及前人对死皮的研究结果, 推测橡胶生
物合成、抗性及防御反应、活性氧代谢、DNA甲
基化、泛素-蛋白酶体等途径为橡胶树死皮发生的
重要调控途径, 系统研究死皮发生重要调控途径
中关键基因的功能将为深入揭示橡胶树死皮发生
机制奠定基础。
参考文献
陈春柳, 闫洁, 邓治, 李德军(2010). 橡胶树死皮橡胶粒子膜蛋白差
异分析与初步鉴定. 中国农学通报, 26 (5): 304~308
范思伟, 杨少琼(1995). 强割和排胶过度引起的死皮是一种特殊的
局部衰老病害. 热带作物学报, 16 (2): 15~22
覃碧, 刘向红, 邓治, 李德军(2012). 利用oligo芯片技术鉴定橡胶树
死皮相关基因. 热带作物学报, 33 (2): 296~301
吴继林, 谭海燕, 郝秉中(2008). 乙烯利过度刺激采胶诱导巴西橡胶
树割面干涸病的研究. 热带作物学报, 29 (1): 1~9
闫洁, 陈守才(2008). 橡胶树死皮病黄色体蛋白质组差异分析与初
步鉴定. 湖北农业科学, 47 (8): 858~862
闫洁, 陈守才, 夏志辉(2008). 橡胶树死皮病胶乳C-乳清差异表达蛋
白质的筛选与鉴定. 中国生物工程杂志, 28 (6): 28~36
Burn JE, Bagnall DJ, Metzger JD, Dennis ES, Peacock WJ (1993).
DNA methylation, vernalization, and the initiation of flowering.
Proc Natl Acad Sci USA, 90: 287~291
Chen SC, Peng SQ, Huang GX, Wu KX, Fu XH, Chen ZQ (2002).
Association of decreased expression of a Myb transcription fac-
tor with the TPD (tapping panel dryness) syndrome in Hevea
brasiliensis. Plant Mol Biol, 51 (1): 51~58
Dian K, Sangare A, Diopoh JK (1995). Evidence for specific variation
of protein pattern during tapping panel dryness. Plant Sci, 105 (2):
207~216
Dieguez MJ, Bellotto M, Afsar K, Mittelsten Scheid O, Paszkowski J
(1997). Methylation of cytosines in nonconventional methylation
acceptor sites can contribute to reduced gene expression. Mol
Gen Genet, 253 (5): 581~588
Finnegan EJ, Genger RK, Kovac K, Peacock WJ, Dennis ES (1998).
DNA methylation and the promotion of flowering by vernaliza-
tion. Proc Natl Acad Sci USA, 95: 5824~5829
Klose RJ, Bird AP (2006). Genomic DNA methylation: the mark and
its mediators. Trends Biochem Sci, 31 (2): 89~97
Li DJ, Deng Z, Chen CL, Xia ZH, Wu M, He P, Chen SC (2010).
Identification and characterization of genes associated with tap-
ping panel dryness from Hevea brasiliensis latex using suppres-
sion subtractive hybridization. BMC Plant Biol, 10: 140
Li DJ, Deng Z, Qin B, Liu XH, Meng ZH (2012). De novo assembly
and characterization of bark transcriptome using Illumina se-
quencing and development of EST-SSR markers in rubber tree
(Hevea brasiliensis Muell. Arg.). BMC Genomics, 13: 192
Oh SK, Kang H, Shin DH, Yang J, Chow KS, Yeang HY, Wagner B,
Breiteneder H, Han KH (1999). Isolation, characterization, and
functional analysis of a novel cDNA clone encoding a small rub-
ber particle protein from Hevea brasiliensis. J Biol Chem, 274
(24): 17123~17138
Peng SQ, Wu KX, Huang GX, Chen SC (2011). HbMyb1, a Myb
transcription factor from Hevea brasiliensis, suppresses stress
induced cell death in transgenic tobacco. Plant Physiol Biochem,
49: 1429~1435
Sheldon CC, Burn JE, Perez PP, Metzger J, Edwards JA, Peacock WJ,
Dennis ES (1999). The FLF MADS box gene: a repressor of
flowering in Arabidopsis regulated by vernalization and methy-
lation. Plant Cell, 11 (3): 445~458
Sookmark U, Pujade-Renaud V, Chrestin H, Lacote R, Naiyanetr C,
Seguin M, Romruensukharom P, Narangajavana J (2002). Cha-
racterization of polypeptides accumulated in the latex cytosol
of rubber trees affected by the tapping panel dryness syndrome.
Plant Cell Physiol, 43 (11): 1323~1333
Tusher VG, Tibshirani R, Chu G (2001). Significance analysis of mi-
croarrays applied to the ionizing radiation response. Proc Natl
Acad Sci USA, 98 (9): 5116~5121
Venkatachalam P, Geetha N, Priya P, Thulaseedharan A (2010). Iden-
tification of a differentially expressed thymidine kinase gene re-
lated to tapping panel dryness syndrome in the rubber tree (Hevea
brasiliensis Muell. Arg.) by random amplified polymorphic DNA
screening. International J Plant Biol, 1 (1): e7
Venkatachalam P, Thanseem I, Thulaseedharan A (1999). A rapid and
植物生理学报908
efficient method for isolation of RNA from bark tissues of Hevea
brasiliensis. Curr Sci, 77: 101~103
Venkatachalam P, Thulaseedharan A, Raghothama K (2007). Identifi-
cation of expression profiles of tapping panel dryness (TPD) as-
sociated genes from the latex of rubber tree (Hevea brasiliensis
Muell. Arg.). Planta, 26 (2): 499~515
Venkatachalam P, Thulaseedharan A, Raghothama K (2009). Molecu-
lar identification and characterization of a gene associated with
the onset of tapping panel dryness (TPD) syndrome in rubber
tree (Hevea brasiliensis Muell.) by mRNA differential display.
Mol Biotech, 41 (1): 42~52
Uthup TK, Ravindran M, Bini K, Thakurdas S (2011). Divergent
DNA methylation patterns associated with abiotic stress in He-
vea brasiliensis. Mol Plant, 4 (6): 996~1013
Yang YH, Dudoit S, Luu P, Lin DM, Peng V, Ngai J, Speed TP (2002).
Normalization for cDNA microarray data: a robust composite
method addressing single and multiple slide systematic variation.
Nucleic Acids Res, 30 (4): e15