全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(6)：876— 880 2O10年 11月
巴西橡胶树胶乳磷脂酶 A2的分离
纯化及部分酶学性质鉴定
邓 治，刘实忠，校现周
(中国热带农业科学院 橡胶研究所 农业部橡胶树生物学重点开放实验室，海南 儋州 571737)
摘 要 ：通过丙酮沉淀、DEAE一纤维素离子交换柱层析和 Sephadex G一100凝胶过滤柱层析等分离纯化技术，
对巴西橡胶树胶乳 C一乳清磷脂酶 A2进行分离纯化。用 SDS—PAGE测定其亚基的相对分子量。测定该酶最
适温度和 pH，动力学常数 K 和 V 。并测定 Caz+和 La。+对酶活性的影 响。结果显示 ：该酶被纯化了
49．47倍，产率为 5．12 。SDS—PAGE检测为单一条枯 ，其亚基相对分子量约 43 kDa。最适反应温度为 37
℃，最适反应 pH为 8．0，K 为 0．44 mmol·L- ，Vm 为 7．22／2mol。(mL。min) 。最适 Ca +浓度为 5o
／~mol·L ，稀土元素 Laa+离子对磷脂酶 A2活性有抑制作用 ，但加入 Ca +后可缓解 La。 对磷脂酶 Az活性
的抑制作用 。胶乳 C-．#L清磷脂酶 A2与其他植物磷脂酶 Az在 Ca2+的依赖性上存在差异。研究结果为今后
探索橡胶树胶乳磷脂酶 A2的催化机理、调节机理及生理功能等奠定了基础。
关键词 ：巴西橡胶树；磷脂酶 Az；酶的纯化 ；酶的性质
中图分类号：Q556 文献标识码：A 文章编号：1000～3142(2010)06～0876—05
Purification and enzymatic characterization
of phospholipase A2 from latex
Heyea brasiliensis
DENG Zhi．LIU Shi-Zhong，XIAO Xian-Zhou
(Rubber Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory
of RMaber Biology，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737，China)
Abstract：A phospholipase Az(PLAz)was purified from the latex C-serum of Hevea brasiliensis by acetone precipita—
tion，DEAE-Celulose ion exchange chromatography，Sephadex G-IO0 gel filtration．SDS-PAGE was used to deter—
mine the Mr of the subunit of PLA2，Then the Km，Vm8x，the optimum temperature and pH of PLA2 were tested．
The efect of Ca2+and La3+on PI A2 activity were assayed．A 49．47一fold purification was obtained with the recov—
cry of 5．12 activity．The results showed that a single band on SDS-PAGE with a subunlt Mr of 42 kDa．Latex G
serum PLA2 had an optimum temperature at 37℃ ，and an optimum pH at 8．2．The Km was 0．44 mmol·L- ．The
Vmax was 7．22／*mol·(mL ·min)～．The Ca + ion optimum concentration for activity was determined tO be 50／~mol
· L一1．The activity of PLA2 was inhibited by La3+．The inhibited efect of La3+ was palliated after added calcium
ion．There are differences of Cae+ dependence between latex C-serum and other plant PLA2．The results provide a
research basis for catalytic mechanism，regulation，and physiology function of PLA2 in latex．
Key words：Hevea brasiliensis；phospholipase Az；purification of enzymes；enzymological properties
收稿 日期：2009—03—09 修回日期 ：2010—007—30
基金项目：海南省自然科学基金(30104)[Supported by the Natural Science Foundation of Hainnan ProVjnce(3O104)]
作者简介：邓治(1977一)，女，云南昭通人，助理研究员，从事植物逆境生理生化研究工作，(E—mail)zizip@1 63．conl
通讯作者(Author for c。rrespondence，E—mail：xiao_xianzhou@126．corn)
6期 邓治等：巴西橡胶树胶乳磷脂酶 A。的分离纯化及部分酶学性质鉴定 877
磷脂酶 A2(EC 3．1．1．4，phospholipase A2，简
称PLA。)是一种重要的代谢和调节酶类。在生物
体内广泛分布，按其来 源可分为五种类型 (Schalo—
ske等，2OO6)：分泌型 PLA。(sPLA。)、胞质型 PLA：
(cPLA2)、Ca。 不 依 赖 型 PLA2(iPLA2)、血 小 板 活
化因子 乙酰水 解 酶 (PAF—AH)和 溶 酶 体 PLA。。
PLA 催化细胞膜上甘油磷脂 的 Sn一2位脂肪酸水
解，生成溶血磷脂及 自由脂肪酸。这些脂类产物可
以充当细胞内的第二信使 ，也可进一步代谢产生茉
莉酸及 相关 复 合 物 (Narvdez—Vdsquez等 ，1999)。
此外，PLA。在抗 菌(Harwig等 ，1995)、抗 炎 (王秋
雁等 ，2001)、脂代谢(May等 ，1999)、活性氧和生物
碱的产生(Munnik等，1998；ROOS等 ，1999)、离 子
通道功 能 (Mancuso等，2000)和 生长 素刺激 生 长
(Paul，l998)等细胞 的许多生理过程 中起到重要作
用 。目前对于动物 的 PLA：已有广 泛的研究 ，但是
对植物 PLA 的研究报道则相对较少 。Kostya|等
(1998)对胶乳 过敏原 Hey b7进行 cDNA克隆 ，发
现它与 patatin同源，patatin具有类 PLA2活性 。但
是，目前尚未见到有关胶乳 PLA：纯化及其性质研
究的报道。本文对胶乳 PLA 进行 了分离纯化，并
对其部分酶学性质进行 了研究 ，以期为橡胶树胶乳
PLA。的结构 、催化机理等研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1材料
选取本院试验农场沙 田队橡胶树无性 系热研
7-33 97的胶乳为实验材料。
1．2方法
1．2．1 PLA 的分离与纯化 酶的分离纯化参照汪
家政(2OO2)和吴冠芸 (2002)的方法 ，将采集 的新鲜
胶乳置于 4℃下，19 000 rpm，离心 1 h，利用穿刺针收
集中层 c-~t,清为粗酶液。取 2O mL C-~t,清加入 4×
体积的冰丙酮混匀，一20℃放置 1 h后，4℃，10 000
rpm离心 10 min。弃上清 ，使沉淀风干 。用 1～2倍
沉淀体积 的缓冲液I(0．05 tool·L- Tris—HC1，pH
8．2，5 mmol·L 巯基 乙醇)悬 浮沉淀。将重悬液
上样于 DEAE-纤 维素柱 中(柱长 300 Ynin，直径 16
mm)，先用 330 mL的缓冲液I洗脱掉未结合的杂蛋白
质。然后用 0～3 tool·L- NaC1溶液进行线性梯度
洗脱，洗脱速度为 0．5 mL·rain- ，6 mL-管～。收集
具有 PLA。活性的溶液放人透析袋 中，4℃下在缓冲
液Ⅱ(O．25 tool·L- Tris—HC1，pH 8．2；5 mmol·L-
巯基乙醇 ，1 Tween一2O)中透析过夜 。将透析后的溶
液经 PEG 2O 000浓缩 ，上样于 Sephadex G-100柱中
(柱长 600 mrn，直径 26 mm)，用缓冲液Ⅱ进行洗脱，洗
脱速度为 0。5 mL·min- ，6 mL·管 。最后，将具有
PLA2活性的溶液放人透析袋中，用 PEG 2O 000进行
浓缩 ，一20℃保存备用 。
1．2．2 PLAz活性 的测定 酶活性测定按 Kush等
(199O)的方法进行。底物母液配制 ：称取 28 mg对一
硝基苯棕榈酸溶于 100 mL l Triton—X 100中，加
人 1 SDS 1．7 mL后加 热溶解 ，定容后室温放置
备用 。取 1 mL底物母液和 1 mL反应缓冲液(0．1
tool·L- Tris—HC1，PH8．2)于试管 中，再加入 0．5
mL酶液，摇匀 ，放入 37℃水浴锅中温育 30 rain后 ，
取 出，加入 1 mL无水 乙醇 中止反应 ，测 。 。。以
蒸馏水代替酶液 ，同法 操作 ，作为空 白对照。PLA。
活性以每分钟催化生成 1,umo|对硝基苯酚 的酶量
为一个酶活单位(U)表示 ，比活力(U·mg )用每毫
克蛋白所含的酶活性单位数表示。
1．2．3蛋 白质的测定及 电泳检测 蛋 白质浓度测定
采用 Bradford(1976)的方法 ，以牛血清 白蛋白为标
准蛋 白。采用 SDS—PAGE测定酶蛋 白质亚基相对
分子量，分离胶浓度为 12 ，浓缩胶浓度为 4 。参
照 Gabriel(1971)的方法 ，电泳后酶活性的测定采用
分离胶浓度 为 12 ，浓缩胶 浓度为 4 的 Native—
PAGE，电泳结束后 ，将凝胶分成两半，一半用于染
色，根据染色结果将另一半相 同位置上的凝胶切下
测定 PLA：活性。
1．2．4 PLA：的酶 学性 质研 究 酶活性最佳反应
pH值实验 ：将加 入 底 物母 液 的酶液 放在 pHO～
14．0之间的反应缓 冲液中，间隔为 pil1．0的条件
下 37℃反应 30 rain，测定 酶活性。根据测定的酶
活结果再选取 pH7．0～9．0之间的反应缓 冲液，间
隔为pHO．2的条件反应测定酶活性。酶活性最佳
反应温度实验 ：将加入底物母液的酶液分别放在 20
～ 60℃ 条 件下 间 隔 为 10℃ 反 应 ，反应 缓 冲液
pH8．2，反应时间 30 rain，测定酶活性。根据结果再
选取 3O～4O℃之间 ，间隔 1℃的条件反应测定酶活
性。金属离子对酶活性的影响实验：①Ca抖对 PLAz
活性的影响：在反应体系中加入 Ca抖浓度为 0~300
#tool·L- ，间隔 5O／1tool·L ，其余条件同 1．2．2；
②Ca 存在条件下稀 土元 素 La抖对 PLA 活性的
影响：在反应缓冲液中加入浓度为 50,umol·L- 的
878 广 西 植 物 3O卷
Ca2+，然后再加入 La汁浓度为 0～120 mo1．L ，
间隔为 80／~mol·L- ，共余条件 同 1．2．2。K 及
V⋯值测定 ：配制不同浓度的底物溶液，分别与酶液
在最适 pH和温度下反应 ，采用双倒数法确定 PLAz
的 K 及 V⋯值。
2 结果与分析
2．1酶的分离纯 化
PLA。的粗提液经丙酮沉淀后上样于 DEAE一纤
维素离子交换层析柱 ，洗脱液中出现 8个蛋 白质峰
(图 1)。经测定，第 7个峰具有酶活性 ，收集此峰的
洗脱液共 30 mL，浓缩后进行下一步纯化 。
E
C
一
管号
图 l PLA2的 DEAE-纤维素离子交换层析洗脱图
Fig．1 Elution profiles of PLA2 0n Ion—exchange
Chromatography of DEAE—Celluous
0 30
0．25
0．2O
量0．15
0．10
0．05
0
0 10 20 30 40 50 6O 70 80 90
5 5 25 35 d5 55 65 75 85 95
管号
兮
～
掣
燠
～
《
- -I
45
40
35
30
25
20菖
15
10
0
图 2 PLA2的 Sephedax G-IOO凝胶过滤层析洗脱图
Fig．2 Elution profiles of PLA2 on Gel filtration
chromatography of Sephedax G-100
将上述具有酶活性 的洗脱液上样 于 Sephedax
G—i00凝胶过滤层析柱后 ，经洗脱出现 3个蛋 白质
峰(图 2)，经测定第 2个峰具有酶活性 ，收集此峰的
洗脱液共 36mL，经 PEG 20 000浓缩 至 2mL左右
后保存备用。
97 4KD
66．2KD
43KD
31 KD
20 1 KD
14 4KD
酶 女
图 3 PLAz的凝 胶 电泳 图谱
Fig．3 Electrophoresis pattern of PLA2
A SDS-PACE图谱(1．Marker；2．纯化PLA2)；B：PAGE图谱
分离纯化后的 PLA：，用 SDS—PAGE检测得到
一 条蛋白带，其分子量约 43 kDa(图 3：A)。用 N—
ative—PAGE检测得到一条带，切取含有该条带的凝
胶检测到 PLA。活性 (图 3：B)，从而确定该条带确
为 PLA。。经过上述纯化步骤可知 ，PLA 已基本纯
化，可以对其进行下一步酶学性质的研究。各纯化
步骤所得到的纯化倍数和产率见表 1。
2．2酶学性质
2．2．1 PLA。反应的最适 pH 加入底物母液的酶
液在反应缓冲液 pH0～14．o，间隔为 pHI．0的条件
下反应 ，可知 pH7．O～9．0之间 PI A。活性较高(数
据未显示)。随后选取 pH7．0～9．0之间的反应缓
冲液 ，间隔为 pH0．2的条件反应 ，结果可知 PLA
最适 pH值为 8．2(图 4)。
2．2．2 PLA。反应的最适温度 加入底物母液的酶
液分别放在 20～60℃条件下反应，结果 3o～4O℃
之间PLA 活性较高(数据未显示)。然后选取 3o
～ 4O℃之间的反应温度，间隔 1℃的条件反应，结
果可知 PLA。最适温度为 37℃(图 5)。
2．2．3不同浓度钙离子对 PLA 活性的影响 Ca抖
对 PLA 的影响多种多样 ，为研究 Ca抖对胶乳 C一乳
清中 PLA：的影响，在反应体 系中加入 Ca ，结果
发现，Ca。 可促进 PLA2活性 ，最适 Ca 浓度为 5O
／xmol·L ，其余都没有该浓度的促进作用明显(图
6)。这与 Jung等(2000)报道的蚕豆 PLA2、马铃薯
晚疫病菌诱导的胞质 PLA。(Senda等，1996)等植物
PLA 为不依赖 Ca抖的结果不同。
2．2．4不同 La” 浓度对 PLA2活性 的影 响 稀 土元
素 La什对 PLA。活性有抑制作用。低浓度稀土抑
制作用不很明显，当 LaH浓度达 i00／~mol·L 时
6期 邓治等：巴西橡胶树胶乳磷脂酶 Az的分离纯化及部分酶学性质鉴定 879
7 0 7 2 7 4 7 6 7 8 8．0 8．2 8．4 8．6 8．8 9．0
pH值
图 4 不同 pH 对 PLA2活性的影响
Fig．4 Effects of different pH on the activity of PLA2
30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4O
温度 。C
图 5 不同温度对 PLA2活性的影响
Fig．5 Effects of different temperatures
on the activity of PLA2
严重 抑 制 PLA 酶 活 性，酶 活 仅 为 无 La蚪 时 的
56 。当 La”浓度达 120／xmol·L- 时几乎完全抑
制了 PLA 活性 (图 7)。这与稀土离子对蛇毒
PLA：的影响情况一致 (李伟 国等，2002)。而加入
Ca 后可缓解 La针对 PLA。的抑制作用 。这可能
是 Ca蚪具有和 La蚪相近的离子半径和配位化学环
境 ，Ca。 离子可以竞争性地结合在酶的活性部位。
2．2．5 PLA2的 K 和 V 值 测定 在 PH8．2、37
℃下，采用双倒数法测得胶乳 C一乳清 PLA 对对硝
基苯棕榈酸 的 K 为 0．44 mmol· ，V⋯ 为 7．22
／~mol ·(mL ·rain)～。
ca 浓度( mOf．L )
图 6 不同浓度钙离子对 PLA2活性的影响
Fig．6 Effects of different calcium ion concentrations
on the activity of PLA2
图 7 不同 La3+浓度对 PLA2活性的影响
Fig．7 Effects of different lanthanum ion
concentrations on the activity of PLA2
3 讨论
胶乳 G乳清通过丙酮沉淀、离子交换层析、凝胶
过滤层析等分离纯化方法，获得 43 kDa左右电泳纯
的 PLA 。与蚕豆叶片 PLA2纯化结果相比，胶乳 G
乳清中纯化倍数较低 ，这可能是不同的分析条件下底
物的量不同所造成的。而橡胶树胶乳 C_乳清中
PLA 的最适 pH为 8．2，这可能与物种的起源及生长
适应性有关。Ca2 对 PLA2的影响是多种多样 的，
Caz 离子对于低分子量的 PLA。具激活作用，也可触
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880 广 西 植 物 3O卷
发 IV类 cPLA 转移定位到膜上。植物中的PLAz多
为钙不依赖型(Wang，200D，但 Ca2 却对本文中所纯
化得到的PLA：有激活作用 ，由于 Ca。 在信号转导和
许多生理代谢活动中起重要的调节作用，其作用机理
较复杂，所以 Ca 对胶乳 PLA2的激活机制还有待进
一 步研究。本文纯化得到的胶乳 C_乳清 PLA。是否
是一种新型的植物 PLA。呢?这还需进行蛋 白质测
序和结构分析等研究后才能确定。稀土元素影 响植
物的许多生理功能，包括植物生长、营养代谢、光合作
用、特别是对植 物抗逆性。其 中稀 土元素 蚪 与
Ca。。无论性质及结构均很相似，其不同之处是 La抖
的电荷高于 Ca2 ，因而有人将稀 土离子称 为“超级
钙”(倪嘉缵，1995)。它不仅可占据钙的位置，还可取
代包括结合的 ca抖。并且已有研究表明稀土元素与
钙还 有一定 的拮抗 作 用 (Rangel，1994i Hodick&
Sievers，1998)。本文研究结果表明稀土元素 La汁离
子对 PI A 活性有抑制作用，但加入 Caz 后可缓解
La。 对 PLA。活性的抑制作用 ，这可能是稀土元素与
钙之间的竞争或拮抗作用的结果 。
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