全 文 ： Ｇｕｉｈａｉａ Ａｐｒ. ２０１６ꎬ ３６(４):４４９－４５５
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍ
ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１５１００１３
邓小敏ꎬ吴绍华ꎬ戴雪梅ꎬ等. 巴西橡胶树胶乳和悬浮细胞中 ＭＶＡ和 ＭＥＰ 代谢途径基因的表达分析[Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(４):４４９－４５５
ＤＥＮＧ ＸＭꎬＷＵ ＳＨꎬ ＤＡＩ ＸＭꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＶＡ ａｎｄ ＭＥＰ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｌａｔｅｘ ａｎｄ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ[Ｊ].
Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(４):４４９－４５５
巴西橡胶树胶乳和悬浮细胞中 ＭＶＡ和
ＭＥＰ代谢途径基因的表达分析
邓小敏ꎬ 吴绍华ꎬ 戴雪梅ꎬ 田维敏∗
( 中国热带农业科学院橡胶研究所 /农业部橡胶树生物学重点开放实验室 /省部共建国家重点
实验室培育基地—海南省热带作物栽培生理学重点实验室ꎬ 海南 儋州 ５７１７３７ )
摘 要: ＭＶＡ和 ＭＥＰ 代谢途径是植物类异戊二烯代谢途径的两条重要次生代谢途径ꎮ 该研究利用荧光定量
ＰＣＲ技术ꎬ分析了橡胶树胶乳和橡胶树花药愈伤组织来源的悬浮细胞中 ＭＶＡ代谢途径和 ＭＥＰ 代谢途径中关
键基因的表达水平ꎬ同时分析了茉莉酸的结构类似物冠菌素(ｃｏｒｏｎａｔｉｎｅꎬＣＯＲ)对悬浮细胞中 ＨｂＡＡＣＴ３ꎬＨｂＨ￣
ＭＧＲ４ꎬＨｂＨＭＧＲ５ꎬＨｂＤＸＳ２ꎬＨｂＤＸＲ 和 ＨｂＳＱＳ１ 基因表达的调节作用ꎮ 结果表明:在 ＭＶＡ 代谢途径中ꎬ基因
ＨｂＡＡＣＴ１ꎬＨｂＡＡＣＴ２ꎬＨｂＨＭＧＳ１ꎬＨｂＨＭＧＳ２ꎬＨｂＨＭＧＲ１ꎬＨｂＨＭＧＲ３ꎬＨｂＭＶＫꎬＨｂＰＭＫꎬＨｂＭＶＤ１ꎬＨｂＭＶＤ２ 和 ＩＰＰ 下
游代谢基因 ＨｂＩＰＰＩ１和 ＨｂＦＤＰＳ１ 在胶乳中的表达量要相对高于其在悬浮细胞中的表达量ꎬ然而橡胶树悬浮
细胞中 ＭＥＰ 代谢途径基因 ＨｂＤＸＳ１ꎬＨｂＤＸＳ２ꎬＨｂＤＸＲꎬＨｂＣＭＳ１ꎬＨｂＣＭＳ２ꎬＨｂＣＭＫꎬＨｂＭＣＳ１ꎬＨｂＭＣＳ２ꎬＨｂＨＤＳꎬ
ＨｂＨＤＲ和鲨烯合酶基因 ＨｂＳＱＳ１的表达水平要相对高于胶乳ꎮ 而且 ＣＯＲ能不同程度地上调 ＨｂＨＭＧＲ５ꎬＨｂＨ￣
ＭＧＲ４ꎬＨｂＳＱＳ１ꎬＨｂＤＸＳ２和 ＨｂＤＸＲ基因的表达水平ꎮ 该研究结果为探索利用橡胶树悬浮细胞体系研究次生代
谢合成调控以及生产活性次生代谢产物奠定了基础ꎮ
关键词: 巴西橡胶树ꎬ 甲羟戊酸ꎬ 脱氧木酮糖￣５￣磷酸ꎬ 冠菌素ꎬ 鲨烯合酶基因
中图分类号: Ｑ９４５.４ꎬＱ７８６ 文献标识码: Ａ 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０４￣０４４９￣０７
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＭＶＡ ａｎｄ ＭＥＰ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｐａｔｈｗａｙｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｌａｔｅｘ ａｎｄ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ
ＤＥＮＧ Ｘｉａｏ￣Ｍｉｎꎬ ＷＵ Ｓｈａｏ￣Ｈｕａꎬ ＤＡＩ Ｘｕｅ￣Ｍｅｉꎬ ＴＩＡＮ Ｗｅｉ￣Ｍｉｎ∗
( Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｒｕｂｂｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ / Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｂａｓｅ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐｓ / Ｒｕｂｂｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｄａｎｚｈｏｕ ５７１７３７ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ＭＶＡ ａｎｄ ＭＥＰ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｒｅ ｔｗｏ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｌａｎｔ ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ. Ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎ ＭＶＡ ａｎｄ ＭＥＰ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｔｅｘ ａｎｄ ｓｕｓｐｅｎ￣
ｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｎｔｈｅｒ￣ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｑＲＴ￣ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ
ｏｆ ＨｂＡＡＣＴ３ꎬ ＨｂＨＭＧＲ４ꎬ ＨｂＨＭＧＲ５ꎬ ＨｂＤＸＳ２ꎬ ＨｂＤＸＲ ａｎｄ ＨｂＳＱＳ１ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ ＣＯＲ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＨｂＡＡＣＴ１ꎬＨｂＡＡＣＴ２ꎬＨｂＨＭＧＳ１ꎬＨｂＨＭＧＳ２ꎬＨｂ￣
收稿日期: ２０１５￣１０￣１３ 修回日期: ２０１５￣１２￣０８
基金项目: 国家自然科学基金(３１１７０６４２)ꎻ中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费(１６３００２２０１５０１０)[Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ(３１１７０６４２)ꎻ ｔｈｅ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ ｆｏｒ Ｒｕｂｂｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ ＣＡＴＡＳ(ＮＯ.１６３００２２０１５０１０)]ꎮ
作者简介: 邓小敏 (１９８５￣)ꎬ男ꎬ湖北荆州监利人ꎬ博士研究生ꎬ助理研究员ꎬ主要从事橡胶树分子生物学和次生代谢调控研究ꎬ (Ｅ￣ｍａｉｌ) ｄｘｍ￣
ｂｉｏ８２２＠ １６３.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 田维敏ꎬ博士ꎬ教授ꎬ主要从事橡胶树发育生物学研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗｍｔｉａｎ＠ １６３.ｃｏｍꎮ
ＨＭＧＲ１ꎬＨｂＨＭＧＲ３ꎬＨｂＭＶＫꎬＨｂＰＭＫꎬＨｂＭＶＤ１ꎬＨｂＭＶＤ２ ｉｎ ＭＶＡ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ＨｂＩＰＰＩ１ ａｎｄ ＨｂＦＤＰＳ１ ｇｅｎｅｓ
ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＩＰＰ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｌａｔｅｘ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓꎬ ｗｈｉｌｅ ＨｂＤＸＳ１ꎬＨｂＤＸＳ２ꎬＨｂＤＸＲꎬ
ＨｂＣＭＳ１ꎬＨｂＣＭＳ２ꎬＨｂＣＭＫꎬＨｂＭＣＳ１ꎬＨｂＭＣＳ２ꎬＨｂＨＤＳ ａｎｄ ＨｂＨＤＲ ｉｎ ＭＥＰ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ＨｂＳＱＳ１ ｗｅｒｅ ｒｅｌａ￣
ｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｌａｔｅｘ. Ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬ ＨｂＨＭＧＲ５ꎬ ＨｂＨＭＧＲ４ꎬ ＨｂＳＱＳ１ꎬ ＨｂＤＸＳ２ ａｎｄ ＨｂＤＸＲ
ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｉｇｈｌｙ ｏｒ ｔｏ ｓｏｍｅ ｄｅｇｒｅｅ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＣＯＲ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｌａｙｓ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒ￣
ｔｈｅｒ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ
ｆｒｏｍ ａｎｔｈｅｒ￣ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓꎬ ｍａｖａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄꎬ ｍｅｔｈｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬ ｃｏｒｏｎａｔｉｎｅꎬ ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ
甲羟戊酸(ｍａｖａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄꎬＭＶＡ)途径和脱氧木
酮糖￣５￣磷酸(ＤＸＰ)或甲基赤藓醇￣４￣磷酸(ｍｅｔｈｙｌ￣
ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬＭＥＰ)途径是植物细胞类异戊二
烯代谢途径中合成异戊烯基焦磷酸( ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙ ｌｐｙ￣
ｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬＩＰＰ)的两条重要来源ꎮ 其中ꎬＭＶＡ 代
谢途径位于细胞质中ꎬ以乙酰辅酶 Ａ 为代谢原料ꎻ
而 ＭＥＰ 代谢途径则位于质体中ꎬ以丙酮酸和甘油
醛￣３￣磷酸为代谢原料(王凌健等ꎬ２０１３ꎻＣｈｏｗ ｅｔ ａｌꎬ
２００７ꎬ２０１２)ꎮ 异戊烯基焦磷酸是合成植物萜类次
生代谢物的重要原料ꎬ而且异戊烯基焦磷酸的合成
和利用效率将直接影响到下游重要次生代谢产物的
产率ꎮ
巴西橡胶树是工业原料天然橡胶的主要来源ꎮ
乳管细胞细胞质———胶乳是合成天然橡胶(顺式异
戊二烯链)的主要场所ꎮ 天然橡胶生物合成是乳管
细胞中典型的植物类异戊二烯代谢途径ꎬ乳管细胞
中也存在ＭＶＡ和ＭＥＰ 代谢途径ꎬ其中ＭＶＡ代谢途
径是胶乳中合成天然橡胶的主要途径 (Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌꎬ
２００７ꎬ ２０１２)ꎮ 最近的研究发现胶乳中除了主要合
成天然橡胶分子外ꎬ同时还合成一些重要的萜类分
子ꎬ比如含量较高的角鲨烯 (梅志刚等ꎬ２０１１) (图
１)ꎬ并且胶乳中合成角鲨烯的关键基因 ＨｂＳＱＳ１ 已
被鉴定(张志平等ꎬ２０１４)ꎮ
橡胶树花药愈伤组织来源的悬浮细胞培养体系
已经成功建立ꎮ 目前主要用于原生质体融合和植株
再生研究(戴学梅等ꎬ２０１３)ꎬ其用于橡胶树次生代
谢研究还未见报道ꎮ 在同为天然橡胶合成(反式异
戊二烯链)的杜仲树中ꎬ已经有利用悬浮细胞生产
绿原酸的初步研究(王亚琴等ꎬ２００８)ꎮ 同时也有研
究表明茉莉酸作为诱导子能诱导重要次生代谢物的
合成(孙彬贤等ꎬ２０００ꎻ王焕等ꎬ２０１４)ꎮ 因此ꎬ本文
重点研究橡胶树胶乳和悬浮细胞中 ＭＶＡ和 ＭＥＰ 代
谢途径重要基因的表达模式ꎬ以及在悬浮细胞中茉
莉酸类似物———ＣＯＲ 对关键酶编码基因的表达调
控作用ꎬ为今后利用胶乳和悬浮细胞研究次生代谢
调控ꎬ同时为利用悬浮细胞生产生物活性物质奠定
前期实验基础ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料与试剂
橡胶树胶乳采集于中国热带农业科学院试验场
的橡胶树无性系热研 ８￣７９ꎬ橡胶树无性系热研 ８￣７９
花药愈伤组织来源的悬浮细胞由戴雪梅老师馈赠ꎮ
本实验所用生化试剂冠菌素为 Ｓｉｇｍａ 分析纯ꎬ所用
试剂盒为天根植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒ꎬＦｅｒｍｅｎｔａｓ
ｃＤＮＡ反转录试剂盒ꎬＴａｋａｒａ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ 荧光
定量 ＰＣＲ试剂盒为ꎬ引物为英骏公司合成ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 材料处理 将终浓度为 １ μｍＬ￣１的茉莉酸生
理活性类似物冠菌素 ( ｃｏｒｏｎａｔｉｎｅꎬＣＯＲ) 添加至橡
胶树悬浮细胞培养液中分别处理 ８ ｈꎬ１ ｄꎬ３ ｄꎬ５ ｄ
和 ７ ｄꎬ对照不添加 ＣＯＲꎬ为正常的悬浮细胞培养
液ꎮ 每个时间点取样后置于 １ ０００ ｒｍｉｎ￣１轻柔离
心ꎬ收集悬浮细胞放置液氮中速冻并保存于－８０ ℃
备用ꎮ 割胶后收集胶乳到预先添加提取液的无
ＲＮａｓｅ污染的离心管中ꎬ混匀置于－２０ ℃保存备用ꎮ
１.２.２ ＲＮＡ提取与 ｃＤＮＡ 合成 胶乳样品和悬浮细
胞样品的 ＲＮＡ提取利用天根植物总 ＲＮＡ提取试剂
盒ꎬ参照说明书上方法提取ꎬ所提取的 ＲＮＡ 经过琼
脂糖凝胶电泳确定完整性和无 ＤＮＡ污染ꎬ同时利用
Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ 核酸定量仪鉴定 ＲＮＡ 的含量和纯度ꎬ其
中 ＯＤ２６０ / ＯＤ２８０ 为 １.８ ~ ２.０ꎬ表明所提 ＲＮＡ 纯度
较高ꎬ符合后续实验要求ꎮ ｃＤＮＡ 第一链合成利用
Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ｃＤＮＡ第一链反转录试剂盒参照使用说明
书合成ꎮ
１.２.３ 荧光定量 ＰＣＲ 本实验涉及到的 ＭＶＡ 和
ＭＥＰ 代谢途径基因和橡胶树鲨烯合酶基因 ＨｂＳＱＳ１
的引物序列(表 １)主要来源于 ５ 篇已报道的文献
(Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌꎬ２００７ꎬ ２０１２ꎻ张志平等ꎬ２０１４ꎻＳａｎｄｏ ｅｔ ａｌꎬ
０５４ 广 西 植 物 ３６卷
表 １ 该研究使用的引物信息
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ
路径名
Ｐａｔｈｗａｙ ｎａｍｅ
基因名
Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
引物序列(５′－３′)
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′－３′)
ＭＶＡ代谢途径
ＭＶＡ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ
ＨｂＡＡＣＴ１
ＨｂＡＡＣＴ２
ＨｂＡＡＣＴ３
ＨｂＨＭＧＳ１
ＨｂＨＭＧＳ２
ＨｂＨＭＧＲ１
ＨｂＨＭＧＲ３
ＨｂＨＭＧＲ４
ＨｂＨＭＧＲ５
ＨｂＭＶＫ
ＨｂＰＭＫ
ＨｂＭＶＤ１
ＨｂＭＶＤ２
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ＨｂＭＶＤ２￣ｑＲＶ ＣＴＧＧＡＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＴＧ
ＭＥＰ 代谢途径
ＭＥＰ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ
ＨｂＤＸＳ１
ＨｂＤＸＳ２
ＨｂＤＸＲ
ＨｂＣＭＳ１
ＨｂＣＭＳ２
ＨｂＣＭＫ
ＨｂＭＣＳ１
ＨｂＭＣＳ２
ＨｂＤＸＳ１￣ｑＦＷ ＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＴ
ＨｂＤＸＳ１￣ｑＲＶ ＡＡＣＧＧＣＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴＴＡＡＧ
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ＨｂＤＸＲ￣ｑＦＷ ＡＣＣＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡＴＣＴＴＧＣＣＴＡＴＧ
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１５４４期 邓小敏等: 巴西橡胶树胶乳和悬浮细胞中 ＭＶＡ和 ＭＥＰ 代谢途径基因的表达分析
续表 １
路径名
Ｐａｔｈｗａｙ ｎａｍｅ
基因名
Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
引物序列(５′－３′)
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ(５′－３′)
ＨｂＨＤＳ
ＨｂＨＤＲ
ＨｂＨＤＳ￣ｑＦＷ ＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＡＣＣＣＡＡＴ
ＨｂＨＤＳ￣ｑＲＶ ＣＧＴＧＴＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＣ
ＨｂＨＤＲ￣ｑＦＷ ＴＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＡＧＧＴＣＣＣＡＴＴＡＣ
ＨｂＨＤＲ￣ｑＲＶ ＡＴＡＴＣＣＡＡＣＣＡＣＴＡＡＴＴＧＣＡＧＣＴＣ
ＩＰＰ 下游代谢基因和内参基因
ＩＰＰ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｇｅｎｅｓ
ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅｓ
ＨｂＩＰＰＩ１
ＨｂＩＰＰＩ２
ＨｂＦＤＰＳ１
ＨｂＳＱＳ１
Ｈｂ１８Ｓ
ＨｂＡＣＴＩＮ
ＨｂＩＰＰＩ１￣ｑＦＷ ＡＣＣＴＴＧＧＴＴＴＡＧＡＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＡＣ
ＨｂＩＰＰＩ１￣ｑＦＶ ＡＡＣＴＣＧＴＴＴＡＣＡＡＣＴＧＡＣＡＴＴＡＣＣＡ
ＨｂＩＰＰＩ２￣ｑＦＷ ＡＣＡＣＧＴＴＧＡＡＡＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＣ
ＨｂＩＰＰＩ２￣ｑＦＶ ＣＣＡＧＡＣＴＡＡＧＡＡＴＡＣＴＧＡＡＴＧＣＣＧ
ＨｂＦＤＰＳ１￣ｑＦＷ ＴＡＡＣＣＴＣＴＡＴＴＧＡＡＧＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧ
ＨｂＦＤＰＳ１￣ｑＦＶ ＴＴＣＡＧＣＧＴＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＴＴＧ
ＨｂＳＱＳ１￣ｑＦＷ ＧＡＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＴＧＴＣＣＴ
ＨｂＳＱＳ１￣ｑＲＶ ＧＣＣＡＡＡＡＣＡＴＧＣＧＴＧＡＣＴＴＡ
Ｈｂ１８Ｓ￣ｑＦＷ ＣＣＡＴＡＡＡＣＧＡＴＧＣＣＧＡＣＣＡＧ
Ｈｂ１８Ｓ￣ｑＲＶ ＣＡＧＣＣＴＴＧＣＧＡＣＣＡＴＡＣＴＣ
ＨｂＡＣＴＩＮ￣ｑＦＷ ＧＡＴＴＣＣＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣ
ＨｂＡＣＴＩＮ￣ｑＦＶ ＣＡＣＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＴＴＡＣＣ
２００８ａꎬｂ)ꎬ另外 ＨｂＭＶＤ１ 和 ＨｂＭＶＤ２ 基因序列来源
于 ＮＣＢＩ 数据库ꎬ 序列号分别为 ＪＮ０３６５３７ 和
ＪＮ０３６５３９ꎬ其特异性已经过序列比对ꎬ琼脂糖电泳和
测序分析ꎬ均为正确可用ꎮ 其中ꎬ内参基因的选择参
照伯乐 ＣＦＸ系列荧光定量 ＰＣＲ 仪中的分析软件说
明ꎬ选取两个内参基因(Ｈｂ１８Ｓ 和 ＨｂＡｃｔｉｎ 基因)用
于分析其他待研究基因的相对表达量ꎮ
荧光定量 ＰＣＲ反应的反应体系为 １０ μＬ:水 ３
μＬꎬ２×Ｔａｋａｒａ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ ５ μＬꎬ正反向引
物(１０ μｍＬ￣１)各 ０.５ μＬꎬｃＤＮＡ 模板 １ μＬꎮ 荧光
定量 ＰＣＲ反应在伯乐 ＣＦＸ系列荧光定量 ＰＣＲ仪上
运行ꎬＰＣＲ反应程序为 ９５ ℃预变性 ３ ｍｉｎꎬ９５ ℃变
性 １０ ｓꎬ６０ ℃退火 １５ ｓꎬ７２ ℃延伸 ３０ ｓꎬ４０ 个循环ꎻ
实验设 ３个重复ꎮ 利用仪器自带分析软件分析基因
的表达水平(ΔΔＣＴ 法)ꎬ其中以悬浮细胞为对照样
品检测所研究的目标基因与内参基因的相对表达量
作为目标基因的表达水平ꎮ
２ 结果与分析
２.１ ＭＶＡ代谢途径基因的表达分析
ＭＶＡ代谢途径就是将初始原料蔗糖转化为异
戊烯基焦磷酸 ＩＰＰ 的代谢途径ꎬ利用橡胶树在该代
谢通路中已发表的基因表达检测引物和新登录的基
因序列设计的引物ꎬ在胶乳和悬浮细胞中检测这些
基因的表达模式ꎬ结果发现 ＭＶＡ 代谢途径基因
ＨｂＡＡＣＴ１ꎬ ＨｂＡＡＣＴ２ꎬ ＨｂＨＭＧＲ１ꎬ ＨｂＨＭＧＲ３ꎬ
ＨｂＨＭＧＳ１ꎬＨｂＨＭＧＳ２ꎬ ＨｂＭＶＫꎬ ＨｂＰＭＫꎬ ＨｂＭＶＤ１ 和
ＨｂＭＶＤ２在胶乳中的表达量高于其在悬浮细胞中的
表达量(图 ２)ꎮ 这表明至少与悬浮细胞相比ꎬ橡胶
树乳管细胞的胶乳中 ＭＶＡ 途径基因的表达占优
势ꎬ表明在胶乳中相比 ＭＥＰ 代谢途径ꎬＭＶＡ 代谢途
径是主要的 ＩＰＰ 代谢途径ꎮ 而且 ＩＰＰ 下游代谢基因
ＨｂＩＰＰＩ１和 ＨｂＦＤＰＳ１ 在胶乳中的表达量也高于悬
浮细胞ꎬ这些结果表明胶乳中对蔗糖的转化利用效
率可能要高于悬浮细胞ꎮ 另外部分 ＭＶＡ 代谢途径
基因如 ＨｂＡＡＣＴ３ꎬＨｂＨＭＧＲ４ꎬＨｂＨＭＧＲ５ 和 ＨｂＩＰＰＩ２
在悬浮细胞中的表达量却相对高于其在胶乳中的表
达量ꎬ说明 ＭＶＡ 代谢途径部分基因的同源基因在
悬浮细胞中可能也发挥着重要的作用(图 ２)ꎮ
２.２ ＭＥＰ代谢途径基因的表达分析
定位于质体或叶绿体中的脱氧木酮糖￣５￣磷酸
(ＤＸＰ)或甲基赤藓醇￣４￣磷酸(ｍｅｔｈｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ ｐｈｏｓ￣
ｐｈａｔｅꎬ ＭＥＰ)途径是将初始原料丙酮酸和甘油醛￣３￣
磷酸转化为异戊烯基焦磷酸 ＩＰＰꎮ 同样地ꎬ利用橡
胶树该代谢通路中已发表的基因表达检测引物和新
登录的基因序列设计的引物ꎬ在胶乳和悬浮细胞中
检测这些基因的表达模式ꎬ结果发现 ＭＥＰ 代谢途径
２５４ 广 西 植 物 ３６卷
图 １ 橡胶树胶乳中 ＭＶＡ和 ＭＥＰ 代谢途径 引自 Ｓａｎｄｏ ｅｔ ａｌꎬ２００８ａꎬｂꎬ 略有改动ꎮ
Ｆｉｇ. １ ＭＶＡ ａｎｄ ＭＥＰ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｌａｔｅｘ ｏｆ Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ
Ｔｈｉｓ ｍａｐ ｗａｓ ｄｒａｗ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓａｎｄｏ ｅｔ ａｌꎬ ２００８ａꎬ ｂꎬ ｗｉｔｈ ｓｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ.
基因 ＨｂＤＸＳ１ꎬＨｂＤＸＳ２ꎬＨｂＤＸＲꎬＨｂＣＭＳ１ꎬＨｂＣＭＳ２ꎬ
ＨｂＣＭＫꎬＨｂＭＣＳ１ꎬＨｂＭＣＳ２ꎬＨｂＨＤＲ 和 ＨｂＨＤＳ 在悬
浮细胞中的表达量均高于其在胶乳中的表达量(图
３)ꎮ 这说明悬浮细胞在离体培养条件下 ＭＥＰ 代谢
途径基因的表达相比 ＭＶＡ 代谢途径基因更占优
势ꎬ悬浮细胞可能更倾向于利用 ＭＥＰ 途径生产其所
需的 ＩＰＰ 原料ꎮ 同时对 ＩＰＰ 下游代谢基因鲨烯合酶
基因 ＨｂＳＱＳ１的表达检测发现其在悬浮细胞中的表
达量也高于其在胶乳中的表达量(图 ３)ꎬ这些结果
说明胶乳系统中由于将 ＩＰＰ 主要用于合成天然橡
胶ꎬ一些其他的萜类化合物合成酶基因如鲨烯合酶
基因的表达可能会受到一定程度的抑制ꎮ 然而悬浮
细胞因为不能合成橡胶ꎬ其 ＩＰＰ 代谢流将转向其他
代谢分支ꎬ鲨烯合酶基因 ＨｂＳＱＳ１ 的表达量可能由
此升高ꎬ以上结果表明悬浮细胞中的两条 ＩＰＰ 代谢
途径与胶乳系统相比进行了调整ꎬ使得 ＭＥＰ 代谢途
径可能成为优势代谢途径ꎬ并且同时也加强了合成
下游次生代谢物比如角鲨烯的鲨烯合酶基因的
表达ꎮ
２.３ ＣＯＲ对橡胶树悬浮细胞中 ＭＥＰ 代谢途径关键
基因和ＭＶＡ代谢途径中优势表达基因的影响
茉莉酸及其结构类似物被证明通过上调植物次
３５４４期 邓小敏等: 巴西橡胶树胶乳和悬浮细胞中 ＭＶＡ和 ＭＥＰ 代谢途径基因的表达分析
图 ２ 橡胶树胶乳和悬浮细胞中 ＭＶＡ 代谢途径基因
的表达分析 ＬＴ代表胶乳ꎻ ＳＵＳ代表橡胶树花药愈伤组织来
源的悬浮细胞ꎮ 下同ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＭＶＡ ｍｅｔ￣
ａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｌａｔｅｘ ａｎｄ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｈｅｖｅａ ｂｒａ￣
ｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ＬＴ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｌａｔｅｘꎬ ＳＵＳ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆ
Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ. Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
图 ３ 橡胶树胶乳和悬浮细胞中 ＭＥＰ 代谢途径基因
的表达分析
Ｆｉｇ. ３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＭＥＰ
ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｌａｔｅｘ ａｎｄ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ
生代谢物合成关键酶基因的表达ꎬ进而诱导次生代
谢物的合成(王焕等ꎬ２０１４ꎻ魏洁书等ꎬ２０１４)ꎮ 本研
究分析茉莉酸的活性结构类似物 ＣＯＲ 对橡胶树悬
浮细胞中 ＭＥＰ 代谢途径关键基因 ＨｂＤＸＳ１ꎬＨｂＤＸＳ２
和 ＨｂＤＸＲꎬ ＭＶＡ 代谢途径中上调表达的基因
ＨｂＡＡＣＴ３ꎬＨｂＨＭＧＲ４和 ＨｂＨＭＧＲ５ꎬ以及角鲨烯合成
途径重要基因 ＨｂＳＱＳ１ 表达的影响ꎮ 结果发现ꎬ
１ μｍＬ￣１ ＣＯＲ对 ＨｂＨＭＧＲ５基因表达的诱导最强ꎬ
其次是 ＨｂＨＭＧＲ４ 基因ꎬ而对 ＨｂＳＱＳ１ꎬＨｂＤＸＳ２ 和
ＨｂＤＸＲ基因的诱导作用相对较弱ꎮ ＨｂＡＡＣＴ３ 基因
的表达呈现“振荡表达模式”ꎬ其诱导作用也较弱
(图 ４)ꎮ 这表明 ＣＯＲ对橡胶树悬浮细胞 ＭＥＰ 代谢
通路关键基因具有一定程度的诱导作用ꎬ而且 ＣＯＲ
对悬浮细胞中 ＭＥＰ 和 ＭＶＡ代谢通路内部分基因都
能诱导表达ꎬ不局限于特定诱导或调控其中一种代
谢通路ꎮ 通过对这两条代谢通路基因的诱导ꎬ特别
是诱导鲨烯合酶基因 ＨｂＳＱＳ１ 的表达ꎬＣＯＲ 很有可
能有助于提高橡胶树悬浮细胞中角鲨烯或其他次生
代谢物质的合成ꎮ
３ 讨论
橡胶树乳管是橡胶树树皮中的一种特化组织ꎬ
具有抵御外界刺激的作用ꎬ因此是一种重要的保护
组织ꎮ 胶乳是乳管中的细胞质组分ꎬ其中主要合成
天然橡胶分子(何康和黄宗道ꎬ１９８７)ꎮ 胶乳中虽然
存在 ＭＥＰ 代谢途径基因表达ꎬ但是 ＭＶＡ 代谢途径
仍然是胶乳中合成天然橡胶分子的主要途径(Ｃｈｏｗ
ｅｔ ａｌꎬ２００７ꎬ ２０１２)ꎮ 橡胶树花药愈伤组织来源的悬
浮细胞体系实验系统已经成功建立ꎬ但尚不清楚
ＭＶＡ代谢途径在橡胶树悬浮细胞中是否也是主要
异戊二烯代谢途径ꎮ 本研究对 ＭＶＡ和 ＭＥＰ 代谢途
径基因在胶乳系统和悬浮细胞系统中的表达水平进
行比较ꎬ发现了新的现象:与胶乳系统不同ꎬ体外离
体培养的橡胶树悬浮细胞中 ＭＥＰ 代谢途径基因的
表达量比 ＭＶＡ 代谢途径基因的表达量高ꎬ说明不
是所有的组织都主要采用 ＭＶＡ 代谢途径来生产
ＩＰＰ 原料分子ꎬ悬浮细胞作为离体组织细胞有它自
身的内在特征ꎬ利用这一体系进行实验需要先了解
这个体系的本身特征ꎬ而不能照搬已有的认识ꎮ 因
此ꎬ本研究有助于对橡胶树悬浮细胞和胶乳中差异
代谢途径特征的认识ꎬ对其他植物悬浮细胞体系的
研究和利用也具有一定的借鉴意义ꎮ
悬浮细胞已经被用来研究和生产重要次生代谢
产物(孙彬贤等ꎬ２０００ꎻ王亚琴等ꎬ２００８)ꎮ 为提高所
需次生代谢物质的含量需要添加各种诱导物ꎬ其中
茉莉酸及其类似物是广泛使用的诱导剂ꎬ能够促进
次生代谢物合成基因的表达ꎬ并提高其含量ꎮ 如茉
莉酸能促进南方红豆杉(Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｖａｒ. ｍｅｉｒｅｉ)
悬浮细胞中抗癌物质紫杉醇的积累 (孙彬贤等ꎬ
２０００)ꎮ 本研究分析了茉莉酸活性结构类似物———
ＣＯＲ对在橡胶树悬浮细胞中优势表达和一些关键
酶编码基因的转录调节作用ꎬ结果发现 ＣＯＲ能同时
诱导 ＭＥＰ 和 ＭＶＡ代谢途径的基因ꎬ 表明这种诱导
４５４ 广 西 植 物 ３６卷
图 ４ ＣＯＲ对 ＭＥＰ 代谢途径关键基因和其它在悬浮细胞中富集表达基因的调节
Ｆｉｇ. ４ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＯＲ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｋｅｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＭＥＰ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｐａｔｈｗａｙ ｏｒ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ
效应不仅仅局限于某一个基因或某一类代谢途径ꎬ
这样可能更有利于增强植物的次生代谢ꎮ 因此相比
某一特定次生代谢产物的积累ꎬ茉莉酸及其结构类
似物可能更多的是一种通用的促进剂或诱导剂ꎮ
角鲨烯虽然在胶乳中的含量已被测定ꎬ但是胶
乳中提取利用该物质目前还有一定的难度ꎮ 而橡胶
树悬浮细胞也检测到鲨烯合酶基因 ＨｂＳＱＳ１ 的表
达ꎬ同时也受 ＣＯＲ 诱导ꎬ这些实验结果将为利用悬
浮细胞体系生产角鲨烯等活性次生代谢物质奠定重
要的前期研究基础ꎮ
参考文献:
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(下转第 ３９６页 Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｏｎ ｐａｇｅ ３９６)
５５４４期 邓小敏等: 巴西橡胶树胶乳和悬浮细胞中 ＭＶＡ和 ＭＥＰ 代谢途径基因的表达分析