全 文 ：一个巴西橡胶树钙调素基因假基因的识别?
张治礼1 , 2 , 苏火生1 , 李维国3
(1 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 , 海南 海口 571101; 2 海南省农业科学院 , 海南 海口 571100;
3 中国热带农业科学院橡胶研究所 , 海南 儋州 571737 )
摘要 : 以巴西橡胶树 ( Hevea brasiliensis) 基因组 DNA 为模板 , 根据胶乳钙调素基因 HbCaM 序列设计引物 ,
利用 PCR 方法克隆获得了 1 319 bp和 447 bp的两个 DNA 片段。序列分析表明 , 1 319 bp的 DNA 长片段为胶
乳钙调素基因 HbCaM 的 DNA 片段 , 含有两个外显子 ( 77 bp和 373 bp) 和 1 个内含子 ( 869 bp) , 包含了
HbCaM cDNA 编码区 447 bp 的全部序列 ; 447 bp的 DNA 小片段与 HbCaM cDNA 核苷酸序列同源性高达
98% , ORF分析发现 , 位于 406 bp处的碱基 C 突变为 T, 即三联体密码 CAG 突变为终止子 TAG使翻译提前
终止 , 其余 5 个差异碱基都不影响或改变正常的翻译。推测此 447 bp的 DNA 片段为巴西橡胶树钙调素 Hb-
CaM 基因的假基因 , 命名为 HbCaMP1。
关键词 : 巴西橡胶树 ; 钙调素基因 ; 假基因
中图分类号 : Q 753 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2008) 03 - 340 - 05
Identification of a Pseudogene of Calmodulin Gene
in Hevea brasiliensis (Euphorbiaceae)
ZHANG Zhi-Li1 , 2 , SU Huo-Sheng1 , LI Wei-Guo3
( 1 Instituteof Tropical Bioscienceand Biotechnology, ChineseAcademy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101 , China;
2 Hainan Academy of Agricultural Sciences, Haikou 571101 , China; 3 Rubber Research, Institute
Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737 , China)
Abstract: Employing a pair of primers designed fromcDNA of a HbCaM gene, two1371 bp and447 bp-length fragments
were isolated fromgenome DNA in Hevea brasiliensis . Sequenceanalysis showed that the longer fragment was the HbCaM
gene with 2 exons ( includingthe77 bpand373 bp-lengthfragments) andan869 bp-length intron, andthe shorter fragment
had 98% identitywith cDNA sequence of HbCaM gene . Compared to cDNA of the HbCaM gene, 6 mutated nucleotides
were identified in the447 bp-length fragment, in whichT mutated fromC at 406 bp site ledto theoccurrence of stop codon
TAG in advance . The 447 bp- length fragment was hereby suggested to be a pseudogene of the HbCaM gene in H. b-
rasiliensis, named HbCaMP1 , which wasthefirst pseudogenein identified H. brasiliensisgeonomeand thefirst homological
pseudogene of CaM genes isolated in plant .
Key words: Hevea brasiliensis; Calmodulin gene; Pseudogene
假基因存在于大多数植物基因组中 , 目前
已从拟南芥、水稻、小麦等植物中发现了大量功
能基因的假基因。如 Andrson and Green (1997 )、
Bustosa等 ( 2000 )、Wan 等 ( 2002 ) 、陈凡国等
(2005) 分别从小麦基因组中克隆到胚乳贮藏蛋
白、醇溶蛋白、麦谷蛋白亚基等功能基因的系列
假基因等 ; 许多学者在研究高等植物 ITS 序列时
也发现了大量假基因的存在 , 并从不同角度探讨
云 南 植 物 研 究 2008 , 30 (3) : 340～344
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2008.07203
? ?基金项目 : 海南省教育厅科技基金 (Hjkj2006024 ) 和国家自然科学基金 ( 30760197) 项目
收稿日期 : 2007 - 09 - 14 , 2007 - 10 - 23 接受发表
作者简介 : 张治礼 (1970- ) 男 , 博士 , 副研究员, 主要从事植物发育生物学、林木分子生物学研究。E-mail : zzl— catas@ hotmail. com
了 ITS 区假基因形成的分子机制及其在进化过程
中的意义 (Mayol 等 , 2001; Wei 等 , 2003; Kumar
等 , 2004; 阚显照等 , 2007)。虽然目前已积累了
大量关于假基因的数据和信息 , 但关于假基因的
确切生理功能及其调控机制目前仍在推测阶段
(Evgeniy 等 , 2003; Hirotsune 等 , 2003) , 对其认
识及研究仍待进一步深入。
乙烯利刺激可以促进巴西橡胶树胶乳增产。
施用乙烯利后巴西橡胶树钙调素蛋白分配发生明
显改变 , 以及钙调素参与橡胶生物合成关键酶
———HMG-CoA 还原酶活性的调节 ( Witisuwanna-
kul , 1990) 表明 , 钙调素及其相关蛋白激酶可能
参与了乙烯利刺激巴西橡胶树胶乳增产过程中的
分子调控和信号转导。本研究在分离巴西橡胶树
钙调素基因的过程中 , 首次分离、识别了一个巴
西橡胶树钙调素基因的假基因 ( pseudogene) Hb-
CaMP1 , 这也是首次报道巴西橡胶树基因组中存
在假基因以及植物钙调素基因存在有相应的假
基因。
1 材料与方法
1 .1 植物材料
巴西橡胶树 ( H. brasiliensisMull . Arg .) 无性系 7～33
～97 种植于中国热带农业科学院橡胶研究所试验基地。
以胶乳和幼嫩叶片为材料分别提取总 RNA 和 DNA。
1 .2 实验试剂
反转录试剂盒购自 Promega公司 , PCR 试剂购自上
海申能博彩公司 , DEPC、IPTG 和 X-Gal 等购自上海生物
工程公司 , 其他常规生化试剂均为国产分析纯试剂。
1 .3 巴西橡胶树基因组 DNA 和总 RNA 提取
利用张治礼等 (2007) 的方法提取巴西橡胶树胶乳
总 RNA , 利用 Promega公司提供的反转录试剂盒并参照
说明书反转录合成 cDNA 第一链 ; 利用常规 SDS 法提取
巴西橡胶树叶片基因组 DNA。
1 .4 巴西橡胶树胶乳钙调素基因 cDNA 克隆
根据 GenBank中公布的巴西橡胶树胶乳钙调素基因
cDNA 序 列 (注 册 号 为 AY830128 ) 设计 引 物 P1: 5′-
GGCATGGCGGATCCGCTCACCGACGA -3′和 P2: 5′-TCCCTACT-
TGGCCATCATGACCTTG -3′, 委托上海申能博彩公司合成。
以从巴西橡胶树胶乳中提取的 RNA 反转录 cDNA 为
模板克隆钙调素基因 cDNA。扩增程序为 : 94℃预变性 3
min, 94℃变性 30 s, 55℃退火 30 s, 72℃延伸 60 s, 30 个循
环后 72℃保温 7 min。取 5μl PCR 反应液电泳检测。
1 .5 巴西橡胶树钙调素蛋白基因 DNA 片段克隆
以巴西橡胶树叶片 DNA 为模板 , 利用引物 P1?P2 克
隆钙调素基因 DNA 片段。扩增程序为 : 94℃预变性 4
min, 94℃变性 30 s, 52℃退火 30 s, 72℃延伸 3 min, 30 个
循环后 , 72℃保温 7 min。取 5μl PCR 反应液电泳检测。
1 .6 序列分析
利用 GenBank 提供的 Blast、ORF、Alingment 等分析
程序对序列进行分析。
2 结果与分析
2 .1 钙调素基因 cDNA 克隆
以从巴西橡胶树胶乳中提取的 RNA 反转录
cDNA 第一链为模板 , 利用 P1?P2 引物扩增获得
了一条长约 450 bp的特异性条带 ( 图 1 )。回收
克隆并测序 , 利用 GenBank 提供的软件分析表
明 , 此片段为巴西橡胶树钙调素基因 cDNA 447
bp的编码区全长序列 , 与 GenBank 公布的巴西
橡胶树钙调素基因 ( 注册号为 AY830128 ) 序列
具有 100%的同源性。
图 1 巴西橡胶树钙调素基因 cDNA 编码区全长克隆
(1 , PCR 扩增产物 ; M , Marker)
Fig . 1 cDNA fragment of full ORF encoding calmodulin from
H. brasiliensis (1 , PCR product; M, Marker)
2 .2 钙调素基因 DNA 片段克隆及其假基因识别
以叶片基因组 DNA 为模板、P1?P2 为引物 ,
扩增了钙调素基因的 DNA 片段。图 2 显示 , 有
两条特异性较强的条带获得扩增。测序结果表
明 , 扩增的大片段含有 1 319 个碱基 , 包含了上
述钙调素基因 cDNA 编码区 447 bp的全部序列 ,
但被一条 869 bp的内含子隔开 , 即巴西橡胶树胶
乳钙调素基因 HbCaM 含有两个外显子 (77 bp和
373 bp) 和 1 个内含子 (869 bp)。扩增的 DNA 小
片段与上述克隆的巴西橡胶树钙调素基因 Hb-
CaM cDNA 编码区大小完全相同 , 核苷酸同源性
1433 期 张治礼等 : 一个巴西橡胶树钙调素基因假基因的识别
图 2 巴西橡胶树钙调素基因 DNA 序列克隆
( 1 , PCR 产物 ; M, Marker)
Fig . 2 DNA fragments of calmodulin gene amplified from
H . brasiliensis genome ( 1 , PCR products; M , Marker)
高达 98% ( 图 3) , 仅有 6 个碱基的差异。ORF
分析及推导氨基酸序列时发现 , 该片段在 406 bp
处的碱基 C 突变为 T, 即由 CAG 突变成为终止
子 TAG使翻译提前终止。其余 5 个差异碱基都
没有影响或改变氨基酸的翻译 , 其余推导的编码
氨基酸与上述克隆的钙调素蛋白基因 cDNA 编码
区编码的氨基酸完全相同 ( 图 4 )。
假基因主要包括以下几种类型 : (1) 没有内
含子、原来基因内的蛋白转译区含有一个或数个
蛋白转译终止码的基因 ; (2) 虽然含有数个外显
子 , 但其基因前无具有功能的启动子 , 或是原来
基因内的蛋白转译区含一个或数个蛋白转译终止
码 , 或缺少可信的基因外显子的基因 ; (3) 没有
图 3 巴西橡胶树钙调素基因 HbCaM cDNA 编码区与预测的钙调素假基因的序列比较
Fig . 3 Alignment of calmodulin gene cDNA ORF and predicted pseudogene from H . brasiliensis
243 云 南 植 物 研 究 30 卷
图 4 巴西橡胶树钙调素假基因编码氨基酸预测
(406 bp 处的 C 突变为 T , 即密码子 CAG 突变为终止密码子 TAG使翻译提前终止 )
Fig . 4 Predicted amino acid sequence from deduced CaM pseudogene from H . brasiliensis
( C mutated to T at 406 bp site results in stop codon TAG)
内含子的基因 , 其 最后一个外显 子含有 Poly
(A) , 基因前无可信度高、具有功能的启动子 ;
(4) 已知位于其他染色体上的基因 , 在一持续性
异染色质 ( constitutive heterochromatin) 上存在的
复本基因也被称为假基因 ( 许亮等 , 2003; 黄志
华和薛庆中 , 2006 ) 。本研究获得的 447 bp 的
DNA 小片段完全符合假基因类型 ( 1 ) 的定义 ,
推测认为这条与钙调素基因 cDNA 高度同源、没
有内含子、蛋白转译区含有一个蛋白转译终止码
的 DNA 片段是巴西橡胶树钙调素 HbCaM 基因相
应的假基因 , 根据假基因的命名法则命名为 Hb-
CaMP1 (GenBank 注册号为 EU219367 ) ( 许亮等 ,
2003; 黄志华和薛庆中 , 2006 )。
3 讨论
假基因的概念最初由 Jacq 等 ( 1977 ) 提出。
自 1977 年在爪蟾的 5S 基因系统中发现假基因以
来 , 人们已在线虫、果蝇、酵母基因组、人类基
因组以及拟南芥、水稻等植物基因组中发现了大
量假基因的存在。假基因普遍存在 , 但关于假基
因的确切功能目前并不清楚。现在大家公认假基
因并不是冗余基因 , 假基因的存在可能为物种进
化的正选择、负选择以及中性漂变提供了丰富的
材料 , 从而成为物种进化不可缺少的有用工具
(Emile, 2002; Hirotsune等 , 2003) 。有报道认为 ,
假基因可以作为细胞内的抑制因子而存在 , 并推
测假基因可能从反义链上转录了其功能基因相应
的转录产物 , 类似反义 RNA 形式阻止了相应正
常基因的表达 ( Evgeniy等 , 2003)。我国学者 Shi
等 ( 2005) 发现 , 病原菌诱导条件下水稻 TNP2
类转座酶的假基因 Rim2- 42 因子可以被诱导表
达 , 其转录本被选择性剪接和加尾且在不同的水
稻亚种中的剪接方式也不相同 , 可以形成 7 种不
同的转录本结构。这一发现暗示 , 假基因不仅具
3433 期 张治礼等 : 一个巴西橡胶树钙调素基因假基因的识别
有特定的生理或调控功能 , 其功能可能具有多样
性。根据现有的数据和证据推测 , 通过假基因的
表达调控正常基因的作用有可能是生物界普遍存
在的另一种新的调控模式或调控途径 , 这一推测
如果能最终得到证实 , 将使我们不得不重新审视
生物基因调控的复杂性 , 具有重要的理论意义。
钙调素广泛存在于生物体内 , 是一类保守的
钙离子结合蛋白 , 在钙信号传导过程中发挥重要
的作用。乙烯利刺激巴西橡胶树后钙调素蛋白分
配发生明显改变 , 以及钙调素参与橡胶生物合成
关键酶 HMG-CoA 还原酶活性的调节 ( Witisuwan-
nakul , 1990) 表明 , 巴西橡胶树钙调素基因可能
是乙烯利刺激巴西橡胶树的响应基因之一并参与
了橡胶生物合成的调控。研究巴西橡胶树钙调素
蛋白及其相关基因 , 有助于我们了解乙烯利刺激
巴西橡胶树增产的分子机制。本研究报道了巴西
橡胶树钙调素基因的结构及其相应假基因的存
在 , 对我们正确认识巴西橡胶树钙调素基因功能
与调控、钙调素基因进化等具有积极意义。
〔参 考 文 献〕
Andr son OD, Green EFC , 1997 . The characterization and comparative
analysis of high molecular weight glutenin genes fromgenomes A and
B of a hexaploid breadwheat [ J ] . Theor Appl Genet, 77 : 689—700
Bust ?osaD, Rubio P , Jouve N , 2000 . Molecular characterization of the
inactive allele of thegene Glu2A1 and the development of a set of A
S2PCR markers for HMW glutenins of wheat [ J ] . Theor Appl Genet,
100 : 1085—1094
Chen =FG (陈凡国 ) , Zhu XY (朱翔宇 ) , Xia GM ( 夏光敏 ) , 2005 .
Sequence of anew HMW gluten in subunit gene in Haynald iavillosa
[J ] . Acta Bot Boreal-Occident Sin ( 西北植 物学报 ) , 25 ( 7 ) :
1410—1414
Emil ?e Zuekerkandl, 2002 . Why so many noncoding nucleotides ? The eu-
karyotegenome as an epigenetic machine [ J ] . Genetica, 115: 105—129
Evge ?niy S, Balakirew, Francisco J et al. , 2003 . Pseudogene: are they
“ junk”or functional DNA ? [ J ] . Ann Rev Genet, 37 : 123—151
Hiro ?tsune S, Yoshida N , Chen A et al. , 2003 . An expressed pseudogene
regulates the messenger-RNA stability of its homologous coding gene
[ J ] . Nature, 423 (6935) : 91—96
Huan ?g ZH (黄志华 ) , Xue QZ ( 薛庆中 ) , 2006 . Composition and dis-
tribution of pseudogenes and their molecular evolution [ J ] . Chin
Bull Bot (植物学通报 ) , 23 ( 4) : 402—408
J acq ?C , Miller JR , BrownleeGG, 1977 . A pseudogene in 5SDNA of Xe-
nopus Laevis [ J ] . Cell , 13 : 109—120
Kan ?XZ (阚显照 ) , Qiao CY ( 乔才元 ) , Zhu GP ( 朱国萍 ) et al. ,
2007 . Molecular clone and sequencing analysis on pseudogenized
copy of nrDNA ITS region in Nothotsuga longibracteata [ J ] . Acta
Laser Biol Sin ( 激光生物学报 ) , 16 ( 2) : 208—215
Kuma ?r S , Tamura K , Neim M, 2004 . Integrated software for molecular
evolutionary genetics analysis and sequence alignment [ J ] . Brief
Bioinform, 5 (2 ) : 150—163
Mayo ?l M , Rossello JA , 2001 . Why nuclear ribosomal DNA spacers ( ITS)
tell different stories in Quercus [ J ] . Mol Phylogenet Evol, 19 (2) :
167—176
Shi ?XR , Li Q, He ZH , 2005 . Stress- induced Rim2?Hipa pseudogene of
rice exhibits alternative tailing and splicing during transcription [ J ] .
J Plant Physiol Mol Biol , 31 ( 6) : 607—614
Wan ?Y , Wang D, Shewry PR et al., 2002 . Isolation and characterization
of five novel high molecular weigh t subunit of glutenin genes from
Triticumtimopheevi and Aegilop scylindrical L . [ J ] . Theor Appl
Genet, 104 : 828—839
Wei ?XX, Wang XQ, Hong DY , 2003 . Marked intragenomic heterogene-
ity and geographical differentiation of nrDNA ITS in Larix potaninii
( Pinaceae) [ J ] . J Mol Evol , 57 ( 6) : 623—635
Witi ?suwannakul R , 1990 . Hevea calmodulin regulation of the activity of
latex HMG-C0A reductase [ J ] . Phytochemistry, 29 : 1755—1758
Xu L ?(许亮 ) , Lu XY ( 卢向阳 ) , Yi K ( 易克 ) et al. , 2003 . On re-
search progresses on pseudogene [ J ] . Chemistry of Life (生命的化
学 ) , 23 ( 6) : 406—409
Zhan ?g ZL (张治礼 ) , Yan Y (杨云 ) , LiuKC (刘宽灿 ) et al. , 2007 .
A rapid and efficient protocol for total RNA isolation from latex of
Hevea brasiliensis [ J ] . Chin Bull Bot ( 植物学通 报 ) , 24 ( 4 ) :
516—520
443 云 南 植 物 研 究 30 卷