全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 9 期, 2010 年 9 月 933
收稿 2010-04-01 修定 　2010-06-12
资助 江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室开放基金
(HZHL0807)和作物遗传与种质创新国家重点实验室开
放基金(ZW2 00 70 0 3)。
* 通讯作者(E-mail: qyang19@njau.edu.cn; Tel: 025-84395221)。
马铃薯 StAP1基因的分子克隆与表达分析
樊春媛 1, 印敬明 1, 王冰 1, 韦青 1, 李根涛 1, 张云峰 1,2 , 杨清 1,*
1 南京农业大学生命科学学院, 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 南京 210095; 2 江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重
点实验室, 江苏淮安 223300
提要: 采用 RT-PCR方法从马铃薯品种 ‘Désirée’中克隆了 StAP1 cDNA序列(GenBank登录号GU220568)。该基因 cDNA
开放阅读框长度为735 bp, 编码一个由244个氨基酸残基组成的蛋白, 该蛋白分子量为28.57 kDa, 理论等电点为8.32。StAP1
蛋白含有 1个高度保守的MADS结构域, 与烟草NAP1具有较高一致性。组织表达分析显示, StAP1在马铃薯植株的顶芽、
花和叶中有较高水平的转录表达, 在块茎中有微量表达。利用反义StCOL转基因马铃薯植株进一步分析表明, StAP1的表
达受 StCOL的调控。
关键词: 马铃薯; StAP1; 克隆; 表达
Molecular Cloning and Expression Analysis of a Potato StAP1 Gene
FAN Chun-Yuan1, YIN Jing-Ming1, WANG Bing1, WEI Qing1, LI Gen-Tao1, ZHANG Yun-Feng1,2, YANG Qing1,*
1State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University,
Nanjing 210095, China; 2Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural Biotechnology around Hongze Lake, Huaian, Jiangsu
223300, China
Abstract: A homologue of APETALA1 gene, designated StAP1, was isolated from potato ‘Désirée’ (Solanum
tuberosum) by RT-PCR (GenBank accession number GU220568). The ORF of the StAP1 was 735 bp long and
encoded a putative protein of 244 amino acids with a molecular weight of 28.57 kDa and a theoretical pI of
8.32. StAP1 protein contained a conserved MADS domain and had a high identity with AP1 homologous mem-
ber from tobacco. Analysis on the mRNA level of StAP1 showed that it was highly expressed in leaves, apical
buds and flowers, and was expressed at lower levels in tubers. Further analysis with StCOL-antisense transgenic
potato plants indicated that StAP1 expression was regulated by StCOL.
Key words: potato; StAP1; cloning; expression
高等植物花的形成是一个非常复杂的生物学
过程, 它是一个由一系列内源因子和环境信号介导
的复杂的网络通路。花分生组织决定基因
APETALA1 (AP1)是植物从营养生长向生殖生长转
换的关键性因子, 它一方面启动了花分生组织的发
育, 另一方面也对花器官分化起了决定作用。AP1
的突变不仅抑制了花分生组织的形成, 部分花成为
花序; 也使花器官的萼片与花瓣发育异常(Bowman
等 1993; Liu 等 2007)。
AP1 的表达受它的上游因子诱导。在长日照
条件下, 光促使 CONSTANS (CO)表达, CO 又促使
叶片成花素 FT (FLOWERING LOCUS T)表达
(Valverde 等 2004)。FT 蛋白作为系统的信号分子
沿韧皮部向顶端分生组织移动(Corbesier 等 2007),
与优先在顶端分生组织表达的bZIP转录因子FD互
作, 形成的 FT/FD 辅因子激活 AP1 表达, 并直接诱
导花芽分化和开花(Abe 等 2005; Wigge 等 2005;
Blázquez 等 2006)。AP1 的表达受 LEAFY (LFY)的
正向调节, LFY 可直接促进 AP1 的转录(Parcy 等
2002)。
目前除拟南芥(Mandel等1992)外, AP1同源基
因已在金鱼草(Huijser 等 1992)、花椰菜(Anthony
等 1995)、烟草(Jang等 1999)、苹果(van der Linden
等 2002)、小麦(Yan 等 2003)、水稻(Fornara 等
2004)、菊花(Shchennikova 等 2004)、槐树(Song
等 2008)、大枣(Sun 等 2009)等许多植物中被克
隆。过表达 AP1 的转基因植株较野生型营养生长
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时间大大缩短, 花期均出现不同程度的提前(Mandel
和 Yanofsky 1995; Peña 等 2001; Ellul 等 2004)。
马铃薯为茄科茄属一年生草本植物, 是一种重
要的粮蔬兼用作物。它既可以利用块茎进行无性
繁殖, 也可以开花产生种子进行有性繁殖。块茎的
形成受到许多因素的影响, 包括日照长度、土壤含
氮水平、植物激素以及赤霉素等(Sarkar 2008)。
Rodríguez-Falcón 等(2006)认为马铃薯开花与块茎
发育存在相似的信号途径, 即由光敏色素PHYB介
导的 CO/FT 途径。目前, 马铃薯的 CO 同源基因
StCOL已经被克隆, 该基因在块茎发育的各个时期
均有表达(Guo等 2007)。AP1是CO介导的开花调
控途径中的下游基因, 为了弄清AP1与马铃薯块茎
形成的关系, 本文采用 RT-PCR 方法, 从马铃薯栽
培品种 ‘Désirée’中克隆StAP1基因, 并对其表达特
征及与块茎形成的关系进行了初步分析。
材料与方法
试验材料马铃薯(Solanum tuberosum L.)栽培
品种 ‘Désirée’ 和 ‘Désirée’的反义 StCOL转基因株
系由本实验室保存。2009 年 3 月将带有芽眼的块
茎切块种于大棚内, 自然光照, 常规管理。在开花
期分别取其根、茎、叶、花、顶芽, 经液氮速
冻后, 在-70 ℃保存, 用于基因克隆和不同组织中
表达分析。在采收期分别取马铃薯的起始匍匐
茎、延伸匍匐茎、膨大匍匐茎、初始块茎和成
熟块茎, 液氮速冻后, 置-70 ℃保存, 用于块茎形成
过程中的基因表达分析。
以顶芽为材料提取总RNA, 提取按照Invitrogen
公司的Trizol试剂盒的说明书进行。cDNA第一链
的合成按照Promega公司Reverse Transcription Sys-
tem说明书进行。StAP1 cDNA 保守区段的扩增使
用基于对 GenBank 中已有的拟南芥(Arabidopsis
thaliana, Z16421)、烟草(Nicotiana tabacum,
AF009127)、苹果(Malus × domestica, EU672877)、
甜橙(Citrus sinensis, AY338974)、葡萄(Vitis
vinifera, AY538746)、枇杷(Eriobotrya japonica,
AY880261)和甘蓝(Brassica oleracea, BOU67451) 的
AP1 mRNA序列比对结果设计的一对保守引物A1:
5 ATAGAGAACAAGATCAATAGACAAG 3 和A2:
5 TCTCCTTAATCTTCTTTGATAGCAT 3。PCR
扩增程序如下: 94 ℃预变性 5 min; 94 ℃变性 30 s,
46 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 30 s, 30 个循环; 72 ℃保
温 10 min。
根据获得的StAP1 cDNA保守片段序列和番茄
AP1 同源基因 LeMADS-MC 序列(AF448521 ,
Vrebalov等2002)设计引物A3: 5 ATGGGAAGAG-
GAAAAGTTGAATTAAG 3 和 A4: 5 TCATAGA-
TGTTTATTCATGTTGTAAAGTGG 3。扩增StAP1
cDNA 全长序列, PCR 条件为: 94 ℃预变性 5 min;
94 ℃变性 40 s, 55 ℃退火 40 s, 72 ℃延伸 40 s, 30
个循环; 72 ℃保温 10 min。
克隆的PCR 产物利用DNA片段纯化回收试剂
盒(TianGen公司)回收, 然后连接到 pMD18-T载体
(TaKaRa 公司), 转化大肠杆菌 DH5α, 经蓝白斑筛
选和 PCR 检测, 阳性克隆送华大基因进行测序。
StAP1 基因生物信息学分析采用下列方法: (1)
序列同源性比对由NCBI的BLAST程序进行(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。(2)开放阅读框架预
测由NCBI的ORFfinder程序进行(http://www.ncbi.
nih.gov/gorf/gorf.html)。(3)蛋白质一级结构(等电
点、分子量)的预测由 ProtParam完成(http://www.
expasy.org/tools/protparam.html)。(4)蛋白质序列区
域(domains)分析由 Smart 完成(http://smart.embl-
heidelberg.de/smart/)。(5)蛋白质三级结构预测由
Swiss Model Server 完成(http://swissmodel.expasy.
org/)。(6)氨基酸的多序列比较和进化树的构建由
DNAMAN-Tree View 程序完成。
基因表达分析采用半定量 RT-PCR, 内参为
GAPDH 基因, 引物分别为 GAPDHS: 5 TCAAC-
GAGAATGAATACAAGCCA 3 和 GAPDHA: 5
TCGACAACAGAAACATCAGCAGT 3, PCR条件
为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃ 40 s, 53 ℃ 40 s, 72 ℃
40 s, 26 个循环; 72 ℃ 10 min。利用引物 A3 和
A4 进行半定量 RT-PCR 分别检测 StAP1 基因在不
同马铃薯组织中的表达。PCR 扩增条件为 94 ℃
预变性 5 min; 94 ℃ 40 s, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 40 s, 28
个循环; 72 ℃ 10 min。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝
胶电泳检测。
结果与讨论
1 StAP1基因的克隆
根据来自其他植物的 AP1 保守区段序列设计
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引物, 以马铃薯 cDNA第一链为模板, 进行 RT-PCR
扩增, 得到约 500 bp 的片段。根据获得的保守区
片段序列分析, 发现与番茄AP1同源基因LeMADS-
MC 序列相似度达到近 97%, 按照番茄 LeMADS-
MC mRNA序列设计基因特异性引物, 进行马铃薯
AP1基因全长 cDNA扩增, 得到大小约为750 bp核
苷酸序列(图 1)。经过核酸序列比对, 发现 StAP1
序列与番茄AP1同源基因LeMADS-MC和烟草AP1
同源基因NAP1-2有较高的一致性, 分别为 98% 和
88%。该序列已被提交到 GenBank, 登录号为
GU220568。
1), 说明 StAP1 蛋白以序列特异方式与 DNA 结合,
具有转录调节因子功能。利用在线分析软件
Swiss Model Servers 对马铃薯 StAP1 和烟草 NAP1
三级结构进行预测(图3), 结果显示二者空间结构比
较相似。
为了进一步了解 StAP1蛋白与其他植物AP1/
AP1-like 蛋白的亲缘关系, 将 StAP1 与来自拟南
芥、烟草、牵牛、荠菜、苹果等不同物种的 18
个同源蛋白序列进行了系统发生分析, 如图4所示,
马铃薯 StAP1 与 NAP1、PnAP1 同属于同一亚簇,
与烟草 NAP1 的亲缘关系更为相近。
3 StAP1的组织表达特征分析
基因的表达特性与其生理功能密切相关。为
了了解 StAP1 的功能, 利用半定量 RT-PCR 方法检
测了马铃薯植株不同部位的 StAP1 mRNA 水平。
StAP1 主要在顶芽、花和叶中表达, 其中顶芽中表
达最为强烈, 而根、茎中几乎检测不到(图 5-A)。
这个结果与在烟草上获得的结果不完全一致, 在后
者 AP1 同源基因主要在花器官表达, 根、茎、叶
等营养器官不表达(Jang 等 1999)。在马铃薯块茎
分化与发育过程中, StAP1 在初始块茎和成熟块茎
中有微弱的表达, 而在匍匐茎中不表达。这个结果
提示, StAP1可能在块茎的发育过程中发挥作用(图
5-B), 但机理尚需要进一步深入地研究。
4 反义 StCOL转基因植株中 StAP1的表达分析
为了了解StAP1与StCOL之间的关系, 分析了
反义 StCOL 转基因马铃薯植株的叶、顶芽、茎、
匍匐茎、成熟块茎等各器官中 StA P1 基因的表
达。结果显示, 在 StCOL 转基因植株叶和芽中的
表达水平与对照相比明显的降低(图 6)。这表明
StAP1 的表达受 StCOL 的调控。在对照植株的块
茎中没有检测到 StAP1 的表达, 这可能是 PCR 时
StAP1 cDNA 模板量下调造成的。
在马铃薯块茎分化与发育这个过程中, 光调控
是块茎形成的关键影响因子。有研究表明, 在花器
官发育中起重要作用的转录因子CO参与了块茎形
成的调控过程, 并起负调控作用(Martínez-García 等
2002)。本研究从马铃薯栽培品种 ‘Désirée’克隆得
到了 StAP1基因, 将有助于进一步研究 StCOL介导
的马铃薯块茎形成的调控机制。
图 1 马铃薯 StAP1 基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of amplification product of
StAP1 from potato
M: DL2000, 条带由大到小分别为 2 000、1 000、750、
5 0 0、2 5 0 和 1 0 0 bp。
2 StAP1及其编码蛋白的生物信息学分析
StAP1 的 cDNA 序列含有一个长度为 735 bp
ORF, 编码一个由244个氨基酸残基组成的蛋白, 蛋
白分子量为 28.57 kDa, 等电点为 8.32。该蛋白在
靠近 N- 末端的氨基酸特别保守(图 2)。相似性比
较发现, StAP1 蛋白与来自烟草(NAP1-2)、牵牛
(PnAP1)、拟南芥(AtAP1)、苹果(MdAP1-like)、
葡萄(VvAP1-like)的同源蛋白有较高的一致性, 分别
是 88.1%、77%、69.67%、65.2% 和 72.25%。
利用Smart在线服务分析StAP1蛋白, 发现N-
末端第 1~60 位氨基酸残基间有 MADS 结构域, 第
75~176 位氨基酸残基间有 K-BOX 典型结构域(表
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图 2 StAP1 与其它同源蛋白氨基酸序列比对
Fig.2 Alignment of the amino acid sequence of StAP1with that of other homologous
相同的氨基酸残基用黑色阴影显示, 保守位点用灰色阴影显示, 各物种同源蛋白如下: 马铃薯(StAP1, ADA77531); 拟南芥(AtAP1,
NP_177074); 苹果(MdAP1-like, AAL61543); 烟草(NAP1-2, AAD01422); 牵牛(PnAP1, BAG71406); 葡萄(VvAP1-like, XP_002263170)。
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图 3 烟草 NAP1 (A)和马铃薯 StAP1 (B)三级结构模型
Fig.3 Tertiary structure model of NAP1 (A) and StAP1 (B)
图 4 StAP1 的系统发生分析
Fig.4 Phylogenetic analysis of StAP1
蛋白质及其索引号分别为: 马铃薯(StAP1, ADA77531)、
烟草(N AP1 -2 , AAD 0 1 4 2 2 )、牵牛(Ip o m o e a n i l , Pn AP1 ,
BAG71406)、菠菜(Spinacia o leracea, SpAP1, ACE75943)、
商陆(Phytolacca americana, PaAP1-like, AAP83384)、绣球
(Hydrangea macrophylla , HmAP1-like, BAG68946)、葡萄
(VvAP1-like, XP_002263170)、牡丹(Paeonia suffruticosa ,
PsAP1-like, AAP83419)、苹果(MdAP1-like, AAL61543)、梨
(Pyrus pyrifo lia , PPAP1, ABP93401)、桃(Prunus persica ,
PpAP1-like, ABU63953)、玫瑰(Rosa hybrid cultivar, RAP1-
l i k e , A C S 7 4 8 0 6 )、枣( Z i z i p h u s ju ju b a , Z j A P 1 - l i k e ,
ACG7 09 64 )、甜橙(CsAP1, AAR01 22 7)、芒果(Man gi fer a
i n d i c a , M S A P 1 - l i k e , A C S 4 5 1 0 2 )、拟南芥( A t A P 1 ,
N P1 7 7 0 7 4 )、甘蓝(BO AP 1 , CAA8 6 0 2 4 )、荠菜(Ca p s e l la
bursa-pastoris, CbAP1-like, ACD76816)和柳树(Salix discolor,
SAP1, AAY82244)。
表 1 StAP1 的结构域分析
Table 1 Analysis of StAP1 domains
结构域 起始位置 终止位置 E 值
MADS 1 6 0 6.33e-39
K-BOX 7 5 176 4.07e-45
图 5 StAP1 的组织表达分析
Fig.5 Expression analysis of StAP1 in different tissues
A: StAP1 在不同组织的表达; 其中 1: 花; 2: 叶; 3: 顶芽; 4: 茎;
5: 根。 B: StAP1 在块茎形成过程中的表达; 其中 1: 起始匍匐茎;
2: 延伸匍匐茎; 3: 膨大匍匐茎; 4 : 初始块茎; 5 : 成熟块茎。
图 6 反义 StCOL 转基因马铃薯植株中 StAP1 的表达分析
Fig.6 Expression analysis of StAP1 in StCOL-antisense
potato plants
1: 叶; 2: 顶芽; 3: 茎; 4: 匍匐茎; 5: 成熟块茎。WT: 野生型;
StCOL-mutant: 反义 StCOL 转基因植株; StGAPDH: 内参。
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