全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 2期，2010年 2月 165
收稿 2009-11-27 修定 　2009-12-28
资助 国家自然科学基金(30 8 71 6 8 6)、华中农业大学科研启
动基金(20070504011)和江西省农业科学院创新基金博
士启动项目(2 0 0 9 博 -8 )。
* 通讯作者(E-mail: luozhr@mail.hzau.edu.cn; Tel: 027-
8 7 2 8 2 6 7 7 )。
植物逆转座子引物开发应用中的逆转座子序列分离方法
杜晓云 1,2, 张青林 2, 黄建民 1, 罗正荣 2,*
1江西省农业科学院园艺研究所, 南昌 330200; 2华中农业大学园艺植物学教育部重点实验室, 武汉 430070
Methods for Isolating Retrotransposon Sequences Utilized for Development of
Retrotransposon Primers in Plant
DU Xiao-Yun1,2, ZHANG Qing-Lin2, HUANG Jian-Min1, LUO Zheng-Rong2,*
1Institute of Horticultural Sciences, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China; 2Key Laboratory of
Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
提要: 文章介绍了作为植物逆转座子引物开发前提序列的逆转座子序列获得的几种方法: (1)通过同源克隆法获取逆转座子
的基因序列以设计逆转座子基因序列特异引物; (2)通过筛选文库、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)、搜寻
核酸数据库、大片段重叠群测序分离全长逆转座子序列以开发逆转座子长末端重复(long terminal repeat, LTR)引物; 以及
利用(3)磁珠富集、(4)抑制 PCR和(5) SiteFinding PCR等方法直接获得逆转座子的LTR序列以开发逆转座子 LTR引物。
关键词: 逆转座子; 引物; 开发; 植物; 分子标记
逆转座子以 RNA为媒介, 通过复制模式进行
转座, 是植物基因组的组成成分之一。逆转座子包
括长末端重复(long terminal repeat, LTR)逆转座子
和非长末端重复(non-long terminal repeat, non-LTR)
逆转座子。前者又可分为 Ty1-copia和 Ty3-gypsy
两类, 其结构中的 LTR序列不编码蛋白质, 但包含
有对转座起作用的启动子和终止子以及调控序列
(Casacuberta和Grandbastien 1993)。LTR逆转座
子中的基因序列主要有3个, 即gag (group-specific
antigen)、pol (polymerase)和 int (integrase), 分别
编码种属特异抗原、聚合酶和整合酶。Ty1-copia
类逆转座子结构见图 1。
图 1 Ty1-copia逆转座子的结构[参照Kumar和Bennetzen (1999)并作修改]
图中符号意义如下。DR: direct repeat, 正向重复; IR: inverted terminal repeat, 末端倒转重复; LTR: long terminal repeat, 长末
端重复序列; ORF: open reading frame, 开放读码框; Gag: group-specific antigen, 种属特异抗原; pol: polymerase, 聚合酶; PR: protease,
蛋白酶; INT: integrase, 整合酶; RT: reverse transcriptase, 反转录酶; RNase H: ribonuclease H, 核糖核酸酶H; PPT: polypurine tract,
多聚腺苷酸链。
逆转座子以分散的高度异质的重复序列群体
遍布于整个植物基因组, 通常处于静止状态, 但生
物(如真菌提取物, 病毒、细菌或真菌等病原物接
种等)及非生物因素(如原生质体分离、机械创
伤、冷害、组织培养、水杨酸或茉莉酮酸诱导
等)的胁迫可激活其转录(K uma r 和 Bennetz en
1999)。转录后的逆转座子可插入基因附近、基
因编码区或内含子区, 通过增加或消除基因的转
录、改变基因转录的时空表达模式或其相应蛋白
质的结构等产生突变(Henikoff和 Comai 1998); 也
可诱发基因组发生同源重组或非法重组(illegitimate
recombination), 导致基因组序列发生缺失、扩增、
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倒位、移位、断裂等重排, 促进基因组的流动, 产
生丰富的遗传变异(Devos等 2002)。因此, 逆转座
子是影响植物基因组结构、组成、大小及进化的
主要因素之一(Kumar和Bennetzen 1999)。近年来,
作为一种有效的遗传分析工具和理想的遗传标记,
逆转座子日益受到人们的重视, 一系列逆转座子分
子标记已被成功开发, 在遗传多样性检测、种质鉴
定及系谱分析、遗传连锁图谱构建、基因定位与
标记辅助育种等领域中得到广泛应用(Schulman
2007)。逆转座子分子标记较传统的分子标记具有
诸多优势, 如检测的多态性信息含量明显高于扩增
片段长度多态性(amplified fragment length polymor-
phism, AFLR)和简单序列重复(simple sequence
repeat, SSR); 特异性及重复性优于随机扩增多态性
DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD)
和简单序列重复区间扩增多态性(inter-simple se-
quence repeat, ISSR); 灵敏性强于传统分子标记, 尤
其适用于遗传背景高度同源的基因型的鉴别。但
逆转座子分子标记分析中引物的获得需要预先获知
核酸序列, 从特定的物种中分离逆转座子全长或部
分片段的难度较高、花费较大, 从而限制其广泛应
用。国内外对用于植物逆转座子引物开发的逆转
座子序列的分离方法的综述鲜有报道。我们根据
有关文献资料及其最新研究进展进行扼要总结。
需要分离的逆转座子序列的种类取决于将要
开发的逆转座子引物类别。迄今报道的逆转座子
引物主要有两类, 一类为逆转座子基因序列引物, 此
类引物基于逆转座子序列的几个保守结构基因, 如
gag、rt和 int等序列设计。另一类为 LTR引物或
PPT引物, 基于逆转座子长末端重复或其它非编码
序列设计。
1 同源克隆法对逆转座子基因序列的分离
检索核酸数据库中已公布的同一类群的逆转
座子序列, 进行多序列比对并提炼各结构基因的保
守结构域, 然后针对保守结构域设计简并引物, 采
用PCR扩增获得特异目的片段, 即为逆转座子的基
因序列。此方法操作流程简单、花费较少, 对待
研究物种特定的某个逆转座子序列信息的依赖性较
弱, 因此推广和应用比较方便, 已用于多个物种中
逆转座子基因序列的分离以获得逆转座子引物。
如, Bretó等(2001)用此方法从 ‘克里曼丁桔 ’和甜
橙中分离Ty1-copia类逆转座子的 4个 rt基因序列
获得逆转座子引物; Bernet和Asíns (2003)从 ‘克里
曼丁桔 ’中应用该方法分离 int和 gag基因序列, 共
开发了 8对逆转座子引物; Guo等(2006)利用逆转
座子间扩增多态性(inter-retrotransposon amplified
polymorphism, IRAP)和逆转座子 -微卫星扩增多态
性(r et rotr ansposon-microsa te ll i te ampli fied
polymorphism, REMAP)进行柿种质遗传关系分析,
使用的逆转座子引物来自采用该方法从柿品种‘西
条 ’中分离的Ty1-copia类逆转座子的 rt基因序列;
Díez等(2003)在担子菌Laccaria bicolor上也用此方
法分离了rt基因序列, 然后开发引物; 此外, 在豌豆
(Vershinin和 Ellis 1999)、香蕉(Nair等 2005)等物
种中也有相关的应用报道。
2 逆转座子全长序列的分离
2.1 基于杂交筛选基因组或 cDNA文库 探针主要
有两类: 一类依据逆转座子结构中相对保守的序列
设计探针, 如, 引物结合位点(primer binding site,
PBS)、酶基因或部分 LTR序列等。水稻逆转座
子Tos1-3 (Hirochika等1992)和Tos17 (Hirochika等
1996)、燕麦OARE-1 (Kimura等 2001)、拟南芥
AtRE1-2 (Kuwahara等 2000)、大豆 SIRE-1 (Laten
等 1998)、大麦 BARE-1 (Manninen和 Schulman
1993)及木豆Panzee (Lall等 2002)等逆转座子全长
的分离采用类似方法。另一类探针源于感兴趣的
基因序列。通过逆转座子插入导致的表型变异, 找
出发生突变的基因, 再制备探针筛选文库。如烟草
Tnt1 (Grandbastien等 1989)、玉米 Bs1 (Johns等
1985)、葡萄 Vine-1 (Verriès等 2000)和 Gret-1
(Kobayashi等 2004)、苹果 dem1 (Yao等 2001)及
水稻 Hopscotch (White等 1994)等逆转座子全长的
分离。
2.2 基于PCR方法 Pelsy和Merdinoglu (2002)用特
异于逆转座子逆转录酶基因的一对简并引物扩增基
因组DNA, 得到大小约280 bp的特异的片段, 之后
又通过多步PCR反应的染色体步移, 获得葡萄Tvv1
全长逆转座子。Tahara等(2004)用特异序列扩增
多态性(specific-sequence amplified polymorphism,
SSAP)分子标记, 结合 3 RACE及特异引物的 PCR
扩增获得甘薯逆转座子 Rtsp-1。Garber等(1999)
用特异于逆转座子逆酶基因的引物进行 RT-PCR,
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然后用3 RACE获得大豆Tpv2逆转座子长约1.4 kb
的3端, 再以该片段设计探针筛选基因组杂交文库,
得到全长 Tpv2逆转座子。此外, 克隆某些感兴趣
基因时, 也可能偶然获得全长逆转座子或其部分序
列, 再通过进一步筛选文库后得到全长。如, 矮牵
牛逆转座子 rTph1 (Matsubara等 2005)和水稻逆转
座子 RIRE-3 (Kumekawa等 1999)的获得最初都源
于对细胞色素 P450基因的扩增。
2.3 基于核酸数据库的计算机辅助检索 生物信息
的剧烈膨胀形成了巨量的生物信息库, 利用现成的
数据资源是一种经济快速的策略。White等(1994)
用从玉米wx-k突变体中分离的Hopscotch逆转座子
序列和其它植物中的逆转座子, 检索DNA数据库, 在
正常植物基因的 5和 3区域发现 20多种逆转座子
序列。Hirochika (1997)在水稻表达序列(expressed
sequence tags, EST)标签中也发现 2个逆转座子序
列。Gao等(2004)以McCarthy和McDonald (2003)
搜索到的 38个家族为 query sequence, 检索核酸数
据库, 共鉴定 1 219个逆转座子序列, 其中 217个
为全长逆转座子。除此之外, 专业、快速、精确
的对数据库中 LTR型逆转座子序列直接检索的软
件, 如 CENSOR (Jurka等 1996)和 LTR_STRUC
(McCarthy等2003)相继得到开发, 进一步方便了数
据库中逆转座子的筛选。McCarthy和McDonald
(2003)用 LTR_STRUC 软件, 从 GenBank和
Monsanto水稻核酸数据库共搜索到59个水稻LTR
逆转座子家族。Acquadro等(2005)用 CENSOR软
件筛选获得 1个含有逆转座子序列的克隆。近年
来, 新开发的类似软件还有LTR_par (Kalyanaraman
和 Aluru 2006)、LTR_ Rho (R ho等 200 7)、
LTR_FINDER (Xu和Wang 2007)和 LTR_harvest
(Ellinghaus等 2008)。
2.4 基于大片段重叠群(contig)的测序分析 序列资
料表明, 逆转座子基因组插入位点具有偏好性, 集
中于基因临近区或富基因区的侧翼(Sandhu和Gill
2002)。因此, 从涵盖某些基因的大片段重叠群的
测序分析中, 挖掘逆转座子的序列信息, 也是获得
逆转座子引物的一种便捷的方法。SanMiguel等
(1996)测得玉米约 280 kb, 并包含Adh1-F和 u22两
个基因的克隆, 从中分离到 10个逆转座子家族。
Shirasu等(2000)在大麦 66 kb的重叠群中鉴定出 4
个逆转座子家族以及 BARE-1家族的几个单元。
Tarchini等(2000)在位于水稻11号染色体的乙醇脱
氢酶基因 Adh1和 Adh2位点周围 340 kb长的重叠
群中发现 7个逆转座子。Yang等(2003)从柑橘速
衰病(Citrus tristeza virus, CTV)抗性基因 Ctv所在
的长 282 kb的 BAC克隆中测序, 鉴定出 8个逆转
座子。近年来, 类似的报道还很多。
3 逆转座子LTR序列的直接分离
3.1 磁珠富集法 通过获得全长逆转座子序列开发
逆转座子LTR引物极为方便, 然而分子生物学在不
同物种间发展的不平衡决定了上述分离全长的方法
在很多物种上难以真正得到应用, 尤其对公共核酸
数据库中已知基因组序列信息贫乏的物种。鉴于
此, Pearce等(1999)开发出一种快速分离Ty1-copia
类逆转座子LTR序列的方法——磁珠富集法。此
方法在特异引物一端预先增加了便于选择产物的生
物素标记, 用链霉亲和素包被的磁珠捕捉分离带有
生物素标记的目的产物。详细流程见图 2。具体
步骤为: (1)提取基因组总DNA; (2)用限制性内切
酶部分酶切基因组DNA; (3)接头连接; (4)生物素
酰化标记特异于 RNase H酶(紧邻 5-LTR上游)的
图 2 磁珠富集法分离逆转座子 LTR序列
[参照Hui等(1998)并作修改]
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简并引物; (5)巢式 PCR扩增; (6)扩增产物通过以
链亲合素包被的磁珠为填充物的磁力装置, 在磁珠
表面的链酶亲和素与标记于RNase H酶基因序列上
的生物素之间形成稳定的共价结合; (7)洗涤; (8)产
物回收、纯化、克隆; (9)测序并序列分析; (10)
设计引物。此方法经济、高效, 已用于豌豆、松
属、挪威云杉(Pearce等 1999)、甘薯(Berenyi等
2002)、菜豆(Galindo等 2004)、腰果(Syed等 2005)
和龙舌兰(Bousios等 2007)等植物的逆转座子引物
的开发。
3.2 抑制 PCR法 Du等(2009)用抑制 PCR方法从
柿属植物中成功获得到16条多态性高的逆转座子
引物。其基本操作步骤为: (1)提取基因组总DNA;
(2)平端限制性内切酶充分酶切基因组DNA; (3)接
头连接; (4)使用RNase H酶简并引物进行巢式PCR
扩增; ( 5)产物回收、纯化、克隆、测序; ( 6)逆
转座子引物设计。详细流程见图 3。此方法用接
头序列的特殊性达到目的序列的特异性扩增。采
用的接头是一对互补且不等长的寡核苷酸短链, 3
端均未磷酸化, 与经平端内切酶酶切的DNA片段连
接后, 连有短链接头的 3端DNA在聚合酶作用下
以长链为模板自发补齐成平端。此时, 每一个连有
双链接头的DNA片段就有了互补的、可以自身进
行链内退火形成茎环结构的反向长末端重复序列。
按接头5侧部分约20 bp寡聚核苷酸序列设计引物,
PCR扩增退火时, 由于长颠倒末端重复序列的自身
退火温度高于引物退火温度, 故前者退火早于后者,
前者退火形成平锅状结构, 屏蔽引物结合位点, 抑
制了 PCR扩增, 而使后者目的序列达到有效富集
(Siebert等 1995)。抑制 PCR方法与磁珠富集法思
路相同, 但无需特殊的磁力装置和引物酰化处理, 而
且免去磁珠富集法必须的多次纯化、杂交和洗脱
等步骤, 对中间产物的纯度要求不高, 因此, 相对而
言是一种更为便捷、经济的分离方法。此方法用
于分离逆转座子LTR序列进行逆转座子引物开发,
在其它物种中尚未见报道。
3.3 SiteFinding PCR法 Zhao等(2007)用改进后的
SiteFinding PCR方法从苹果基因组中成功分离逆转
座子LTR序列, 为进一步开发苹果逆转座子引物提
供了前提。SiteFinding PCR的分离思路与抑制
PCR类似, 也是通过先基因组酶切后, 连接一段特
殊的接头序列, 然后利用基因特异引物和接头引物
进行巢式PCR, 最后通过平锅状径环结构的形成, 抑
制非目的片段扩增, 从而使目的片段富集来开发逆
转座子引物。该方法与抑制 PCR最大的不同在于
接头序列的设计和初始PCR的启动, 其采用了3末
端携有 4 ~6 个碱基的寡核苷酸链在低温下启动
PCR反应。具体原理和步骤可参阅 Tan等(2005)
和 Zhao等(2007)的论文。
4 结语
采用同源克隆法分离逆转座子基因序列, 简便
易行, 花费较少, 但基于此类序列开发的逆转座子
引物可应用的标记种类有限(目前多用于 IRAP和
REMAP分析); 逆转座子全长或LTR序列直接分离
方法步骤繁琐、成本较高, 更多的依靠文库杂交和
数据库, 推广较难。但基于此类序列开发的 LTR
引物可供采用的逆转座子分子标记种类选择自由度
广, 多态性高, 尤其基于 LTR引物的 SSAP分子标
记可以获得逆转座子插入位点旁侧宿主基因组的序
列信息, 便于追溯由逆转座子所引发的突变机理。
故 LTR引物可能是今后逆转座子引物发展的主流
类型。近年来, 应用磁珠富集法、抑制 PCR 及
SiteFinding PCR等方法快速获得逆转座子 LTR序
列, 方便了 LTR引物的开发。特别是后两种方法
图 3 抑制 PCR方法分离逆转座子 LTR序列
[参照 Lavrentieva等(1999)并作修改]
R : 限制性内切酶作用位点。
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因为直接瞄准逆转座子 LTR区, 针对性强, 免去杂
交、洗脱、筛选等步骤, 流程简化, 且效率较高,
有望在获得植物 LTR逆转座子引物开发所需要的
逆转座子序列的分离中得到广泛应用。
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