全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 2 期，2010 年 2 月 113
收稿 2009-10-15 修定 　2009-12-28
资助 教育部科学技术研究重点项目(10 9 0 54 )。
* 通讯作者(E-mail: liuguanjun2003@126.com; Tel: 0451-
8 2 1 9 0 6 0 7 )。
西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达
刘春, 刘关君 *, 曲春浦, 魏志刚, 刘桂丰, 杨传平
东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 已从西伯利亚蓼叶中 cDNA文库中获得的钙调蛋白 EST序列, 采用 cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了具有完
整编码区的钙调蛋白基因的 cDNA序列(GenBank登录号GQ988382), 命名为 PsCaM。该基因全长 615 bp, 编码区为 450
bp, 编码 149个氨基酸, 5非翻译区为63 bp, 3非翻译区为102 bp。同源性分析表明, 该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,
氨基酸同源性高达 98%。用实时荧光定量PCR研究 3% NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示, 自然条件下, 该
基因在叶中表达量最高, 地下茎次之, 茎中最低; 盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达, 表达模式不
同。
关键字: 钙调蛋白; 西伯利亚蓼; 基因克隆; 实时荧光定量PCR; 表达分析
Cloning of CaM Gene from Polygonum sibiricum Laxm. and Its Expression
under Salt Stress
LIU Chun, LIU Guan-Jun*, QU Chun-Pu, WEI Zhi-Gang, LIU Gui-Feng, YANG Chuan-Ping
Laboratory of Forest Genetics and Breeding and Biotechnology of Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin
150040, China
Abstract: PsCaM gene (GeneBank accession No. GQ988382) containing a complete ORF was obtained using
rapid amplification of cDNA ends (RACE) method based on EST sequence which was obtained from cDNA
library of Polygonum sibiricum leaves. The full length of cDNA was 615 bp with a 450 bp open reading frame
(ORF) which encoded a peptide of 149 amino acids and containing a 63 bp 5 UTR and a 102 bp 3 UTR. The
results of homologous sequence analysis indicated that PsCaM was highly conserved in plants, which shared
98% homology with other CaM in the amino acid sequence. Expression analysis of RT-PCR showed that
PsCaM was expressed in leaves, stems and rhizomes. The expression level of PsCaM gene was higher in leaves
than that in rhizomes, and lowest in stems under nature condition. The expression pattern of PsCaM gene was
different in leaves, stems and rhizomes under NaHCO3 stress.
Key words: CaM; Polygonum sibiricum; gene cloning; RT-PCR; expression analysis
植物中 Ca2+ 在一系列生理和代谢过程中起第
二信使的作用, 是一种在多种功能调控中刺激应答
的媒介物(梁秋芬等2005; 周江菊和夏快飞2005), 它
通过其在细胞内外浓度差异传递多种信号(顾永清
1994)。植物钙调蛋白是细胞内钙离子的蛋白受体
和分布最广、功能最重要的钙依赖性调节蛋白(张
君诚等2005; Feinstein等1991), 也是生物细胞内一
种结构上保守性很强的调控蛋白, 其在组织、器官
和原生质体中的含量不同, 分布也不一样(夏快飞等
2005)。
CaM 又称为钙调素, 是由 19 种 148 个氨基酸
组成的单链可溶性球蛋白, 分子量 16.7~16.8 kDa
(夏快飞等2005), 对热稳定性好, 酸性, 保守性较强
(张君诚等 2005), 一般认为 CaM 有 4 个 EF 臂, 即
由一个中央螺旋链接两个球状结构形成的螺旋 -
线-螺旋结构, 每两个EF臂由一条长的可自由伸展
的 α 螺旋连结成一组, 能结合 4 个 Ca2+, 分别称为
I、II、III、IV。N 端的 I、II 区为低亲和力区,
C 端的 III、IV 区为高亲和力区(Reddy 等 2002)。
CaM本身无活性, 一旦与Ca2+结合形成CaM-
Ca+后便发生构象变化, 暴露出疏水区, 该区能与依
赖于CaM的靶酶相互作用而调节酶的活性。该过
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程可逆, 受细胞内钙离子浓度的调节(夏金虹 1997;
Patel 等 1997)。细胞内 CaM 的水平最终是由胞内
Ca2 +浓度控制的, 胞内静息态Ca2 +浓度为10-7 mol·L-1,
胞内浓度高于 10-5 mol·L-1 时, Ca2 + 则结合CaM (夏
快飞等 2005)。
钙调蛋白参与多种生理活动的调节, 如调控酶
的活性、促进细胞增殖和调节微管解聚, 从而进一
步实现对有丝分裂的调控(夏金虹 1997)、调节细
胞代谢(梁秋芬等 2005)、参与植物发育和激素反
应、调节植物离子通道、参与植物病原反应与转
录活性调节(毛国红等2004; 张成和王之2006)、参
与植物对许多逆境信号的转导, 钙信号再通过其下
游的钙结合蛋白进行感受和转导, 进而在细胞内引
起一系列的生物化学反应以适应或抵制各种逆境的
胁迫(Liu 等 2003)。
人们已经从各种动植物中, 如: 鸡脑(Putkey等
1983)、马铃薯匍匐枝尖端(Jena 等 1989)、条斑
紫菜(Porphyra yezoensis Ueda) (Wang 等 2009)、
胡萝卜( I s h i ga k i 等 2 0 0 4 )、豇豆(张成和王之
2006)、小麦(Yang等 1998; Mahalakshmi等 2007)、
野甘草(Saitoh等2007)分离或克隆得到了CaM基因
并对其功能进行了初步研究。AtCaM3表达转基因
拟南芥的研究表明, AtCaM3 可以抑制冷诱导基因
(cold regulated gene, COR)的表达, 说明多种非生物
胁迫都与Ca+/CaM信号系统有关(张和臣等2007)。
最近的研究表明, CaM能够增强抗氧化胁迫酶类如
SOD4 (superoxide dismutase)、cAPX (cytosolic
ascorbate peroxidase)和 GR1 (glutathione reductase)
的表达(Hu 等 2007)。现今, 已证实, 盐过敏感(salt
overly sensitive, SOS)信号途径在植物耐盐中起调控
作用, 在这一条途径中, 钙离子作为第二信使与钙
离子结合蛋白结合并激活下游一系列蛋白, 进而调
控植物的耐盐性; 已有报道认为, 与植物耐盐相关
的一些重要蛋白都是在Ca2+/CaM 复合物的作用下
发挥功能的(Imai和Yahara 2000; Botella 等 1996)。
西伯利亚蓼多生于盐碱地。本文从西伯利亚
蓼叶cDNA文库中克隆了钙调蛋白(PsCaM)的完整
编码区cDNA序列并对其序列进行了生物信息学分
析, 采用实时荧光定量 PCR 技术分析 3% NaHCO3
胁迫下CaM在西伯利亚蓼不同器官中的表达, 为后
期进一步研究该基因与耐盐的关系提供基础资料。
材料与方法
在黑龙江省肇东县东部盐碱地(东经 1 2 6 °
01’ 01 ” , 北纬 46 。 00 ’ 51 ” ) , 挖取西伯利亚蓼
(Polygonum sibiricum Laxm.)地下茎段为繁殖材料,
温室内扩繁。次年月初培育西伯利亚蓼地下茎扦
插苗, 用腐殖质和细砂混合物(比例为3:1)作培养基
质, 每隔 24 h 用普通自来水浇苗。温室培养 1 个
月后, 西伯利亚蓼苗高达 10~15 cm 时, 用 3%
NaHCO3 进行盐胁迫处理, 每个处理 30 棵, 重复 3
次, 处理时间分别是 0、8、24、48 和 72 h, 处
理后用自来水反复冲洗后将叶片与茎分开分别取样
(地下茎、茎、叶), 同一时期统一取样, 所取材料
用液氮冷冻后立即放入-80 ℃冰箱内保存, 备用。
PowerScriptTM Reverse Transcriptase、RQ1
RNase-Free DNase 购自 Promega 公司。SYBR
Premix Ex TaqTM、限制性内切酶、T4 DNA 连接
酶购自 TAKARA 公司。Taq DNA Polymerase 购
自 TIANGEN 公司。Tris 饱和酚、β- 巯基乙醇、
氯仿、DEPC、琼脂糖、CTAB、硼砂、NaCl、
LiCl、NaAC、无水乙醇及其他试剂都为分析纯。
引物合成及测序工作由上海生工生物工程技术服务
有限公司完成。
RNA提取及PsCaM基因cDNA的扩增时将材
料按照传统 SDS/ 苯酚法提取西伯利亚蓼地下茎、
茎、叶总 RNA。参照参照 SmartTM RACE cDNA
扩增试剂盒(Clontech)说明, 反转录合成cDNA第一
链。根据西伯利亚蓼叶 cDNA文库中PsCaM 基因
的 EST 序列, 在 3 非翻译区设计 5 RACE 引物及
相应的巢式引物(只列出基因克隆的部分, 其中带有
N的为巢式引物)引物设计如下: CaM C N: 3 GGA-
GAAACATTGAGCAGACAGA 5; CaM C: 3
CGAATAACAACTGGACAACTTAC 5。利用
Clontech的RACE技术, 获得PsCaM具有完整编码
区的 cDNA, 扩增所得的特异性片段通过 Promega
公司胶回收试剂盒进行回收, 回收片段链接到载体
pMD18-T 中, 下一步转化大肠杆菌 TOP10 感受态
细胞, 在含有 Amp/IPTG/X-Gal 的平板上进行蓝白
斑及 Amp+ 双重选择, 挑取白斑, 进行 PCR 检测后
由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
PsCaM 的序列分析采用 BioEdit 软件的 CAP
(contig assembly program)进行电子拼接, NCBI 中
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的 BLASTX 程序对 PsCaM 进行同源性比较, 通过
NCBI中开放读码区(open reading frame, ORF)程序
查找该序列的 ORF, 软件 ClustalX 1.8.1 进行多序
列比较和分子进化树的绘制。SignalP 3.0 预测该
蛋白的信号肽及可能的切割位点。通过ProtParam
(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)进行在线
预测钙调蛋白基因编码蛋白的分子量及理论等电
点 。
PsCaM 在西伯利亚蓼不同组织中荧光定量
RT-PCR 分析时, 提取西伯利亚蓼胁迫前及胁迫后
各时段地下茎、茎、叶 RNA 并反转录成 cDNA。
根据PsCaM基因全长cDNA设计其定量引物(CaM-
S: 5 GGAGCAACTCACGGACGA 3; CaM-A: 5
GAGGAACCCTGGGAAGTCAA 3), 以西伯利亚蓼
18S rRNA基因为内参(18S-S: 5 GTATGGTCGCAA-
GGTGAAAC 3; 18S-A: 5 TTAGCAGGCTGAGGT-
CTCGT 3 ) , 对西伯利亚蓼地下茎、茎、叶中
PsCaM 基因在盐胁迫前后的表达量进行实时荧光
定量分析。在 MJ Research 公司的 DNA Engine
Opticon-2 TM 实时荧光定量 PCR 仪上进行 RT-
PCR。反应体系为: 3 μL cDNA 模板(第一链)、引
物各1 μL、SYBR Premix ExTaqTM (2×) 10 μL, 加去
离子水补齐至 20 μL, PCR 反应条件为: 94 ℃ 30 s,
94 ℃ 12 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 45 个循环, 读板
温度 8 1℃。结果分析采用 2 - Δ Δ C t 法( L i v a k 和
Schmittgen 2001; Gulietti 等 2001)。
结果与讨论
1 西伯利亚蓼PsCaM完整读码区的扩增
根据西伯利亚蓼叶 c D N A 文库中获得的
PsCaM 基因的 EST 序列, 采用 5 RACE 技术进行
扩增 PsCaM 基因的 5 端, 根据 3 RACE 所得的产
物序列在其翻译区设计引物扩增其 cDNA, PCR扩
增后, 得到一条大小约为 600 bp 的 DNA 片段, 与
预期大小一致, 将此条带回收、克隆并测序, 测序
结果为615 bp, 为PsCaM具有完整读码区的cDNA
序列 。
2 西伯利亚蓼PsCaM基因及其编码蛋白序列分析
根据西伯利亚蓼叶片 cDNA 文库中获得的钙
调蛋白(calmodulin) EST 序列, 应用 cDNA 末端快
速扩增(RACE)技术克隆了其具有完整读码区的
cDNA序列(GenBank序列号 GQ988382), 全长 615
bp, 应用 NCBI 的 ORF finder 程序查找可知编码区
为 450 bp, 编码 149个氨基酸, 5非翻译区为 63 bp,
3 非翻译区为 102 bp (图 1)。通过 ProtParam (http://
www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)进行钙调蛋白基
因编码蛋白的在线等电点预测, 可知其蛋白的理论
分子量为 16.7 kDa、理论等点为 4.12。经 SignalP
3.0 预测该蛋白没有任何信号肽, 为非分泌蛋白。
3 PsCaM基因序列的同源性分析和其氨基酸序列
的系统进化树
钙调蛋白在生物体生命过程中起很重要的作
用, 其活性位点的突变常常是致死的, 因此其结构
和功能非常保守, 这也说明其在一些生物和非生物
应答过程中发挥相似的作用。将西伯利亚蓼的
PsCaM 基因序列与GenBank中其他植物中的钙调
蛋白基因序列比对(图 2)发现, PsC aM 与辣椒
(Capsicum annuum) CaM (P93087)、小麦(Triticum
aestivum) TaCaM2-2 (AAC49582)、胡萝卜(Daucus
carota) CaM-210 (AAT73623)、籼稻(Oryza sativa
Indica Group) CaM-3 (A2WNH1)、阿拉伯芥
(Arabidopsis thaliana) CaM-7 (NP_189967)、马铃
薯(Solanum tuberosum) CaM-5/6/7/8 (Q7DMN9)、
遏蓝菜(Thlaspi caerulescens) CaM (ABN79277)、
无梗花栎(Quercus petraea) CaM (CAH57708)、玉
米(Zea mays) CaM-2 (NP_001105547)、甜菜(Beta
vulgaris) CaM (ACB32228)、蒺藜苜蓿(Medicago
truncatula) CaM-2 (AAM81203)等具有很高的同源
性, 核苷酸序列一致性在82%~84%, 蛋白同源性高
达98%, 其中与辣椒(Capsicum annuum)的Calmodulin
匹配最佳。用ClustalX 软件对西伯利亚蓼CaM进
行系统进化树分析比较, 结果(图 3)表明 PsCaM 与
小麦、玉米和籼稻在进化关系较近, 而与无梗花栎
和甜菜进化关系较远。在不同植物的钙调蛋白之
间有很高的同源性, 因而推测其在进化上是相当保
守的 。
4 PsCaM基因的荧光定量RT-PCR分析
由于CaM与植物的耐盐有关并其在植物不同
组织、器官中的含量不同, 因此我们研究西伯利亚
蓼叶、茎、地下茎在正常条件及盐胁迫下CaM的
表达情况。荧光定量RT-PCR的结果表明, 正常生
长条件下, PsCaM 在西伯利亚蓼的叶、茎、地下
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茎中均有表达, 叶中的表达量最高, 地下茎次之, 茎
中最低, 与叶中相比茎中表达量在图中几乎没有显
示出来(图 4-a)。3% NaHCO3 胁迫下不同时期
PsCaM 在叶(图 4-b)、茎(图 4-c)、地下茎(图 4-
d)中的表达(图 4)显示, 胁迫不同时间的茎中的
PsCaM 的表达量波动最大。在盐胁迫条件下, 其
对盐胁迫感应, 机制可能是通过钙离子作为第二信
使并通过浓度的变化然后与钙调蛋白即钙调素结
合, 激活下游一系列钙调素结合蛋白, 进而调控植
物的耐盐性。PsCaM 在叶中的表达量表现为先降
低后升高的趋势, 72 h时表达最高, 表达量约为0 h
的 3 倍; 24 h 时表达最低, 与 0 h 相比, 其表达几乎
没有显示出来。在茎中的PsCaM表达量呈现先降
低后升高再降低的趋势, 48 h时的表达最高, 与0 h
几乎相同, 而表达最低的出现在胁迫后 8 h, 与 0 h
比的表达量也几乎没有显示出来。在地下茎中,
PsCaM 表现为随时间的增加依次降低但最后又稍
有些升高的趋势, 表达的最高点在 8 h, 与 0 h 几乎
相同, 最低点在 48 h, 比 0 h 约高 40 倍。PsCaM
在地下茎、叶和茎中的表达形式有不同, 这可能是
因为西伯利亚蓼中含有不止一种钙调蛋白, 而是含
有许多同种蛋白的异型体, 行使类似的功能, 而这
些钙调蛋白对盐胁迫信号做出的反应不同即 CaM
基因表达调控并非是一种CaM基因对应一种信号
那样简单(王朝晖和孙大业1997), 而具体原因有待
进一步研究。
图 1 西伯利亚蓼 PsCaM 具有完整编码区 cDNA序列及其氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of PsCaM cDNA form P. sibiricum
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图 2 西伯利亚蓼 PsCaM 氨基酸序列与其他 11 种植物 CaM 氨基酸序列的比较
Fig.2 Alignment of amino acid sequence of PsCaM and other CaM of eleven plants
西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum) (GQ988382)、辣椒(Capsicum annuum) (P93087)、小麦(Triticum aestivum) (AAC49582)、
胡萝卜(Daucus carota) (AAT73623)、籼稻(Oryza sativa Indica Group) (A2WNH1)、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana) (NP_189967)、
马铃薯(Solanum tuberosum) (Q7DMN9)、遏蓝菜(Thlaspi caerulescens) (ABN79277)、无梗花栎(Quercus petraea) (CAH57708)、
玉米(Zea mays) (NP_001105547)、甜菜(Beta vulgaris) (ACB32228)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) (AAM81203)。
图 3 PsCaM 与其它植物钙调蛋白系统进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of PsCaM and other plants CaM
植物生理学通讯 第 46 卷 第 2 期，2010 年 2 月118
图 4 NaHCO3 胁迫下西伯利亚蓼 PsCaM 在叶、茎和地下茎中的表达
Fig.4 Expression of PsCaM gene in leaves, stems and rhizomes under NaHCO3 stress
a: 正常生长条件下叶、茎和地下茎中 PsCaM 的表达; b: 3% NaHCO3 胁迫后不同时间 PsCaM 在叶中的表达; c: 3% NaHCO3 胁迫
后不同时间 PsCaM 在茎中的表达; d: 3% NaHCO3 胁迫后不同时间 PsCaM 在地下茎中的表达。
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