全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (11): 1079~1085 1079
收稿 2011-05-30　　修定 2011-08-29
资助 南京农业大学大学生创新训练计划项目(0906A2)。
* 通讯作者(E-mail: qianmeng@njau.edu.cn; Tel: 025-84396524)。
抗氧化系统在海州香薷耐铜机制中的作用
朱昌华1, 穆怀彬2, 钱猛1,*
1南京农业大学生命科学学院生物学实验教学中心, 南京210095; 2中国农业科学院草原研究所, 呼和浩特010010
摘要: 利用溶液培养的方法研究了铜胁迫下海州香薷根系和地上部分MDA含量, 各种抗氧化酶及非酶抗氧化系统的变
化。结果表明, 不同浓度铜处理8 d后, 海州香薷根系中MDA含量显著增加, 叶片中则无显著变化; 根系中SOD、POD、
CAT、APX、GR活性和叶片中POD、SOD的活性随铜处理浓度的增加而显著增加, 而50~200 μmol·L-1铜处理条件下叶片
中CAT、APX、GR活性与对照相比无明显差异。除CAT外, 根系中这些抗氧化酶的活性都远远大于叶片中的活力。另外,
实验结果表明, 50 μmol·L-1 Cu2+对海州香薷的生物量并没有显著影响, 当铜浓度达到100和200 μmol·L-1时, 铜则可显著降低
海州香薷根系的生物量, 对地上部生物量仍无显著影响。
关键词: 铜; 抗氧化酶; 海州香薷
Antioxidative Defence Systems in a Copper Tolerant Plant, Elsholtzia haichow-
ensis, under Copper Stress
ZHU Chang-Hua1, MU Huai-Bin2, QIAN Meng1,*
1Life Science Laboratory Center, College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2Grassland
Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hohhot 010010, China
Abstract: Hydroponic cultures were conducted to study the concentrations of MDA, activities of antioxidative
enzymes and non-enzymatic antioxidant enzymes system in the roots and leaves of Elsholtzia haichowensis un-
der copper stress. The results showed that copper treatments caused significant increases of malondialdehyde
(MDA) concentrations in the roots of Elsholtzia haichowensis, while had no significant effect on those in the
leaves. The activities of SOD, POD, CAT, APX and GR in the roots, as well as the activities of POD and SOD
in the leaves of E. haichowensis increased with the increasing Cu concentrations in the culture solution. The ac-
tivities of the antioxidative enzymes in the roots were much higher than those in the leaves with exception of
CAT. The results also showed there is no significant difference in the shoots dry weights of E. haichowensis under
50–200 μmol·L-1 copper stress when compared to the control. Copper with concentrations of 100 and 200 μmol·L-1
significantly decreased the root dry weight of E. haichowensis.
Key words: Cu; antioxidative enzyme; Elsholtzia haichowensis
矿产开发、污水灌溉以及各种化学产品和农
药的广泛使用导致土壤重金属污染日益严重。重
金属如铅、镉、铜、锌、砷等对人类和动植物具
有较强的毒害作用(Gao等2010; Krantev等2008)。
铜(Cu)是植物生长必需的微量元素, 广泛参与植物
的各种生理代谢过程。Cu是多种酶的组成成分和
活化剂, 它参与呼吸代谢中的氧化还原反应; Cu是
植物中重要的电子传递体, 它是叶绿体中光合电
子传递链的重要组成部分(Burkhead等2009; Tany-
olac等2007)。然而过量的Cu会导致植物体内产生
大量的活性氧(ROS), 引起生物膜膜脂过氧化, 影
响酶和蛋白代谢, 抑制叶绿素合成或引起叶绿体
降解, 引起营养元素缺乏等(Demirevska-Kepova等
2004; Nielsen等2003; Llorens等2000; Shen等1998)。
植物体内的多种抗氧化系统能够在一定范围内清
除ROS, 保护细胞免受氧化伤害(Wei等2010)。植
物抗氧化系统主要由超氧化物歧化酶(SOD)、过
氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过
氧化物酶(GPX)、抗坏血酸氧化酶(APX)、谷胱甘
肽还原酶(GR)及GSH-AsA循环中的各种酶和谷胱
甘肽(GSH)、VE、VC、脯氨酸等抗氧化物质组成
(Sheih等2009; Wang等2008; Aravind和Prasad
植物生理学报1080
2005)。Luna等(1994)用10 mmol·L-1 Cu2+处理离体
燕麦24 h后发现植物体内丙二醛(MDA)大量积累,
SOD活力升高而CAT、POD的活性下降。这些酶
对铜胁迫的反应不同可能是由于铜胁迫下产生活
性氧的种类和数量不同。Van Assche和Clijsters
(1990)的实验结果表明一些植物对重金属的共同
响应是它们组织中POD活性明显升高, 表明其在
清除重金属胁迫导致植物体产生的自由基以及提
高植物的耐重金属的能力上有十分重要的作用。
海州香薷(Elsholtzia haichowensis Sun ex C. H.
Hu)亦称为铜草, 主要生长在我国的长江中下游地
区。作为铜矿区的指示性植物, 海州香薷对铜有
较高的耐性, 生物量也较大(Lou等2004; 李锋民等
2001; Tang等1999)。有文献报道海州香薷中铜含
量可以达到300 mg·kg-1 (DW) (Tang等1999; 唐世荣
等1998), 在应用于植物修复方面可能具有较大潜
力。Lou等(2004)报道, 低浓度铜(<50 μmol·L-1)处
理可以促进海州香薷的生长, 根系铜含量可高达5
202 μg·g-1, 表明海州香薷有很强的耐铜性, 但并不
是铜超量积累植物。因此研究抗氧化系统在海州
香薷耐铜性中的作用具有重要的理论和现实意
义。
材料与方法
1 实验材料与试验设计
海州香薷(Elsholtzia haichowensis)的种子采自
安徽省铜陵铜官山。
海州香薷种子播于蛭石, 在室温下萌发, 待幼
苗长出后(播种后9 d), 选取长势良好且一致的幼苗
移植在含2 L Hoagland营养液(pH 5.3)的培养钵中
生长, 每2 d更换1次营养液。幼苗在自然温度和自
然光照条件下生长30 d后用不同浓度的Cu处理: 分
别为CK (0.32 μmol·L -1)、50 μmol·L -1、100
μmol·L-1、200 μmol·L-1 Cu2+ (以CuSO4提供), 每个
处理3个重复。铜处理8 d时, 并分别采集植物样品,
将根系与地上部分开, 洗净, 测定干重, 测量MDA、还
原型抗坏血酸(AsA)、脱氢抗坏血酸(DHA)、GSH
含量及POD、SOD、CAT、GR、APX活性。
2 测定项目与方法
2.1 MDA含量的测定
植物根系和地上部分MDA的含量参照李合
生(2000)的方法测定: 取1 g根系或叶片放于预冷的
研钵中, 然后加入5 mL预冷的5%三氯乙酸(TCA),
冰浴研磨后冷冻离心(4 ℃, 12 000×g) 20 min, 上清
液为待测液。取上清液2 mL, 加入2 mL 0.6%硫代
巴比妥酸(TBA)溶液, 混匀后于沸水浴上反应15
min, 然后迅速冷却后再离心1次, 取上清液测定
532、600和450 nm处吸光值。反应液中MDA浓度
按下式计算:
C (μmol·L-1)= 6.45(A532-A600)-0.56A450
2.2 GSH含量的测定
取0.5 g根系或叶片加入4 mL预冷的15%偏磷
酸溶液, 冰浴研磨至匀浆, 4 ℃冷冻离心(10 000×g,
30 min), 取上清液作为待测液。测定方法参照Ell-
man (1959)的方法, 空白不加DTNB (二巯基双硝基
苯甲酸)。
2.3 氧化型/还原型抗坏血酸含量的测定
取1 g根系或叶片, 加入5 mL预冷的5% TCA,
冰浴研磨, 4 ℃冷冻离心(12 000×g, 20 min), 上清
液为待测液。抗坏血酸含量的测定参照Arakawa等
(1981)的方法略加改进。总AsA的测定, 取200 μL
根系或叶片样品提取液, 加0.5 mL 0.06%二硫苏糖
醇(DTT)和1 mL磷酸盐缓冲液(PBS) (150 mmol·L-1,
pH 7.7), 充分混匀, 置常温下反应30 min后加入0.5
mL 0.24% N-乙基马来酰亚胺(NEM), 混匀, 置常温
下再反应5 min。然后向上述反应体系中依次加入
0.5 mL TCA (20%)、0.5 mL H3PO4 (0.4%)、1 mL联
吡啶(0.5%)和0.5 mL FeCl3, 充分混匀后置40 ℃下
反应1 h, 测定534 nm处吸光值。测定还原型AsA
时以1 mL H2O代替DTT、NEM, 其他反应步骤同
上。从总AsA中减去还原型AsA的量即为氧化型
AsA的含量。分别以一系列已知浓度的AsA代替
植物组织提取液, 参照以上方法作标准曲线。
2.4 抗氧化系统酶活性的测定
参照Jiang和Zhang (2001)的方法, 取0.5 g叶片
或根系, 加5 mL磷酸钾缓冲液(50 mmol·L-1, pH 7.0,
内含1 mmol·L-1 EDTA、1% PVP), 冰浴研磨, 4 ℃
冷冻离心(12 000×g, 20 min), 上清液备用, 进行以
下酶活性测定。
SOD活性测定: 参照Giannopolitis和Ries (1977)
的方法, 以氮蓝四唑(NBT)光化还原反应50%抑制
率所需的酶量作为一个酶活性单位(U)。3 mL反应
液中含50 mmol·L-1 PBS (K3PO4, pH 7.8)、13 mmol·L
-1
甲硫氨酸(MET)、75 µmol·L-1 NBT、2 µmol·L-1核
朱昌华等: 抗氧化系统在海州香薷耐铜机制中的作用 1081
黄素、0.1 mmol·L-1 EDTA和酶提取液。此反应混
合液光照20 min后测560 nm处吸光值。
CAT活性的测定: 参照Aebi (1984)的方法。3 mL
反应混合液中含50 mmol·L -1 PBS (K3PO4, pH
7.0)、10 mmol·L-1 H2O2及适量待测酶液, 迅速测定
2 min内A240的连续变化值。
GR活性的测定: 参照Schaedle和Bassham
(1977)的方法。1.5 mL反应混合液中含50 mmol·L-1
PBS (K3PO4, pH 7.8)、2 mmol·L
-1 EDTA-Na2、0.5
mmol·L-1 GSSG、适量待测酶液及0.15 mmol·L-1
NADPH, 迅速测定3 min内A340的连续变化值。
APX活性的测定: 参照Nakano和Asada (1981)
的方法。3 mL反应混合液中含50 mmol·L-1 PBS
(K3PO4, pH 7.0)、0.3 mmol·L
-1 AsA、适量待测酶
液及0.1 mmol·L-1 H2O2, 迅速测定100 s内A290的连
续变化值。
POD活力的测定: 参照Hammerschmidt (1982)
的方法稍加修改。反应体系以愈创木酚(0.25%)和
H2O2 (0.75%)为底物, 适量待测酶液启动反应, 迅速
测定3 min内A460的连续变化值。
采用SPSS 16.0 (LSD)软件统计差异显著性。
实验结果
1 铜对植株干重的影响
如图1所示, 与对照相比, 50 µmol·L-1 Cu处理
对海州香薷根系和地上部干重均没有显著影响
(P>0.05), 而100 和200 µmol·L-1 Cu处理则降低海
州香薷的根系和地上部干重, 并且根系干重与对
照呈显著差异(P<0.05), 但地上部干重与对照之间
无显著差异(P>0.05)。地上部/根系的干重之比随
铜处理浓度的增加而增加。结果表明, 海州香薷
根系对过量铜的反应比地上部分敏感。
2 铜对MDA含量的影响
MDA通常被认为是氧化伤害的生理指标, 其
含量的增加表明氧化胁迫程度的加剧。50 µmol·L-1
铜处理8 d即可引起根系中MDA含量的显著增加
(P<0.05) (图2)。当铜处理浓度从50 µmol·L-1增加
200 µmol·L-1时, 根系中MDA含量维持相对稳定。
而叶片中的MDA含量在不同铜处理之间没有显著
差异(P>0.05)。
3 铜对氧化型/还原型AsA含量的影响
50~200 µmol·L-1铜处理8 d后, 海州香薷根系
和叶片中的还原型抗坏血酸(AsA)含量与对照之
间没有显著差异(P>0.05) (表1)。而DHA含量、总
抗坏血酸(T-AsA)含量及DHA/AsA比值则随铜处
理浓度增加而显著增加(P<0.05)。与根系相比, 海
州香薷叶片有着较高的AsA含量和较低的DHA/
AsA比值。
4 铜对GSH含量的影响
根系和叶片中的GSH含量随着铜处理浓度的
增加而增加(图3), 当铜浓度达到50和100 μmol·L-1
时, 对照与处理的差异达到显著水平(P<0.05)。在
所有处理中, 叶片的GSH含量均显著高于根系中
的含量。
图1 不同浓度铜处理8 d对海州香薷根系和
地上部干重的影响
Fig.1 Effects of copper on root and shoot dry weights of
Elsholtzia haichowensis treated for 8 days
图2 不同浓度铜处理8 d对海州香薷根系和
叶片中MDA含量的影响
Fig.2 Effects of copper on MDA contents in leaves and roots
of Elsholtzia haichowensis treated for 8 days
植物生理学报1082
5 铜对抗氧化酶活性的影响
海州香薷叶片和根系中SOD活性均随铜处理
浓度增加而显著增加(P<0.05)(表2)。过量铜处理
也显著增加植株叶片和根系中POD活性(P<0.05)
(表2)。铜处理海州香薷叶片中的CAT和GR活性与
对照相比没有显著差异, 而根系中的CAT和GR活
性则随铜处理浓度增加而显著增加(P<0.05)(表
2)。50 µmol·L-1 Cu 处理对叶片的APX活性没有显
著影响(P>0.05), 但增加根系中的APX活性(表2);
但在高浓度Cu (100和200 µmol·L-1)处理下, 根系中
的APX活性与对照相比明显降低 , 而叶片中的
APX活性显著高于对照(P<0.05)。在所有处理中,
根系SOD、POD、APX和GR活性要高于叶片, 而
CAT则刚好相反。
表3结果显示, 随着处理铜浓度的增加, 根系
和叶片中SOD/POD活性比显著减少, 根系和叶片
中SOD/APX活性比、叶片中SOD/CAT活性比则略
有增加, 而根系中SOD/CAT活性比先下降而后又
恢复到CK水平。
讨　　论
铜过量会对植物产生毒害, 植物生物量降低
被认为是植物体受重金属胁迫时的最敏感的伤害
指标之一(Marschner 1995)。Shu等(2002)报道, 当
培养液中铜浓度>0.25 mg·L-1 (即4 µmol·L-1)时, Pas-
palum distichum 和 Cynodon dactylon的根系伸长就
受到显著抑制。Ye等(2003)的研究结果表明, 0.1
和0.5 mg·L-1 Cu显著抑制Phragmites australis根系
表1 不同浓度铜处理8 d对海州香薷叶片和根系中AsA、DHA、T-AsA含量及DHA/AsA的影响
Table 1 Effects of copper on the contents of AsA, DHA, T-AsA and the ratio of DHA/AsA in leaves and roots of
Elsholtzia haichowensis treated for 8 days
铜浓度/ AsA含量/μg·g-1 (FW) DHA含量/μg·g-1 (FW) 总AsA含量/μg·g-1 (FW) DHA/AsA
μmol·L-1 叶片 根系 叶片 根系 叶片 根系 叶片 根系
CK 206.36±6.25ab 41.09±0.34a 8.81±2.19b 9.83±2.64b 215.16±8.44c 50.92±2.97b 0.04c 0.24b
50 184.92±11.25b 40.96±0.22a 17.42±1.72b 24.76±1.50a 202.33±9.53c 65.72±1.72a 0.10bc 0.60a
100 226.84±1.41a 41.73±0.66a 35.60±1.56a 27.82±1.69a 262.44±2.97b 69.55±2.01a 0.16ab 0.67a
200 218.42±5.47ab 40.58±0.44a 48.05±3.59a 29.35±1.44a 266.46±1.88a 69.93±1.88a 0.22a 0.72a
　　同列不同字母代表在5%水平上达到显著差异。
表2 不同浓度铜处理8 d对海州香薷根系和叶片的SOD、POD、CAT、GR、APX活性的影响
Table 2 Effects of copper on activities of SOD, POD, CAT, GR and APX in leaves and roots of
Elsholtzia haichowensis treated for 8 days
铜浓度/ SOD活力/U·g-1 (蛋白) POD活力/U·g-1 (蛋白) CAT活力/U·g-1 (FW) GR活力/U·g-1 (蛋白) APX活力/U·g-1 (FW)
μmol·L-1 叶片 根系 叶片 根系 叶片 根系 叶片 根系 叶片 根系
CK 6.39±0.34b 25.88±0.48b 0.64±0.13c 40.91±8.61c 0.76±0.05a 0.15±0.01c 0.09±0.00a 0.20±0.03c 0.08±0.01a 8.33±0.09b
50 7.18±0.29b 28.99±1.22ab 1.24±0.14bc 188.07±17.53b 0.68±0.10a 0.19±0.00b 0.09±0.01a 0.30±0.01bc 0.74±0.05a 10.11±0.18a
100 9.46±0.17a 32.83±1.52ab 2.07±0.09a 229.35±2.83ab 0.67±0.12a 0.20±0.01b 0.12±0.01a 0.34±0.02b 1.02±0.11a 6.36±0.11c
200 9.52±0.28a 41.71±3.65a 1.84±0.10ab 266.08±16.94a 0.70±0.01a 0.24±0.01a 0.10±0.00a 0.46±0.01a 1.03±0.02a 4.63±0.40d
　　
图3 不同浓度铜处理8 d对海州香薷中GSH含量的影响
Fig.3 Effects of copper on GSH contents in leaves and roots
of Elsholtzia haichowensis treated for 8 days
朱昌华等: 抗氧化系统在海州香薷耐铜机制中的作用 1083
和地上部的生长。不同生态型Silene armeria根系
生长受影响/抑制的铜浓度为2~10 µmol·L-1 (Llugany
等2003)。Shen等(1998)报道用5~50 µmol·L-1铜处
理绿豆幼苗时, 随着铜浓度的增加, 植株鲜重和根
长均下降。而本实验结果显示, 在50~200 µmol·L-1
铜处理条件下, 海州香薷地上部干重没有显著降
低, 低浓度铜(50 µmol·L-1)处理对海州香薷根系干
重也没有显著影响(表1)。Yang等(2002)研究表明,
与对照相比, 50和100 µmol·L-1铜可促进海州香薷
的生长, 增加根系伸长量和植株干重。这些结果
表明, 与其它植物相比海州香薷有着较高的耐铜
毒能力(Shu等2002; Shen等1998; Thomas等1998;
Ouzounidou 1995)。
Cu在植物组织中的大量积累会诱导氧化胁
迫, 主要表现为MDA含量增加、质膜透性增大、
K+大量外渗(Pätsikkä等2002; 周长芳等2001; Luna
等1994)。本实验研究结果表明, 用不同浓度Cu处
理海州香薷8 d后, 过量Cu处理会导致根系MDA含
量增加, 但过量Cu对叶片中MDA含量无明显影响
(图2), 这说明Cu可以导致海州香薷根系受到一定
程度的氧化胁迫。
植物细胞内存在的SOD、POD、CAT、APX
和GR等抗氧化酶可以在一定程度上抵御各种环境
因子造成的氧化胁迫 , SOD将O 2·-歧化为H 2O 2,
POD、CAT、APX和GR则负责H2O2的清除(Wei等
2010; Sheih等2009)。研究表明, Cu胁迫可以启动
植物的抗氧化酶系统, 以清除过量的H2O2和O2·- , 从
而防止氧化伤害或毒性更强的自由基·OH的形成
(Singh等2010; Lombardi和Sebastiani 2005; Srivas-
tava等2005; Devi和Prasad 1998; Luna等1994)。
Chen等(2000)用铜处理水稻幼苗后发现, 铜处理增
加了SOD、APOD、GR和POD的活性, CAT的活
性没有显著变化。Xu等(2008)将大麦pAPX克隆到
拟南芥上发现pAPX的过量表达可提高拟南芥抗
Zn、Cd毒害的能力。本实验结果显示, 根系中除
APX活力在高浓度铜处理下降低外, POD、CAT、
和SOD、GR活力均随着铜浓度的增加而升高, 而
叶片中除POD和SOD活力随着铜浓度的升高而略
有增加外, CAT和APX、GR活力与对照相比都无
显著差异(表2)。这些结果表明在Cu胁迫下, 根系
中抗氧化酶可以在一定程度抵御过量Cu造成的氧
化胁迫。而在叶片中, MDA含量和抗氧化酶活力
受铜处理的影响较小, 是与该植物叶片细胞没有
受到活性氧伤害有关还是与叶片中CAT水平较高
有关尚需要进一步研究。正常生长的海州香薷(对
照)根系中POD、APX和GR的活力分别是叶片中
的64、10和2倍, 而根系中CAT的活性仅为叶片中
的1/5 , 表明根系中负责清除H 2O 2的酶主要是
POD、APX和GR, 而叶片中则以CAT为主。
对于植物体中不同的抗氧化酶来说 , 如果
SOD增加的幅度比CAT、POD、APX大的多, 即
SOD/CAT、SOD/APX、SOD/POD比值增加, 则
SOD分解产生的H2O2就不能及时被清除, 积累的
H2O2将会与未被SOD分解的O2·-在Cu等的催化下通
过Fenton反应形成OH., 加剧氧化胁迫(Shah等
2001)。为此, 我们比较了叶片和根系内SOD与
POD、CAT、APX活性的比值(表3), 结果表明在
0~200 µmol·L-1 Cu之间叶片和根系中抗氧化酶作用
发挥的均较好, 可以防御此浓度以下的Cu毒害。
越来越多的研究显示, 抗坏血酸-谷光甘肽循
环广泛参与植物受到生物和非生物胁迫时产生的
H2O2的清除(Drazkiewicz等2003; Costa等2002;
Kuzniak和Sklodowska 2001; Prasad等1999; Ranieri
等1993)。本实验结果表明, 不同浓度铜处理8 d时,
根系和叶片中AsA含量与对照无显著差异, 而T-
AsA、DHA含量及DHA/AsA值均较对照显著升高
(表1)。在所有处理中 , 海州香薷叶片和根系中
AsA含量都高于DHA含量, 尤其是叶片中AsA含量
是DHA的5~11倍, 这是否与海州香薷叶片的MDA
含量不受过量铜胁迫影响有关需要进一步研究。
DHA/AsA 值越小, 系统对H2O2的还原能力越强。
表3 不同浓度铜处理8 d对海州香薷根系和叶片SOD/
POD、SOD/CAT、SOD/APX比值的影响
Table 3 Effects of copper on the ratio of SOD/POD, SOD/
CAT, SOD/APX in leaves and roots of
Elsholtzia haichowensis treated for 8 days
铜浓度/ SOD/POD SOD/CAT SOD/APX
μmol·L-1 叶片 根系 叶片 根系 叶片 根系
CK 10.05 0.63 8.36 173.14 7.95 3.11
50 5.78 0.15 10.55 152.76 9.74 2.87
100 4.56 0.14 14.11 165.21 9.27 5.16
200 5.17 0.16 13.63 171.54 9.21 9.00
植物生理学报1084
Xu等(2011)研究表明, GSH在香蒲耐Cd机制中具
有重要作用, 根系中与GSH相关的螯合系统在缓
解香蒲Cd毒害的过程中起主要作用, 而在叶片中
与GSH相关的抗氧化防御系统起主要作用。本实
验结果显示过量铜处理可以促进根系和叶片中
GSH的合成(图3), 有利于DHA还原成AsA。这些结
果表明, 海州香薷体内的抗坏血酸-谷光甘肽循环可
能在对抗铜诱导的氧化胁迫中具有重要的作用。
参考文献
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