全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (8): 779~783 779
收稿 2012-04-16　　修定 2012-06-06
资助 国家自然科学基金(31071065)和国家重点基础研究发展计
划资助“973”项目(2010CB126501)。
* 共同通讯作者(E-mail: luoshuping2008@163.com, yz-
wang@sippe.ac.cn; Tel: 0991-8763713, 021-54924167)。
蒺藜苜蓿MtROP5启动子与GUS基因融合构建的稳定转化及其表达特性
赵志强1, 冯利兴2, 罗淑萍1,*, 王彦章2,*, 陈爱民2
1新疆农业大学农学院, 乌鲁木齐830052; 2中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所植物分子遗传国家重点实
验室, 上海200032
摘要: 本文以3~4周大小的蒺藜苜蓿R108-1的叶片为外植体, 通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统将MtROP5启动子与GUS
报告基因的融合构建导入蒺藜苜蓿中, 该转化系统经体胚发生产生转化的再生植株。利用PCR扩增对转化植株进行初步
鉴定, 并通过GUS化学染色法分析MtROP5启动子的组织表达特性。结果表明MtROP5启动子主要在蒺藜苜蓿根、花、果
荚、叶片和种子中表达。
关键词: 蒺藜苜蓿; 小G蛋白; MtROP5; 遗传转化; 表达分析
Stable Transformation and Tissue Expression of Medicago truncatula Gaertn.
Directed by MtROP5 Gene Promoter
ZHAO Zhi-Qiang1, FENG Li-Xing2, LUO Shu-Ping1,*, WANG Yan-Zhang2,*, CHEN Ai-Min2
1College of Agriculture, Xinjiang Agricutural University, Urumqi 830052, China; 2National Laboratory of Plant Molecular Ge-
netics, Institute of Plant Physiology & Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shang-
hai 200032, China
Abstract: In this study, we used the leaves of 3 to 4-week-old plants of Medicago truncatula R108-1 as ex-
plants, and introduced the construct harboring MtROP5 promoter fused to reporter GUS into Medicago truncat-
ula through Agrobacterium-mediated transformation. The regenerated plants were obtained via somatic em-
bryogenesis. We first identified the regenerated plants by PCR, and further analyzed tissue expression of
MtROP5 promoter using GUS histochemical assay. The results showed that MtROP5 promoter predominantly
expressed in roots, flowers, pods, leaves and seeds.
Key words: Medicago truncatula; small G protein; MtROP5; genetic transformation; expression analysis
ROP GTPase是植物特有的一类小G蛋白, 是
植物信号网络中重要的信号调节蛋白, 介导调控
很多信号途径, 主要参与细胞极性、发育与形态
建成、胞质分裂、激素信号响应以及植物和微生
物互作等方面的调控(Berken 2006; Nibau等2006;
Gu等2004; Yang和Fu 2007)。ROP蛋白在细胞内有
两种形式, 即GTP结合的活化形式和GDP结合的非
活化形式, 通过这两种形式的GTPase循环转换, 打
开或关闭细胞信号通路, 完成信号传导的过程。首
先, 配体信号分子与胞内受体蛋白相结合, 促使失
活形式的ROP解离GDP, 并且结合GTP, 从而激活
ROP GTPase蛋白。激活形式的ROP GTPase蛋白通
过膜定位信号位点结合在不同的膜上, 通过与上游
调节因子和下游效应因子之间的相互作用, 从而进
一步调节细胞的生物学过程(Zheng和Yang 2000;
Nibau等2006; Shichrur和Yalovsky 2006; Yang 2002)。
我们前期的研究结果表明, MtROP5的过量表
达和组成型激活突变均能显著促进蒺藜苜蓿根毛
的伸长, 而通过RNAi干扰降低MtROP5的转录水平
后, 根毛的生长发育明显受到了抑制。通过RT-PCR
分析表明, MtROP5基因在蒺藜苜蓿的根、茎、叶、
花、根瘤中均有表达(刘伟等2010a, b)。为了更深入
地研究MtROP5的功能, 本文拟通过根癌农杆菌介导
的遗传转化方法, 将MtROP5的启动子与报告基因
GUS融合, 并转化蒺藜苜蓿叶片外植体, 以期获得稳
定转化的植株, 采用GUS染色检测MtROP5在植株不
同组织中的表达特性。为进一步研究MtROP5感受
根瘤菌信号分子调节根毛的生长发育及可能参与植
物与根瘤菌共生互作早期的传导过程奠定基础。
植物生理学报780
材料与方法
1 植物材料和菌株
蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)生态型
R108-1的种子由中国科学院上海生命科学研究院
植物生理生态研究所分子遗传实验室提供。选取
健康的种子萌发并移栽到土中, 取长到3~4周植株
的叶片为转化用外植体。根癌农杆菌EHA105/
proMtROP5::GUS为本实验室构建保存。该菌株
的构建是以蒺藜苜蓿基因组DNA为模板 , 通过
PCR方法扩增MtROP5基因起始密码子上游约2.1
kb的启动子序列, PCR产物回收后利用EcoRI和
NcoI的酶切位点连入pCAMBIA301P0G, 从而得到
MtROP5基因启动子与GUS报告基因的融合载体
proMtROP5::GUS。再将构建好的载体质粒经冻
融法转入根癌农杆菌菌株EHA105中。
2 试验方法
2.1 菌株活化及培养
挑取EHA105/proMtROP5::GUS的单克隆于
含有20 mg·L-1 Rifampicin和50 mg·L-1 Kanamycin的
YEB液体培养基中, 28 ℃摇床过夜培养。再将培
养好的菌液以1%的接种量接种到50 mL含有相同
抗生素的新鲜YEB液体培养基中, 28 ℃培养至菌
液OD值为0.8~1.0即可。
植物转化的基本培养基为SH, 转化试验中所
用培养基如下: (1) SH3a-C共培养培养基: SH+2,4-
D 4 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+肌醇100 mg·L-1+蔗糖
30 g·L-1+植物凝胶Phytagel 0.3%。(2) SH3a-S愈伤
诱导培养基: SH+2,4-D 4 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+
肌醇100 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+Phytagel 0.3%+头孢
霉素400 mg·L-1+特美汀400 mg·L-1。(3) SH9体胚
诱导培养基: SH+肌醇100 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+琼
脂0.8%。(4) 1/2SH生根培养基: 1/2SH+肌醇100
mg·L-1 +蔗糖10 g·L-1+琼脂0.9%, 以上培养基pH值
均调为5.8。
2.2 材料的无菌处理
剪取完整叶片, 用自来水(加2~3滴去污剂)置
于摇床上摇动洗涤15 min, 用缓慢的流水冲洗叶片
15 min。在超净工作台上用8%的次氯酸钠灭菌处
理8 min, 无菌水冲洗5~6次, 用无菌吸水纸吸干叶
片表面的水分。然后用无菌解剖刀把叶片外植体
切成方形备用。
2.3 侵染和共培养
培养好的菌液以5 000 rpm离心15 min, 用加
有4 mg·L-1 2,4-D和0.5 mg·L-1 6-BA的SH3a-C液体
培养基重悬并稀释到OD600为0.3左右。将切好的
外植体叶片用菌悬液浸泡, 置于真空条件下10 min
(0.095~0.1 MPa), 缓慢释放真空后, 放置于摇床上
(70~90 rpm) 30 min。用灭菌纸巾将侵染后的叶片
蘸干, 转移到SH3a-C固体培养基上, 叶片外植体远
轴面接触培养基, 用保鲜膜密封后置于光照培养
箱暗培养3 d (白天24 ℃, 夜晚22 ℃)。
2.4 诱导胚性愈伤组织
共培养后的外植体经无菌水漂洗清除农杆菌
后, 用无菌纸巾蘸干并转移到含有筛选抗生素的
SH3a-S固体培养基上, 持续暗培养4~6周, 诱导胚
性愈伤组织。定期查看并剔除污染和农杆菌生长
过度的外植体, 每2周更换一次新鲜的培养基。
2.5 诱导体胚的发生
将胚性愈伤组织转移至SH9培养基上, 在光照
条件下培养(16/8光周期, 60%相对湿度, 白天24 ℃,
夜晚22 ℃, 光照强度200 μmol·m-2·s-1)。愈伤组织
上形成的胚性愈伤组织会在4~6周内形成真正的
体胚。分化出来的子叶胚尽量用解剖刀使它们分
离开, 在随后的发育中可形成一株株无根小苗。
2.6 诱导生根
当无根小苗长至1 cm以上, 并具有多片小叶
时, 可将其转移到1/2SH培养基上诱导生根, 此时
培养皿要倾斜60°或者垂直放置。
2.7 转基因植株的驯化及移栽
当小苗生出主根并有几条侧根, 形成比较完
整的根系统后, 进行驯化移栽。将小苗根部的培
养基清除干净后插入到大试管中, 加自来水浸没
根部, 放入温室中驯化1~2 d。驯化好的转基因苗
移栽到花盆中, 用薄膜覆盖, 待小苗成活并长出新
叶才可打开薄膜。花盆中的土由蛭石、黑土和珍
珠岩按3:1:1的比例混合而成。
2.8 转基因植株的鉴定
2.8.1 报告基因GUS检测 取新鲜的抗性愈伤组织
和抗性植株的各组织, 将材料浸泡于GUS染色液,
37 ℃染色12 h后, 分别用70%、80%、90%和100%
乙醇脱色。每个样本重复3次。
2.8.2 分子生物学检测(PCR) 分别取转基因植株
赵志强等: 蒺藜苜蓿MtROP5启动子与GUS基因融合构建的稳定转化及其表达特性 781
和对照未转化植株的叶片, 用CTAB法提取DNA作
为PCR的模板。用Hygromycin抗性基因序列设计
的引物进行PCR扩增。引物为Hygromycin-F: 5′
GCGCGTCTGCTGCTCATACA 3′和Hygromycin-
R: 5′ GCTGCGCCGATGGTTTCTACA 3′。反应条
件为: 94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火
50 s, 72 ℃延伸40 s, 30个循环; 最后72 ℃保温5
min。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳并用
凝胶成像系统(QuantityOne Bio-Rad)分析。
2.8.3 转基因植株中MtROP5启动子的表达 转基
因植株T0的种子萌发、移栽1周后, 对小苗进行
GUS染色, 37 ℃染色12 h后, 分别用70%、80%、
90%和100%乙醇脱色。每个样本重复3次, 观察
MtROP5启动子在各组织中的表达。
实验结果
1 转化体系的建立
选择低拷贝、高转化效率的农杆菌转化系统
(Gelvin 2003), 以适合蒺藜苜蓿再生的农杆菌EHA-
105为载体, 以高再生频率的蒺藜苜蓿R108-1叶片(图
1-A)作为外植体(Cosson等2006)。共培养3 d为最
佳时间(图1-B), 侵染时间太短, 转化侵染的效率低,
时间过长, 农杆菌生长过度包裹外植体, 使外植体致
死。外植体被诱导逐渐脱分化形成愈伤组织(图
1-C), 可形成愈伤组织的比例高达90% (图1-D)。愈
伤组织胚胎化产生松散的胚性愈伤组织(图1-E), 形
成率不到50%。胚性愈伤组织进一步分化出好多绿
芽(图1-F), 并逐渐生长成为小植株。分离小植株(图
1-G)使其生根, 平板垂直放置可以使根贴着培养基,
能很好地促使根生长。带有根的幼苗(图1-H)很有
必要进行驯化, 否则会大大降低移栽苗的成活率。
移栽后的小苗(图1-I)要用塑料薄膜套住保湿, 这是
进一步提高成活率的重要步骤。
2 GUS化学染色法检测转基因植株
转基因植株小苗移栽后, 取少量叶片进行GUS
染色, 发现80%的转基因植物染色后均能显蓝色
图1 蒺藜苜蓿遗传转化过程
Fig.1 Procedure for the genetic transformation of M. truncatula
A: 准备转化的外植体; B: 侵染后的叶片; C: 叶片脱分化; D: 愈伤组织; E: 胚性愈伤组织; F: 诱导形成的小芽; G: 茎的伸长培养; H: 生
根培养; I: 移栽到土中已成活的小苗。
植物生理学报782
(图2), 表明转化的效率较高。此时初步证明目的
基因已成功插入到植物体基因组中。
3 转基因植株的PCR鉴定
提取具有潮霉素抗性转基因植株的基因组
图2 转基因植株的GUS检测
Fig.2 GUS histochemical assay of transgenic plants
DNA, 以质粒为阳性对照模板, 未转化的植株基因
组DNA为阴性对照模板, 对潮霉素抗性基因片段
进行特异性扩增。琼脂糖凝胶电泳结果表明, 转
基因苗均能扩出单一条带, 与阳性对照大小相同,
均为600 bp (图3)。未转化植株的扩增结果为阴性,
证明目的基因已经成功转入蒺藜苜蓿基因组中。
讨　　论
豆科植物是世界上最重要的农作物之一, 其
中大豆、苜蓿、豌豆和蚕豆等豆科植物, 已成为
现代农业系统发展的基础。豆科植物不但是人类
食物中蛋白质的主要来源, 而且也是重要的饲料
和油料。有关豆科植物的遗传转化一直都是一个
难题, 严重制约了对豆科植物更深入地研究探索
(Somers等2003)。蒺藜苜蓿作为豆科的模式植物,
成为豆科植物学研究的主要研究材料, 建立高效
的遗传转化和再生系统是研究蒺藜苜蓿基因功能
的一个重要手段(陈爱民等2006; 魏臻武和盖钧镒
2008)。蒺藜苜蓿被认为是难以转化的, 只有很少
的栽培品种具有较高的体外再生频率(陈爱民等
2006)。蒺藜苜蓿由于品种繁多, 生长周期长, 依赖
基因型, 想得到高效、稳定的遗传转化体系比较
困难, 不同的品种基因型都是需要不同的转化体
系。国内有关蒺藜苜蓿遗传转化的报道还比较少,
本实验室用高再生基因型蒺藜苜蓿R108-1叶片为
外植体, 配合适合的菌种EHA105对影响遗传转化
的若干因素进行了优化, 找到了一种高效的蒺藜
苜蓿遗传转化系统。利用遗传转化的方法 , 使
MtROP5基因成功导入到蒺藜苜蓿中, 通过GUS化
学染色法, 了解到MtROP5在蒺藜苜蓿各组织中的
表达情况, 为后续研究MtROP5在豆科植物与根瘤
图3 转基因植株PCR鉴定
Fig.3 PCR assay of transgenic plants
1: 15 Kb DNA分子量标准; 2: 阳性质粒对照; 3~15: GUS染色
鉴定的转基因植株; 16: 野生型对照。
对于鉴定过转基因植株各组织用X-Gluc染色
液染色。染色后的花、茎、叶、果荚、幼嫩的种
子以及根等各组织均有蓝色沉淀物出现, 但颜色
深浅有差异(图4)。这表明, MtROP5启动子蒺藜苜
蓿的花、茎、叶、果荚、幼嫩的种子以及根等各
组织均有表达, 但表达强弱不同。其中, 叶、根、
果荚种子和根要比花和茎的表达要强。
赵志强等: 蒺藜苜蓿MtROP5启动子与GUS基因融合构建的稳定转化及其表达特性 783
菌共生早期信号调控奠定了一定的基础。
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图4 转基因植株各组织的GUS染色
Fig.4 GUS staining of different tissues from transformed plants
A: 转基因植株T0代种子萌发1周后的幼苗; B: 转基因植株T0代植株收获的种子; C: 转基因植株T1代幼苗; D: 转基因植株T1代的果荚;
E: 转基因植株T1代的花; F: 阴性对照未转化的R108-1萌发1周后的幼苗。