全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (6): 575~580 575
收稿 2011-01-06　　修定 2011-04-20
资助 “973”计划(2007CB108802)和植物化学与西部植物资源
持续利用国家重点实验室自主课题(P2008-ZZ16和P2009-
ZZ02)。
* 通讯作者(E-mail: biochem@mail.kib.ac.cn; Tel: 0871-5223210)。
粗毛淫羊藿的类黄酮异戊烯转移酶基因的克隆与表达分析
陈倩倩1,3, 高娟1, 赵沛基1, 卢山2, 曾英1,*
1中国科学院昆明植物研究所, 植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室, 昆明 650204; 2南京大学生命科学学院,
南京 210093; 3中国科学院研究生院, 北京 100049
摘要: 药用植物淫羊藿富含异戊烯类黄酮, LC-MS定量分析表明, 3~4月份粗毛淫羊藿叶片处于变色期时淫羊藿苷含量最
高。通过简并引物和RACE-PCR从粗毛淫羊藿叶片获得异戊烯转移酶同源基因(命名为EaPT1)。序列分析表明, EaPT1与
维生素E合成相关的尿黑酸异戊烯转移酶位于同一进化枝, 靠近类黄酮异戊烯转移酶。RT-PCR结果显示, EaPT1在叶片和
幼茎中表达显著。
关键词: 淫羊藿苷; 异戊烯转移酶; 异戊烯类黄酮; 粗毛淫羊藿
Cloning and Expression Analysis of Flavonoid Prenyltransferase-Like Genes
in Epimedium acuminatum Franch
CHEN Qian-Qian1,3, GAO Juan 1, ZHAO Pei-Ji 1, LU Shan 2, ZENG Ying1,*
1State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of
Sciences, Kunming 650204, China; 2School of Life Science, Nanjing University, Nanjing 210093, China; 3Graduate University of
the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: The traditional Chinese medicinal plant, Epimedium acuminatum, is remarkably rich in pharmaco-
logically active prenylflavonoids. LC-MS analysis indicated that the leaves of Epimedium acuminatum had the
highest icariin content in the color phase (from March to April). A prenyltransferase-like gene (named EaPT1)
was cloned from those leaves with degenerate primers and subsequent rapid amplification of cDNA ends
(RACE). The deduced protein sequence of EaPT1 grouped together with homogentisate phytyltransferases rel-
evant to vitamin E biosynthesis and closely related to the flavonoid prenyltransferases. The EaPT1 transcripts
significantly accumulated in leaves and young stems by RT-PCR.
Key words: icariin; prenyltransferase; prenylflavonoid; Epimedium acuminatum
异戊烯类黄酮(prenylflavonoid)是指黄酮类化
合物的芳环在不同位置被不同长度和修饰各异的
异戊烯基取代 , 主要存在于豆科、桑科、芸香
科、小檗科等植物中 (李文魁等1995; 赵平等
2004)。催化异戊烯单元转移到黄酮类化合物的酶
称为类黄酮异戊烯转移酶(flavonoid prenyltrans-
ferase), 它与泛醌、质醌和维生素E生物合成中的
异戊烯转移酶PPT、HST、HPT和HGGT, 同属于
膜结合型芳香族异戊烯转移酶(高娟等2010)。其
中催化简单酚类中间体对羟基苯甲酸(p-hydroxy-
benzoate)和尿黑酸(homogentisate)发生异戊烯取代
的异戊烯转移酶编码基因及其相应的催化功能已
相继被阐明(Ashby等1992; Collakova和DellaPenna
2001; Okada等2004; Sadre等2006; Venkatesh等
2006; Yazaki等2002), 但这些酶具有严格的底物选
择性, 不能催化类黄酮起始骨架分子4′,5,7-三羟黄
烷酮(柚皮素)的异戊烯取代反应, 故而推测不同的
异戊烯转移酶参与了异戊烯类黄酮化合物的生物
合成。2008年, Sasaki等从豆科植物苦参(Sophora
flavescens Alt.)中克隆了第1个植物类黄酮异戊烯
转移酶基因SfN8DT-1, 之后Akashi等(2009)通过大
豆表达序列标签(EST)获得参与大豆素(glyceollin)
生物合成的类黄酮异戊烯转移酶GmG4DT基因。
氨基酸序列分析表明, SfN8DT-1和GmG4DT与维
生素E生物合成中的HPT和HGGT的序列同源性为
33%∼52%, 而与泛醌生物合成中的对羟基苯甲酸
异戊烯转移酶P P T的序列同源性在1 2 %以下
植物生理学报576
(Akashi等2009)。因此, 无论是蛋白质序列还是底
物特异性都表明植物类黄酮异戊烯转移酶在芳香
族异戊烯转移酶家族里, 是一类功能新颖结构独
特的生物合成酶。
传统中草药粗毛淫羊藿为小檗科(Berberi-
daceae)淫羊藿属(Epimedium)植物, 富含异戊烯黄
酮类化合物, 如淫羊藿苷(icariin)和淫羊藿定A-C
(epimedin A-C), 这类化合物通常具有增强免疫与
调节内分泌的作用(Shen等2007; Dell’Agli等
2008)。最近, 武汉植物园王瑛等以箭叶淫羊藿
[Epimedium sagittatum (Sieb. Et Zucc.). Maxim]为
实验材料, 构建了含76 459条序列的大型EST库
(Zeng等2010), 为淫羊藿植物次生代谢特别是类黄
酮生物合成途径的解析奠定了基础。本文以粗毛
淫羊藿为实验材料, 采用液相/质谱(LC-MS)内标
法测定了不同生长时期叶片淫羊藿苷的含量, 根
据植物芳香族异戊烯转移酶保守序列设计简并引
物, 通过基于相似性的同源克隆策略从叶片RNA
得到2条cDNA片段, 其编码的蛋白序列类似于维
生素E生物合成中的尿黑酸异戊烯转移酶, 利用
RACE获得一条全长基因并命名为EaPT1。
材料与方法
1 实验材料、仪器和试剂
粗毛淫羊藿(Epimedium acuminatum Franch.)
采自昆明植物园东园岩石园区。
LC-MS型号为LCQ Advantage (Thermo Finni-
gan) electrospray ionization mass detector (ion trap)。
淫羊藿苷标准品由中国科学院成都生物研究
所丁立生研究员馈赠, 内标化合物4-羟基二苯甲酮
(4-hydroxybenzophenone, HB)购自Fluka, 反转录试
剂盒SuperScriptTM III First-strand Synthesis system for
RT-PCR和GeneRacerTM Kit购自Invitrogen, 内切酶购
自Fermentas (MBI), PCR试剂及克隆试剂盒购自宝
生物工程(大连)有限公(Takara), 引物合成及测序由
上海生工生物公司(Shanghai Sangon Co.)完成。
2 实验方法
2.1 不同生长期的粗毛淫羊藿中淫羊藿苷含量测定
3~10月生长时期每月采集叶片, 于4月6日采
集处于花蕾期的幼茎, 经硅胶干燥并用真空泵抽
干保存。准确称取0.2 g干燥的叶片或幼茎样品,
加入3.0 mL甲醇和247 μg内标化合物HB (0.26 mL,
0.95 mg⋅mL- 1, 甲醇配置), 在37 ℃浸提7 d; 浸提液
经抽气浓缩后加0.5 mL甲醇再次溶解, 离心取上清
液进行LC-MS检测。色谱条件: Xterra MS C18 (5 μm,
3.0 mm×150 mm), 流动相为甲醇(A)和0.5%甲酸水
(B), 流速为0.2 mL⋅min-1, 在30 min内甲醇的比例从
开始的85%提高到100%。质谱条件: 喷涂电压5.20
kV, 鞘气流速15.0 arb, 传输毛细管电压23.0 V, 传
输毛细管温度275.0 ℃, 透镜电压45.0 V, 进样量为
10 μL。每个样品重复测定3次。该试验条件下, 淫
羊藿苷和HB的保留时间分别为8.3 min和10.9 min,
准分子离子峰分别为: 淫羊藿苷m/z: 677 [M+H]+,
HB m/z: 199 [M+H]+。
准确称取0.9 mg 淫羊藿苷加入1 mL甲醇定
容。取淫羊藿苷母液10、20、50、150、200 μL,
分别加入内标100 μL, 用甲醇配制成总体积分别为
1 mL的标样。取10 μL按上述条件进行LC-MS检
测, 重复3次, 记录峰面积。以淫羊藿苷与内标HB
的质量比为纵坐标, 峰面积之比为横坐标, 绘制标
准曲线求得线性方程。根据LC-MS测定的样品淫
羊藿苷与HB的峰面积比值, 代入标准曲线的线性
方程计算淫羊藿苷与HB的质量比; 已知每个样品
的内标HB为247 μg, 样品量0.2 g, 从而计算出样品
淫羊藿苷的含量。
2.2 第一链cDNA合成与粗毛淫羊藿类黄酮异戊烯
转移酶基因的克隆
取变色期(3月23日)的古铜色幼嫩叶片, 用
CTAB法(Zeng和Yang 2000)提取总RNA, 用紫外分
光光度计和琼脂糖电泳检测RNA质量, 使用Super-
scriptTM III First-strand Synthesis System for RT-PCR
(Invitrogen)合成第一链cDNA。根据已知的芳香族
异戊烯转移酶的序列比对信息设计6条简并引物
(表1), 以第一链cDNA为模板进行各种引物组合以
及不同条件的PCR反应, 胶回收目的片段并克隆测
序。用Oligotex mRNA kit (Qiagen)从总RNA纯化
mRNA, 使用GeneRacerTM Kit (Invitrogen, Cat
no.45-0168)合成RACE第一链cDNA。根据特异片
段的DNA序列设计特异引物, 分别进行RACE PCR
获得5′和3′端序列, 最后根据5′和3′端序列信息合
成引物对, 扩增EaPT1的完整开放阅读框(ORF)及
部分Ultra区序列。
陈倩倩等: 粗毛淫羊藿的类黄酮异戊烯转移酶基因的克隆与表达分析 577
2.3 EaPT基因表达载体的构建与在大肠杆菌中的
表达
选择合适的酶切位点并设计特异引物对, 用
高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara)
扩增带有酶切位点的基因全长读码框以及去N端
叶绿体信号肽的基因序列, 连接到大肠杆菌(Es-
cherichia coli)表达载体pET32a(+)。经测序确认
DNA序列正确后, 将表达质粒转入大肠杆菌表达
菌株BL21(DE3)、Rosetta-gamiB(DE3)和RosettaTM
2(DE3)plysS, 进行融合蛋白的诱导表达。诱导剂
IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)终浓度
为0.2~1.0 mmol⋅L-1, 变换诱导温度和时间进行重组
蛋白的诱导表达。SDS-PAGE电泳检测重组蛋白,
融合表达的全长和去信号肽蛋白应分别为63.2和
59.1 kDa。
2.4 基因组织特异性表达的检测
提取粗毛淫羊藿变色期(3月23日)叶片和处于
花蕾期(4月6日)幼茎的mRNA、第一链cDNA合成同
前文。以Actin为内标进行组织特异的半定量RT-PCR
分析, 经测序确认扩增片段的DNA序列与相应的
EaPT1和 EaPT2序列一致。粗毛淫羊藿Actin cDNA片
段编码蛋白的氨基酸序列与芒果(Mangifera indica)
actin 9 (GenBank登录号ADX97326)第98~187位的
氨基酸序列完全相同。
结果与讨论
1 变色期叶片淫羊藿苷含量最高
栽培于昆明植物园东园的粗毛淫羊藿一般2
月初开始从地面萌动长出新芽, 幼茎迅速伸长的
同时, 顶端的花序和叶片也随之长大。以其中一
枝三出复叶的观察记录为例, 卷曲的绿色幼叶在3
月11日展开, 3月14日叶片出现浅褐色斑纹, 之后逐
渐变成偏红的古铜色, 3月21日叶片的古铜色最红,
然后古铜色逐渐消退, 直至4月4日叶片重新成为
绿色并开始革质化, 叶片变色期大约持续3周。为
了确定RT-PCR基因克隆的取材部位和时期, 以4-
羟基二苯甲酮(HB)作为内标, 对幼茎和不同生长
期的叶片进行了异戊烯类黄酮主成分淫羊藿苷含
量的LC-MS分析。以质量比m (淫羊藿苷)/m (HB)
为纵坐标(y), 峰面积比a (淫羊藿苷)/a (HB)为横坐
标 ( x ) , 绘制标准曲线 , 得到线性方程 :
y=0.2489x–0.1303, R2=0.9975。
LC-MS定量分析(表2)表明, 3∼4月份叶片处于
变色期时淫羊藿苷含量最高, 达到2.5 mg⋅g-1 (DW),
之后淫羊藿苷含量逐渐降低, 到10月份为1.0 mg⋅g-1
(DW)。绿色幼嫩叶片含有淫羊藿苷, 但幼嫩茎中
没有检测到。有报道巫山淫羊藿(Epimedium wu-
sh anense T. S. Ying)叶中淫羊藿苷和总黄酮的含量
以4月份花期最高, 朝鲜淫羊藿(Epimedium kore-
aum Nakai)的epimedin A-C及总黄酮含量均以5月
花期最高(侯集瑞等2004)。我们的研究结果也表
明, 粗毛淫羊藿在开花期间叶片处于变色期时, 叶
片淫羊藿苷含量最高。
2 基因克隆与序列分析
以变色期叶片R N A反转录而来的第一链
cDNA为模板, 通过不同的简并引物组合以及变换
PCR条件, 从PTs3和PTa1引物组合扩增到约600 bp
的特异片段(图1)。克隆测序后得到2条核苷酸序
列同源性为57%的特异基因片段, 其编码的蛋白序
列都与尿黑酸异戊烯转移酶存在一定的相似性,
利用RACE-PCR获得其中一条序列的全长(1 616
bp), 命名为EaPT1 (GenBank登录号JF326244)。另
表 1 简并引物序列
Table 1 Degenerate primer sequences
引物名称 　　　　　　引物序列 　 氨基酸序列与位置
PTs1 5′ YTN TAY MRI TTY WSI MGI CC 3′ 127F(L)YR(K)FC(S)RP133
PTs2 5′ ATH GTN GGI YTI AAY CAR YT 3′ 180 IVGLNQL 186
PTs3 5′ ATH GAY AAR RTI AAY AAR CC 3′ 191 IDKV(I)NKP 197
PTs4 5′ GTI ATH GCI YTI TTY AAR GAY 3′ 312 VIALFKD 318
PTa1 5′ GG DAT NAR IAR RTA YTC IGC 3′ 414 AEYL(F)LIP 420
PTa2 5′ RTC YTT RAA IAR IGC DAT IAC 3′ 312 VIALFKD 318
　　D (A/G/T), H (A/C/T), M (A/C), N (A/T/G/C), R (A/G), S (C/G), W (A/T), Y (C/T)。
植物生理学报578
一条序列只获得完整的3′端(964 bp), 命名为EaPT2
(GenBank登录号JF326245)。
EaPT1的开放阅读框为1 224 bp, 其编码蛋白
含407个氨基酸。用Chlorop v1.1预测信号肽, 发现
EaPT1的N端37个氨基酸很可能是叶绿体信号肽;
基于TMHMM分析, EaPT1含有9个跨膜区, 是典型
的跨膜蛋白。氨基酸序列分析(图2)表明, EaPT1与
苦参(S. flavescens) SfN8DT1、拟南芥(Arabidopsis
thaliana) AtHPT、大豆(Glycine max) GmHPT1和
表2 不同生长期叶片的淫羊藿苷含量
Table 2 Icariin contents in leaf of various growth stages
测定时间(月-日) 淫羊藿苷含量/mg⋅g-1 (DW) 峰面积比
　　 3-11 1.0∗ 3.76
　　 3-31 2.5∗∗ 8.88
　 　4-15 2.0 6.91
　 　5-15 1.5 5.36
　　 6-15 1.6 5.74
　 　7-15 1.4 5.19
　 　8-15 1.1 4.24
　　 9-15 1.0 3.81
　 　10-15 1.0 3.99
　　∗表示绿色幼叶; ∗∗表示变色期叶片。
图1 简并引物对PTs3和PTa1的PCR扩增片段电泳图
Fig.1 PCR amplification with degenerate
primer pairs PTs3 and PTa1
1: 退火温度47 ℃; 2: 退火温度50 ℃; M: 分子量标准; 箭头所
指为特异片段。
图2 EaPT1和EaPT2与植物芳香族异戊烯转移酶的部分序列比对
Fig.2 Sequence alignment of EaPT1 and EaPT2 with their close homologues from plant aromatic prenyltransferases
AgHGGT: 朝鲜当归(ACB42448); AtHPT: 拟南芥(NP_849984.1); EaPT1: 粗毛淫羊藿(JF326244); EaPT2: 粗毛淫羊藿(JF326245);
GmHPT1: 大豆(ABB70126.1); MeHPT: 木薯(ACC77744); SfN8DT1: 苦参(BAG12671.1); VvHGGT: 葡萄(AAV74623.1); ZmHPT: 玉米
(ABB70122.1)。
木薯(Manihot esculenta) MeHPT的氨基酸序列同
源性在45%∼68%, 与泛醌和紫草素生物合成中的
对羟基苯甲酸异戊烯转移酶AtPPT1的氨基酸序列
同源性最低(12%)。EaPT2编码的部分蛋白质与对
应的EaPT1部分蛋白质的氨基酸序列同源性为
52.8%, 与朝鲜当归(Angelica gigas)维生素E生物合
陈倩倩等: 粗毛淫羊藿的类黄酮异戊烯转移酶基因的克隆与表达分析 579
成相关的尿黑酸异戊烯转移酶AgHGGT的氨基酸
序列同源性最高(39%), 与拟南芥AtHPT、木薯
MeHPT和大豆GmHPT1的氨基酸序列同源性约为
30%, 与拟南芥和大豆质醌生物合成中的尿黑酸异
戊烯转移酶AtHST和GmHST的氨基酸序列同源性
约为17%。
用MAGE4.0对EaPT1、EaPT2和其他植物的
芳香族异戊烯转移酶进行系统发育分析, 结果(图
3)显示, EaPT1与木薯MeHPT、葡萄VvHGGT、大
豆GmHPT1和拟南芥AtHPT处在同一进化枝 ,
EaPT2与朝鲜当归AgHGGT和水稻OsHGGT位于
同一进化枝。与质醌生物合成中的尿黑酸异戊烯
转移酶HST相比, EaPT1和EaPT2都更靠近苦参Sf-
N8DT1和大豆和GmG4DT。
3 基因组织特异性表达的检测与在大肠杆菌中的
表达
以叶片和幼茎的第一链cDNA为模板, 用Actin
作内标进行了EaPT1和EaPT2的组织特异性基因
表达的检测。半定量RT-PCR结果 (图4)显示 ,
EaPT1在叶片和幼茎中表达显著, EaPT2在叶片中
有较弱表达。考虑到幼茎中没有检测到淫羊藿苷,
而叶片淫羊藿苷含量较高(表2), 推测淫羊藿苷很
可能由叶细胞合成并储存, 当然也不排除幼茎合
成淫羊藿苷后输送到叶片储存的可能性。根据
EaPT1和EaPT2与维生素E合成中的尿黑酸异戊烯
转移酶以及类黄酮异戊烯转移酶存在较高的氨基
酸序列同源性(图2和3), 结合组织特异的基因表达
分析和淫羊藿苷含量的LC-MS分析, 推测EaPT1有
可能参与淫羊藿异戊烯类黄酮和维生素E的生物
合成, 而EaPT2很有可能与淫羊藿异戊烯类黄酮的
生物合成有关, 因为LC-MS检测证实幼茎不含淫
羊藿苷, 该基因显然不在幼茎内表达。作为次生
代谢产物的淫羊藿苷的生物合成部位有一定的局
限性, 这同EaPT2基因表达的特定部位相吻合。当
然 , EaPT2也有可能是维生素E生物合成中的
HGGT, 因为它与朝鲜当归AgHGGT和水稻OsHG-
GT位于同一进化枝(图3)。
据Sadre等(2006)报道, 拟南芥和衣藻(Chloro-
phyta reinhardtii)质醌合成相关的异戊烯转移酶基
因AtHST和CrHST在去除叶绿体信号肽后, 能够在
图3 EaPT1和EaPT2与植物芳香族异戊烯
转移酶的系统发育分析
Fig.3 Phylogenetic relationship between EaPT1, EaPT2
and plant aromatic prenyltransferases
AgHGGT: 朝鲜当归(ACB42448); ApHPT: 韭葱(ABB70124);
AtHPT: 拟南芥(NP_849984.1); AtHST (NP_001078138.1): 拟南
芥; AtPPT1 (BAB20818.2): 拟南芥; CapHPT (ABB70125.1): 萼距
花属变种; CrHST (CAL01105.1): 衣藻; EaPT1 (JF326244): 粗毛
淫羊藿; EaPT2 (JF326245): 粗毛淫羊藿; GmG4DT (BAH22520):
大豆; GmHPT1 (ABB70126.1): 大豆; GmHST (ABB70128.1): 大
豆; HvHGGT (AAP43911.1): 大麦; LePGT1 (BAB84122.1): 紫
草; MeHPT (ACC77744): 木薯; OsHGGT (AAP43913.1): 水稻;
OsPPT1 (BAE96574.1): 水稻; SfN8DT1 (BAG12671.1): 苦参; TaH-
GGT (AAP43912.1): 小麦; TaHPT (ABB70123.1): 小麦; VvHGGT
(AAV74623.1): 葡萄; ZmHPT (ABB70122.1): 玉米。
图4 EaPT1和EaPT2组织特异性表达分析
Fig.4 Tissue-specific expression analysis of EaPT1 and EaPT2
箭头所指为EaPT2特异条带(680 bp); L: 叶片; S: 幼茎; M: 分
子量标准。
植物生理学报580
大肠杆菌表达出可溶蛋白并表现出相应的催化活
性。我们首先选择了大肠杆菌表达体系和表达载
体pET32a(+), 但无论怎样变换诱导条件, 始终没有
在SDS-PAGE电泳胶中检测到可溶的或包涵体形
式的目标蛋白条带。后更换表达载体pCold TF
DNA和pGEX-4T-1, 仍不见目标蛋白表达。由于
EaPT1含有9个跨膜区, 属于典型的跨膜蛋白, 故有
可能难以在大肠杆菌表达体系实现异源表达。苦
参SfN8DT1和大豆GmG4DT的异物烯转移酶催化
活性 , 都是通过酵母表达体系才得以鉴定的
(Akashi等2009; Sasaki等2008)。目前, 我们已将
EaPT1构建到酵母表达载体, 正在进行转化酵母的
表达以及底物饲喂实验。
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