全 文 ：·药理实验与临床观察·
淫羊藿苷的肠菌代谢研究Ⅰ . 肠内细菌对淫羊藿苷的代谢转化△
长春中医学院附属医院新药研究中心 ( 130021)　　刘铁汉 　王　毅　王本祥* *
沈阳药科大学天然药物研究室　　　　　　　　　吴立军
摘　要　目的: 在考察淫羊藿苷 ( icariin)于人工胃液中稳定性的基础上 ,研究了肠道内细菌对淫羊藿苷的代谢作
用。方法: 于人工胃液或肠内菌培养液中 ,加入淫羊藿苷温孵培养一定时间后 ,以薄板层析 、高效液相色谱仪和电喷
雾质谱仪 ,对培养物成分做定性分析检查。结果: 淫羊藿苷在人工胃液中有较高的稳定性。离体培养人肠道内细菌
可代谢淫羊藿苷 ,且其主要代谢产物为淫羊藿苷的苷元 ( icaritin)及其苷元的异戊烯基位置异构体。 在大鼠整体实
验中 ,从粪便和尿液中均检出一主要代谢产物 ,并初步确定此代谢产物为宝藿苷Ⅰ ( bao liuo sideⅠ )。 结论:在离体
条件下 ,淫羊藿苷可被人肠内菌代谢 ,主要代谢产物为淫羊藿苷的苷元。 大鼠灌服淫羊藿苷后 ,吸收入血的主要代
谢物为宝藿苷Ⅰ 。
关键词　淫羊藿苷　宝藿苷Ⅰ 　肠内菌代谢　电喷雾质谱
Studies on the Metabolism of Icariin by Intestinal Bacteria
PartⅠ : The Transformation of Icariin by Intestinal Flora
　　 Research Cente r o f New Drug o f Affiliated Hospital, Changch un Co llege of TCM ( Changchun 130021)　 Liu Tiehan,
Wang Yi and Wang Benxiang
Shenyang Pharmaceutica l Univ ersity　Wu Lijun
Abstract　　 The stabi li ty of icariin in a rtificia l gast ric juice and the transforma tion of ica riin in
intestine w ere studied. Ica riin w as incubated w ith arti ficial gast ric juice o r intestinal flo ra for a certain
period of time, and i ts metaboli te ex amined by TLC, HPLC and ESI /M S. Resul ts show ed that icariin w as
stable in arti ficial g ast ric juice, but w as metabolized to icari tin by human intestinal bacteria in v itro. A
main metabolite, baohuosideⅠ . was found in urine and feces of ra t af ter ig administ ra tion o f 200 mg /kg
icariin. These results show ed that icariin can be metabo lized in v itro by human intestinal bacteria to ica ri tin
and as baohuoside af ter o ral administ ra tion.
Key words　　 icariin　 baohuosideⅠ 　 intestinal bacteria metabo lism　 ESI /M S
　　淫羊藿苷 ( ica riin)是小檗科淫羊藿属植物的主
要有效成分之一。注射途径给药或离体实验表明 ,淫
羊藿苷在心血管 [ 1, 2] ,免疫调节 [3～ 7 ]等方面有着广泛
的生物活性。然而 ,传统中药淫羊藿和现今绝大多数
以淫羊藿苷为指标成分的药物制剂均为口服制剂。
因此 ,考察淫羊藿苷在消化道内的稳定性是揭示此
类制剂作用机制研究中一个不可缺少的重要环节。
我们采用离体实验与大鼠整体实验相结合的方法 ,
重点考察了肠内细菌对淫羊藿苷的分解代谢作用 ,
初步了解了淫羊藿苷在胃肠道内分解代谢的一般规
律。
1　实验材料
1. 1　动物: Wista r雄性大鼠 ( 180～ 200 g ) ,购自白
求恩医科大学实验动物室。
1. 2　药品:淫羊藿苷为自制 ,经理化测定 ,证明纯度
大于 99% ;胃蛋白酶购自 Sigma公司。
1. 3　仪器: Va rium Uni ty -400型核磁共振波谱仪 ;
Finigan mat公司 LCQ电喷雾质谱仪 ; Shimadzu-
8A型分析制备两用高效液相色谱仪 ( UV检测器 ) ;
厌氧培养罐购自沈阳第五人民医院 ;自制代谢用鼠
笼。
1. 4　试剂及其它材料:人工胃液按 1995年版药典
方法配制 ;厌氧培养液 [8 ]: 37. 5 mL溶液 A( 0. 87%
K2HPO4 ) , 37. 5 mL 溶液 B ( 0. 47% KH2 PO4 ,
1. 18% NaCl , 1. 2% ( N H4 ) 2 SO4 , 0. 12% CaCl2 ,
0. 25% M gSO4· H2O) , 0. 5 g L-cystine· H2O, 2
·834· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2000年第 31卷第 11期
Address: Liu Tiehan, Research Cen ter of New Drug , Af fi liated Hospital, Ch angchun Col leg e of TCM, Ch angch un刘铁汉　沈阳药科大学中药系 95级硕士研究生 ,现为中国科学院微生物研究所 98级博士研究生。
* * 通讯联系人△国家中医药管理局资助课题
m L 25% L-asco rbic acid, 50 mL 8% Na2 CO3 ,牛肉
膏 1 g ,蛋白胨 1 g ,营养琼脂 1 g ,最后调 pH7. 5～
8. 0。粪便采于健康志愿者。
2　实验方法
2. 1　淫羊藿苷在人工胃液中的稳定性考察:精密称
取淫羊藿苷 1. 0 mg ,加微量甲醇 ,加热溶解 ,然后与
16 mL温度为 37℃人工胃液混合。用移液管分装于
0, 1, 2, 3号 4支试管中 (预先置于 37℃恒温水浴
中 )。然后分别用 0. 2 mol /L NaOH在 0, 1, 2, 3 h后
调 pH值至 7. 0终止反应。 0. 45μm的醋酸纤维膜
过滤至 5 mL容量瓶中 ,定容摇匀后 ,用 HPLC分析
(经考察 ,淫羊藿苷含量与峰面积在 0. 004～ 0. 2
mg /m L浓度范围内有较好的线性关系 , r =
0. 999 888) ,每组进样 8μL, 以 0 h组检测到的淫
羊藿苷量为 100% ,依据各峰面积与 0 h组的峰面积
之比求出经一段时间后未发生变化的淫羊藿苷占原
加入药物的百分含量。
2. 2　用 TLC法检测离体培养人肠内细菌对淫羊藿
苷的代谢作用: 取青年健康志愿者的新鲜粪便 ,按
0. 5 g∶ 15 mL的比例加入厌氧培养液中 ,用玻璃珠
和玻璃棒打匀 ,用纱布过滤即得肠菌培养液。取此新
鲜配制的肠菌培养液 9份 ,每份 10 m L,各加淫羊藿
苷 2 mg ,分别于 37℃ ,厌氧条件下培养 0, 2, 4, 8,
16, 24, 48, 72 h ,用正丁醇萃取培养混合物 ,萃取液
浓缩后用于 TLC分析。
2. 3　淫羊藿苷体外代谢产物的制备分离和纯化:淫
羊藿苷 ( 1 000 mg )与新配制的肠菌培养液 1 000
m L混合 ,于 37℃厌氧条件下培养 24 h后 ,用正丁
醇等量萃取 4次 , 60℃减压回收 ,所得残渣用乙酸
乙酯提取。此提取液浓缩后 ,过滤 ,用于硅胶柱层析 ,
以氯仿为洗脱剂 ,得一黄色结晶 ( 10. 6 mg ) .
2. 4　淫羊藿苷大鼠整体肠内菌代谢的考察
2. 4. 1　分析样本的制备:取大鼠 3只 ,饲养 7 d,待
其充分适应本室环境后 ,收取空白尿液及空白粪便
备用。禁食 12 h后 ,连续 ig给药 2 d,每天 2次 ( 200
mg /kg ) ,禁食但自由饮用糖盐水 (含 5%葡萄糖和
0. 9%氯化钠 )。不断收集给药后尿液和粪便 ,连续 3
d。尿液用乙酸乙酯萃取 ,粪便用乙酸乙酯提取 ,回
收乙酸乙酯 ,过滤 ,即得澄明分析样本。
2. 4. 2　 HPLC法对样本进行分析: 采用 Shimadzu-
8A分析制备两用 HPLC, Spheriso rb -C18分析柱 ,以
CH3OH-H2O= 7∶ 3为流动相 , UV353 nm,流速为
1 mL /min对样本进行分析。
2. 4. 3　电喷雾质谱 ( ESI-M S)法对主要代谢产物的
分析: 采用 Shimadzu-8A高效液相 , Spheriso rb-C18
半制备柱 ,以 CH3OH-H2O= 7∶ 3为流动相。从给药
鼠尿液中富集粪便和尿液中均存在的主要代谢物 ,
用于 ESI-M S分析。
3　结果
3. 1　淫羊藿苷在人工胃液中具有相对稳定性:淫羊
藿苷分子中 , 3位与 7位羟基上分别有鼠李糖基和
葡萄基与黄酮母核相连 ,有被胃酸迅速分解的可能。
然而 ,考察结果表明 ,淫羊藿苷在 37℃ 人工胃液中
作用 2 h后 ,仍有 92. 7%以原苷形式存在 ,仅有少部
分分解。所以 ,大部分的淫羊藿苷能在正常的胃排空
时间内通过胃进入小肠 ,避免胃酸的破坏。见表 1。
表 1　淫羊霍苷在人工胃液中的稳定性 ( 37℃ )
培养时间 (h ) 0 1 2 3
剩余率 (% ) 100 95. 4 92. 7 87. 8
　　注:人工胃液: 10 g胃蛋白酶溶于 100 m L稀盐酸中 ( pH 1. 2) ;
HPLC条件: Sph eris orb C18柱 ;流动相 CH3O H-H2O-AcO H= 60∶
40∶ 0. 5;流速 1. 0 mL /min;紫外检测器 ;波长 271 nm。
3. 2　离体培养人肠道内细菌对淫羊藿苷的代谢作
用: 薄层检查结果表明淫羊藿苷很快被离体培养人
肠道内细菌所代谢 (约始于 8 h) , 12 h后 ,原形药物
不能用薄层方法检出 ,而代之以一极性小于淫羊藿
苷的代谢物斑点。见图 1。
图 1　人肠道菌群对淫羊藿苷代谢薄层层析示意图
层析条件: 硅胶板 ,硅胶厚度为 0. 25 mm ,溶剂
系统为石油醚 ( 30℃～ 60℃ )-丙酮-甲酸 = 3. 5∶
1. 5∶ 0. 1;层析后用 2%三氯化铝乙醇溶液显色并
在 254 nm紫外下观察。
3. 3　淫羊藿苷离体肠菌代谢产物的鉴定:所得代谢
产物: 黄色针状结晶 (甲醇 ) ; M olish反应阴性 ,盐
酸-镁粉反应阳性 ,推测此代谢产物可能为不含糖基
的黄酮类化合物 , ESI-M S正谱给出 m /z 369 [M+
H ]
+
,且其裂解特征与淫羊藿苷的碎片峰 m /z 369
次级断裂特征基本一致。 预示此化合物为淫羊藿苷
·835·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2000年第 31卷第 11期
元或苷元的同分异构体。 1 HNMR谱中 ,当谱图未被
放大时 ,各峰信号归属与淫羊藿苷元基本一致 [9 ]。然
而 ,当谱图被放大后发现 ,相应于 5位羟基氢 , 3位
羟基氢 , 7位羟基氢 , A环 6位氢 , B环 2′, 6′位氢 ,异
戊烯基烯氢质子信号均不是单一信号 ,结合质谱情
况 ,推断此代谢产物为 3, 5, 7-三羟基 -4′-甲氧基 -8-
异戊烯基黄酮 (Ⅰ )与 3, 5, 7-三羟基 -4′-甲氧基 -6-异
戊烯基黄酮 (Ⅱ )的混合物。 又因为 1HNMR谱中
δ6. 415峰明显强于 δ6. 423峰 ,因此 ,在代谢物中以
化合物 (Ⅰ )为主。 各峰信号具体归属见表 2。
表 2　淫羊藿苷体外肠菌代谢产物的 1HNMR图谱数据
位置　　 Ⅰ 　　　 Ⅱ　　　
6 6. 415( 1 H, s ) 6. 423( 1H, s )
2′, 6′ 8. 242( 2H, d, j= 9, 2) 8. 239( 2H, d , j= 9, 2)
3′, 5′ 7. 246( 2H, d, j= 9, 2) 7. 246( 2H, d , j= 9, 2)
4′-OCH3 3. 965( 1H, s) 3. 965( 1H, s )
1″ 3. 523, 3. 558( each 1H) 3. 523, 3. 558 ( each 1H)
2″ 5. 296( 1H, m) 5. 293( 1H, m)
4″ 1. 868( 3H, s) 1. 868( 3H, s )
5″ 1. 747( 3H, s) 1. 747( 3H, s )
3-O H 9. 589( 1H, s) 9. 589( 1H, s )
5-O H 12. 485( 1H, s) 12. 470( 1H, s )
7-O H 10. 852( 1H, s) 10. 857( 1H, s )
　　化学位移单位 ppm ,偶合常数单位为 Hz,工作频率 400 M Hz,溶
剂为 DM SO-d6 , TM S为内标
3. 4　一主要淫羊藿苷大鼠整体肠菌代谢产物的推
定:从高效液相色谱图 (图 2)中可见 ,不论在给药大
鼠的粪便中 ,还是在给药大鼠的尿液中 ,至少可检出
保留时间分别为 10. 3 min (Ⅰ )和 21 min (Ⅱ )的代
谢物峰出现。 并且 ,保留时间为 21 min的代谢物峰
(Ⅱ )由二个保留时间相差很小的峰重叠在一起组
成。用 Shimadzu HPLC, Spherisorb半制备柱 ,不断
富集代谢峰 Ⅰ 和Ⅱ所对映的代谢物 ,用于 ESI-M S
分析 ,代谢峰 Ⅱ 所对映的代谢物在 ESI-M S正谱全
谱中显较强峰 m /z 536[M+ Na ]+和 m /z 514 [M+
H ]
+ 。采用分步解离技术对此二离子进行分析。 m /z
536峰脱掉 146碎片 (鼠李糖基碎片 )后 ,得稳定子
峰 m /z 390。 m /z 514峰 脱掉 146碎片 (鼠李糖基碎
片 )后得 m /z 369子离子 ,且此子离子的进一步裂解
碎片与淫羊藿苷子离子 m /z 369的质谱图一致。结
合高效液相色谱情况 ,初步证明代谢峰Ⅱ中有宝藿
苷Ⅰ ( 3, 5, 7-三羟基 -4′-甲氧基 -8-异戊烯基黄酮 -3-
O-鼠李糖苷 )的存在。 代谢峰 (Ⅰ )所对映的代谢物
有待进一步研究。
A-淫羊藿苷标准品 ;　 B-宝藿苷Ⅰ 标准品 ;　 C-给药组粪便 ;　
D-给药组尿样 ;　 E-粪便对照 ;　 F-尿样对照
a-未知代谢产物 ;　 b-宝藿苷Ⅰ
图 2　大鼠粪便与尿中代谢产物的 HPLC图谱
4　讨论
糖类化合物是肠道内细菌重要的碳源。因此 ,肠
道内细菌的苷键水解酶系对具有苷键的药物进行水
解是肠道内细菌代谢药物的一大特征 [ 10]。在本实验
中 ,我们不但检测到了肠道内细菌对淫羊藿苷分子
中糖基的水解作用 ,而且也检测到了淫羊藿苷元位
置异构体的生成。由此我们推测肠内细菌代谢淫羊
藿苷的可能途径如图 3。
　　综上所述 ,淫羊藿苷易被肠道内菌丛所代谢。
图 3　肠内细菌代谢淫羊藿苷的推想图
因此 ,有必要进一步对口服淫羊藿苷后原苷及其肠
菌代谢产物在血液中能否出现 ,及原苷与肠菌代谢
产物在生物活性方面有何异同进行考察 ,以期阐明
传统中药制剂中淫羊藿苷发挥药效的机制 ,并促进
·836· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2000年第 31卷第 11期
新的药物制剂的开发。
参 考 文 献
1　王天然 ,邢善田 ,周金黄 .中国免疫学杂志 , 1986, 2: 74
2　王天然 ,邢善田 ,周金黄 .药学通报 , 1987, 22: 533
3　刘崇铭 ,于庆海 ,张利民 .沈阳药学院学报 , 1981, 14: 28
4　刘崇铭 ,于庆海 ,张利民 .中草药 , 1982, 13 ( 9): 31
5　李青南 ,吴　铁 ,谢　华 ,等 .中草药 , 1993, 24: 637
6　曹颍瑛 ,郑钦岳 ,张国庆 ,等 . 第二军医大学学报 , 1998, 19: 199
7　赵　勇 ,张　玲 ,崔正言 . 中国药理学通报 , 1996, 12: 52
8　 Massao Hat tori, Sh u Y Z, Mined Shimizu , et al . Ch em Ph arm
Bul l, 1985, 33: 3838
9　李　枫 ,刘永隆 . 药学学报 , 1988, 23: 739
10　康　白主编 .微生态学 . 大连:大连出版社 , 1988: 95
( 1999-12-14收稿 )
水杉总黄酮对肾性高血压大鼠左室肥厚的作用△
武汉大学医学系药理学教研室 ( 430071)
刘惟莞 　曾加雄　石明健　杨晓茹　糜留西* *　郑庆安* * 　卢云英　王红英
摘　要　目的: 研究水杉总黄酮对肾性高血压大鼠左室肥厚的预防作用。方法: 二肾一夹法建立大鼠肾性高血压心
肌肥厚模型 ,术后第 4周 ,不同剂量的水杉总黄酮 ig给药 ,持续 5周。 结果: 水杉总黄酮 ( 400, 40 mg /kg . d )能显著
降低 HW /BW、 LVW /BW、心肌纤维直径、左心室肌 Ca2+ 含量 ,对大鼠收缩压无显著性影响。结论:水杉总黄酮对肾
性高血压大鼠左室肥厚有预防作用 ,机制可能与钙拮抗作用有关。
关键词　木杉总黄酮　高血压　左室肥厚
Effects of Total Flavone of Metasequoia glyptostroboides on Left Ventricular
Hypertrophy in Renovascular Hypertens ive Rats
　　 Depa rtment of Medicine , Wuhan Univ er sity ( Wuhan 430071)　 Liu Weiwan, Zeng Jiax iong , Shi Ming jian, Yang
Xiaoru, Lu Yunying and Wang Hongying
　　Wuhan Institute o f Bo tany , Chinese Academy o f Sciences　 Mi Liux i and Zheng Qing an
Abstract　　 The effects of to tal f lav one of Metasequoia glyptostroboides Hu et Cheng ( TFM ) on lef t
v ent ricular hypert rophy in rat w ere investiga ted. Left v ent ricular hypert rophy of ra t w as induced by
renovascular hypertension, and then treated by ig T FM fo r fiv e w eeks. Resul ts show ed tha t TFM ( 400, 40
mg /kg /d) markedly reduced HW /BW, LVW /BW , lef t v ent ricular Ca
2+
content and myofibril diameter,
but w ithout effect on sy stolic blood pressure ( SBP) . In conclusion, TFM can prevent lef t v ent ricula r
hypert rophy in renovascular hyper tensiv e ra ts. The mechanism o f action may be rela ted to i t s calcium
antagonistic properties.
Key words　　 total flavone of Metasepuoia glyptostroboides Hu et Cheng　 hypertension　 lef t
v ent ricular hypert rophy
　　左室肥厚 ( LV H)是心血管系统疾病的一项独
立危险因素 [1 ]。心脏机械负荷过重和许多非血流动
力学因素的刺激均可诱发 LV H。现已发现α-甲基多
巴、血管紧张素转化酶抑制剂、钙离子拮抗剂等均有
不同程度的防止左室肥厚作用。 水杉总黄酮 ( to tal
f lav ones of Metasequosia, glyptostroboides TFM )是
从古老的杉属植物水杉中提取的活性成分 ,对其初
步药理学研究表明 , TFM具有抗心肌缺血和抗心律
失常作用。我们通过建立肾性高血压大鼠左室肥厚
模型 ,研究 TFM对其作用。
1　材料与方法
1. 1　动物: Sprague-Daw ley雄性大鼠 ,体重 150～
200 g ,湖北医科大学实验动物中心提供。
1. 2　仪器与试剂: HX-Ⅱ型小动物血压测量器 (尾
套检压计 ) ,湖南医科大学监制 ;日立 180-80型原子
吸收分光光度计 ,日本产 ;测微尺 ,上海第三光学仪
·837·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2000年第 31卷第 11期
Address: Liu Weiw an, M edical Department of Wuhan University, Wuhan刘惟莞　女 ,现任武汉大学医学系药理学教研室教授 ,主要从事心血管药理的研究。 目前承担国家自然科学基金《古老树种心脑血管疾病活性成分研究》、《重要资源植物杉科植物特征成分和活性研究》及中科院资源与环境“九五”重大项目《治疗数种重要疾病新天然药物研究与开发》和省、市科委等课题 5项。
* * 中科院武汉植物研究所△国家自然科学基金资助项目 ,项目号 39770088