全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月 765
收稿 2009-03-09 修定 　2009-05-22
资助 国家 “ 十一五 ” 科技支撑计划( 2 0 0 8 B A D B 3 B 0 1 ,
2 0 0 6 B AD 0 1 A1 6 )和中国农业科学院基本科研业务费
(Ywf-td-3)。
* 通讯作者(E-mail : gaohongwen@2 63.net; Tel: 0 10-
6 2 8 9 4 5 6 0 )。
柠条锦鸡儿肌动蛋白基因的克隆和表达稳定性分析
王学敏, 王美珍, 王赞, 高洪文 *
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
提要: 以几种豆科植物中肌动蛋白的氨基酸保守序列设计简并引物, 采用 RT-PCR结合 RACE扩增技术, 从柠条锦鸡儿叶
片中克隆到一个编码肌动蛋白的基因, 命名为CkACT。该基因 cDNA全长为 1 655 bp, 开放阅读框 1 134 bp, 编码 377个氨
基酸。氨基酸比对分析表明, 该基因编码的氨基酸与其他植物肌动蛋白基因具有较高的同源性。不同组织中的表达基本上
一致, 不同发育时期的基因表达相似, 低温、NaCl、干旱和ABA处理后的表达强度没有明显差异, 说明 CkACT基因表达
稳定。
关键词: 肌动蛋白; 柠条锦鸡儿; 克隆; 表达稳定性
Clone and Expression Stability Analysis of Actin Gene in Caragana korshinskii
WANG Xue-Min, WANG Mei-Zhen, WANG Zan, GAO Hong-Wen*
Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100193, China
Abstract: An actin gene, CkACT, was cloned from the leaves of Caragana korshinskii by using RT-PCR and
RACE with degenerate primers which were synthesized based on the high homologous region among the se-
quences of several leguminous ACT genes. The full-length cDNA of CkACT was 1 655 bp and contained a
1 134-bp open reading frame encoding a 377-amino acid protein. The deduced amino acid sequence of CkACT
protein shared high identity with other ACTINs via multiple alignment. CkACT expressed constitutively in all
tested organs, including root, shoot and leaf. There was no significant difference in mRNA expression in differ-
ent development stage or under cold, NaCl, drought and ABA treatment. These results indicated that the expres-
sion of CkACT is stable.
Key words: actin; Caragana korshinskii; cloning; expression stability
古老的肌动蛋白(actin, ACT)普遍存在于维管
植物细胞中, 在真核细胞进化过程中高度保守, 各
种生物肌动蛋白的氨基酸序列同源性高达
70%~100%。在高等植物体内肌动蛋白主要参与
细胞质流动、细胞器运动、顶端生长、植物细
胞形状控制、植物细胞的有丝分裂、植物对重力
的感应性和叶绿体运动等(Staiger和Chilwa 1987; 陈
颖等2003; Parthasarathy等1985)。自1973年Elzinga
等首次测定兔肌肉肌动蛋白的氨基酸序列至今, 国
际数据库中已经存有百余种生物的200多个肌动蛋
白核苷酸序列和氨基酸序列(Ghosh等 1987: Baird
和Mengher 1987; Mccurdy和Willamson 1987; Nairn
等 1988; Villanueva等 1990; 伍国强等 2008)。常规
的植物肌动蛋白通常由 376~377个氨基酸残基组
成, 具有高度的保守性和表达稳定性。其编码基因
是目前植物基因表达分析中常用的内参之一。
已发现在一些高等植物中, 肌动蛋白是由一个
多基因家族编码的, 产生多种肌动蛋白的异型体
(Drouin和Dover 1987; Kandasamy等 2002; Reece
等 1990; Shah等 1982)。异型体在一级结构上的
同源性很高, 但时空表达调控方式不同, 表达具有
组织特异性 ,因而认为它可能执行不同的功能
(Kandasamy等 2001; Jiang和 Zhao 2002)。拟南芥
ACT1和ACT3特异的在花粉中表达, 而在叶片和根
中不受诱导, ACT2和ACT8在所有的营养型器官中
都有表达, 而ACT4和ACT12主要在花粉管伸长过
程中表达(An等 1996)。豌豆肌动蛋白分为 3类异
型体, 这些异型体在植物的各器官或组织中均有表
达, 但在发育时间以及表达强度上具有明显差异
(Cao等1994; 胡松年和阎隆飞1999; 凌毅和赵武铃
2001; Jiang和 Zhao 2002)。
柠条锦鸡儿为豆科锦鸡儿属植物, 主要分布在
植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月766
内蒙古、陕西、甘肃和宁夏等地(陈墨君和贾慎
修 2000)。它属于落叶大灌木, 根系极为发达, 具
有较强的适应性和抗逆性, 营养价值高, 适口性好,
是我国西北、华北和东北西部水土保持和固沙造
林的树种之一(时永杰和常根柱 2003)。也是分布
区家畜的主要饲料来源之一。是西部生态环境建
设、防沙治沙、发展畜牧业的优选灌木植物之一
(王赞等 2005)。有关柠条锦鸡儿分子生物学的研
究甚少。克隆肌动蛋白基因, 分析确定该基因的表
达稳定性, 对于以此基因为内参, 开展柠条锦鸡儿
内源基因表达以及调控特性的研究具有一定的意
义。
材料与方法
植物材料为柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii
Kom.), 种子采自内蒙古赤峰。
E. coli DH5α感受态细胞购自天根生化公司。
高保真DNA聚合酶 Ex Taq、T4 DNA连接酶和
pMD18-T载体为 TaKaRa公司产品。实验中所有
的引物合成及测序工作由上海英骏公司完成。
培养皿培养时, 将柠条锦鸡儿种子用氯气法表
面灭菌, 逐粒摆在MS固体培养基上, 于人工智能
培养箱中 25 ℃和 16 h光照、8 h黑暗条件下培
养。
盆栽培养时, 表面灭菌的种子放在吸水滤纸上
萌发直至子叶刚刚突破种皮, 再将露白种子播入蛭
石:珍珠岩(3:1)混匀的培养基质中, 温室培养, 常规
灌溉。
提取总 RNA时, 将植物材料在液氮中充分研
磨, 用 Trizol试剂(Invitrogen, California, 美国)提取
R NA。
引物设计时, 在GenBank中寻找到与目标基因
亲缘关系较近的肌动蛋白基因编码的氨基酸序列,
登录 Block Maker (http://blocks.fhcrc.org/blocks/
make_blocks.html)进行比对, 再用 Block的结果在
CodeHop (http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.
html)数据库中搜索相关引物, 最后用生物软件Oligo
6.0进行引物筛选分析。P1: 5 CTACTGGTATTG-
TTCTGGATTCTGGNGAYGG 3; P2: 5 CACTGTA-
CTTTCTTTCAGGAGGAGCNACNAC 3。
RACE所用GSP引物根据SMART RACE试剂
盒的要求, 用Oligo 6.0软件设计。5 GSP: 5 CAC-
ATCTGTTGGAAGGTGCTGAGGG 3; 3 GSP: 5
TGACAGGATGAGCAAGGAGATTAC 3。
RT-PCR扩增时, cDNA第一链的合成按照逆
转录试剂盒(Promega, Wisconsin, 美国)操作说明进
行。PCR扩增反应体系: 10×PCR 缓冲液 5 μL, 2.5
mmol·L-1 dNTP 4 μL, 10 μmol·L-1 P1 1 μL, 10 μmol·L-1
P2 1 μL, Ex Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1) 0.5 μL, cDNA
2 μL, 加水至 50 μL。反应条件: 94 ℃预变性 5
min; 94 ℃变性 30 s, 56 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 90
s, 30个循环; 72 ℃延伸 10 min。扩增产物用 1%
琼脂糖凝胶检测。
目的片段的回收和纯化按照凝胶回收试剂盒
(Axygen, California, 美国)操作说明进行。将回收
纯化的目的片段连入pMD18-T (TaKaRa, 中国大连)
载体中, 热击转化大肠杆菌DH5α感受态, 涂布加
有AMP、IPTG和X-gal的 LB平板, 于 37 ℃下培
养 12 h后挑取白色克隆, 进行 PCR检测, 检测为阳
性的克隆送交基因公司测序。
根据测序获得的正确序列信息分别设计 3
GSP和 5 GSP引物, 利用 SMART RACE cDNA
Amplification试剂盒(Clontech, 日本), 根据操作说
明进行 3 RACE和 5 RACE, PCR扩增产物回收纯
化后连接入 pMD18-T载体并进行测序, 获得 3末
端和 5 末端序列。
分析组织特异性时, 取处在花期的柠条锦鸡儿
的根、茎、叶、花, 与已有的柠条锦鸡儿种子分
别提取总 RNA, 并进行电泳(使 RNA的浓度一致),
以等量的 RNA逆转录为 cDNA, 从中取等量进行
RT-PCR, 电泳结束后, 取等量的 PCR产物进行 1%
琼脂糖凝胶电泳, 以条带的灰度判定基因表达的强
弱。
进行表达稳定性分析时, 在柠条锦鸡儿不同生
育期的芽期(萌发后 8 d)、幼苗期(4周龄)和成熟
期分别取样, 提取 RNA, 逆转录为 cDNA, 用 RNA
作参照进行 RT-PCR。电泳结束后, 取等量的 PCR
产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳, 以条带的灰度判定
基因表达的强弱。
低温处理时, 将盆栽培养4周的柠条锦鸡儿幼
苗放在 4 ℃培养箱中冷处理 8 h, 全株取样提取
RNA; 盐胁迫、干旱胁迫和外源ABA处理时, 将
4周龄的柠条锦鸡儿幼苗小心从土中取出, 过程中
不损伤植物组织。将根系分别浸在 200 mmol·L-1
植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月 767
NaCl、20%PEG和 100 μmol·L-1 ABA液体培养基
中处理 8 h, 全株取样, 提取 RNA。用 RNA作参
照进行 RT-PCR。电泳结束后, 取等量的 PCR产
物进行 1%琼脂糖凝胶电泳, 以条带的灰度判定基
因表达的强弱。
目的基因的同源氨基酸序列搜索在 N C B I
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上进行, 多序列
联配用 DNAMAN软件运行, 测序结果拼接借助
DNASTAR软件, 系统进化树分析用MEGA 4.0软
件进行(薛庆中等 2009)。
实验结果
1 肌动蛋白基因的克隆和序列分析
采用基于反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的
技术获得柠条锦鸡儿肌动蛋白基因。以柠条锦鸡
儿叶中总RNA反转录所得到的第一链 cDNA为模
板, 用在肌动蛋白基因家族保守区内设计的简并引
物 P1和 P2, 扩增到一个长度为 573 bp的片段。该
片段的DNA序列与其他植物中的ACTs基因高度
同源。基因的全长序列以 3和 5 RACE-PCR技术
获得。该序列全长为 1 655 bp, 包含一个 1 134 bp
的开放阅读框(ORF), 3非编码区 312 bp, 5非编码
区 209 bp, 共编码 377个氨基酸, 蛋白分子量为 41.7
kDa。用CLUSTALW软件与豌豆等其他10种植物
中同源基因的氨基酸序列进行同源保守域分析发
现, 该序列与ACTIN家族其他成员的同源性很高
(图 1), 其中同源性最高的是绿豆, 达到 98%, 最低
的为大豆, 也达到了91.3%。该基因命名为CkACT,
已在GenBank上注册, 编号为 FJ485727。
2 CkACT基因表达的组织特异性
用 Tr izol 法分别提取根、茎、叶、花和种
子中的 RNA, 逆转录为 cDNA后进行半定量 RT-
PCR检测的结果显示, CkACT基因在植株的各器官
中都有表达, 各器官的表达量基本上一致(图 2)。
3 柠条锦鸡儿不同发育时期CkACT基因的表达
于柠条锦鸡儿的几个发育阶段(芽期、幼苗
期、成熟期)分别取样, 并用半定量 RT-PCR分析
其表达差异的结果表明, CkACT基因在不同发育时
期均表达, 表达强度基本上一致(差异不显著) (图
3 )。
4 CkACT基因对外界环境变化的响应
4周龄的柠条锦鸡儿用冷、盐、干旱和植物
激素ABA处理, 全株提取 RNA。RT-PCR结果表
明, CkACT不受外界逆境胁迫的影响, 在各种处理
条件下表达量一致(图 4)。
5 肌动蛋白家族基因的系统进化树分析
用MEGA软件对柠条锦鸡儿和其他植物的氨
基酸序列进行聚类分析的结果表明, 柠条锦鸡儿肌
动蛋白基因(CkACT)与豆科植物绿豆、豌豆、鹰
嘴豆、茄科植物烟草以及大多数拟南芥肌动蛋白
基因归为一个亚类, 而水稻、谷子和玉米等禾本科
植物与菊科及锦葵科植物等归为另一亚类(图 5)。
讨　　论
肌动蛋白广泛存在于高等植物的各种组织细
胞中, 是细胞骨架的主要成份之一、因其具有高度
的保守性和表达稳定性, 常常用作植物基因表达分
析中的内参之一。但近几年的研究表明并非所有
的植物肌动蛋白基因均稳定表达(Thellin等 1999),
一些植物的肌动蛋白基因存在异构体, 其表达有明
显的组织特异性(Diaz-Camino等 2004)。理想的内
参基因应该满足以下条件: (1)高度或中度表达, 但
不是太高或低表达; (2)稳定表达于不同类型的细胞
和组织中, 而且其表达量是近似的, 无显著差别; (3)
不受任何内源性或外源性因素的影响(如不受任何
实验处理措施的影响) (朱芷葳和董长生 2006)。本
文中用半定量 RT-PCR技术分析不同器官、不同
发育时期以及多种胁迫条件下柠条锦鸡儿肌动蛋白
基因(CkACT)表达特点的结果表明, CkACT表达并
不存在明显的组织特异性, 在不同发育时期和多种
外界条件影响下CkACT基因均能稳定表达, 并且表
达强度适中。同源性比较分析表明, 该基因与其他
肌动蛋白基因编码的氨基酸序列高度同源。说明
本文克隆的肌动蛋白基因具有高度的保守性和表达
稳定性, 可以用于柠条锦鸡儿基因表达分析。
肌动蛋白基因在进化上是一个保守的基因家
族, Hightower和Meagher (1986)认为, 植物与动物
在肌动蛋白基因上的分化率大概是每 5 600~9 400
万年发生1%。说明肌动蛋白基因的核酸代换率是
很低的, 这暗示肌动蛋白基因携带很强的选择压
力。本文结果也表明, CkACT基因与其他同源基
因的核苷酸序列的同源性非常高(资料未列出)。
而且, 以柠条锦鸡儿为代表的豆科植物肌动蛋白的
氨基酸在进化上与十字花科植物的距离比与禾本科
植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月768
图 1 CkACT氨基酸序列与其他同源序列的多序列联配
Fig.1 The multiple alignment of CkACT and other homologous amino acid sequences
Ck:柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii); Vr: 绿豆(Vigna radiate); Ps: 豌豆(Pisum sativum); Gm: 大豆(Glycine max); Os: 水稻(Oryza
sativa); Zm: 玉米(Zea mays); Gh: 棉(Gossypium hirsutum); Nt: 烟草(Nicotiana tabacum); Pr: 红云杉 (Picea rubens); Bp: 白桦(Betula
platyphylla); Rc: 蓖麻(Ricinus communis)。
植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月 769
植物的近一些, 这说明, 豆科植物的肌动蛋白基因
与禾本科植物的分离在进化上可能要早于十字花
科。
恶劣生存环境的长期自然选择使柠条锦鸡儿
具有较强的抗逆性, 预示着丰富抗逆基因资源的存
在。一般来说, 要深入研究这些基因的表达模式和
图 2 柠条锦鸡儿不同器官中肌动蛋白基因的表达
Fig.2 The expression level of CkACT in different organs
图 3 不同发育时期柠条锦鸡儿肌动蛋白基因的表达
Fig.3 The expression level of CkACT in different
developmental stage
图 4 不同胁迫条件下柠条锦鸡儿肌动蛋白基因的表达
Fig.4 The expression level of CkACT under different
treatment
图 5 柠条锦鸡儿肌动蛋白基因与其他 21种植物中ACT基因的系统进化分析
Fig.5 Neighbor-joining phylogenetic tree of the complete sequence of C. korshinskii actin (CkACT) with other 21 plant ACTs
拟南芥(Arabidopsis, AtACT3, NM_115235; AtACT4, AY088111; AtACT7, NM_121018; AtACT11, NM_112046; AtACT12
NM_114519); 绿豆(VrACT, AF143208); 水稻(OsACT, NM_001057621); 独角金(Striga asiatica , SaACT, U68461); 蓖麻(RcACT,
EQ974226); 红云杉 (PrACT, AF172094); 烟草(NtACT, EU938079); 豌豆(PsACT, U76190); 玉米(ZmACT1, NM_01156990;
ZmACT2, NM_001153459); 鹰嘴豆(Cicer arietinum, CaACT, EU529707); 谷子(Setaria italica, SiACT, AF288226); 棉(GhACT,
AY305732); 桂竹(Phyllostachys bambusoides, PbACT, EU009452); 向日葵(Helianthus annuus, HaACT, AF282624); 油棕(Elaeis
guineensis, EgACT, AY550991); 圆叶锦葵(Malva pusilla, MpACT, AF112538); 油菜(Brassica napus, BnACT, AF111812); 白桦
(BpACT, EU588981); 红三叶(Trifolium pretense, TpACT, AY372368); 甜菊(Stevia rebaudiana, SrACT, AF548026)。
植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月770
调控机制, 往往需要内部参照, 由于看家基因 β-肌
动蛋白(actin)的mRNA表达水平相对恒定, 被广泛
用于定量mRNA表达研究中样本量的校正。本文
研究得到的结果为利用RT-PCR技术, 研究柠条锦
鸡儿其他内源基因的表达模式和调控机制奠定了一
定的基础。
参考文献
陈墨君, 贾慎修(2000). 中国饲用植物. 北京: 中国农业出版社,
458~560
陈颖, 王刚, 赵俊霞(2003). 高等植物中的 actin基因. 生物学通
报, 38 (1): 13~15
胡松年, 阎隆飞(1999). 豌豆卷须肌动蛋白Ⅱ类异型 cDNA克隆
的序列分析. 中国生物化学与分子生物学报, 15: 857~860
凌毅, 赵武铃(2001). 豌豆肌动蛋白异型体基因的特异性表达. 植
物学通报, 18: 76~80
时永杰, 常根柱(2003). 柠条. 中兽医医药杂志, S1: 163~164
王赞, 高洪文, 韩建国, 上官铁梁(2005). 柠条锦鸡儿不同居群形
态变异研究. 西北植物学报, 25 (1): 118~123
伍国强, 席杰军, 包爱科, 王锁民(2008). 多浆旱生植物霸王Actin
基因片段的克隆及序列分析. 生物技术通报, (2): 101~104
薛庆中, 陈辰, 陈晓龙, 程尹, 冯晔, 洪旭, 黄鹏宇, 蒋琰, 骆迎峰, 莫
凡等(2009). DNA与蛋白质序列数据分析工具. 北京: 科学
出版社, 54~71
朱芷葳, 董常生(2006). 持家基因作为相对定量内标物的稳定性
比较. 生物技术通讯, 17 (5): 807~809
An YQ, Huang SR, McDowell JM, McKinney EC, Meagher RB
(1996). Conserved expression of the Arabidopsis ACT1 and
ACT3 actin subclass in organ primordia and mature pollen.
Plant Cell, 8: 15~30
Baird WV, Meagher RB (1987). A complex gene superfamily
encodes actin in petunia. EMBO J, 6 (11): 3223~3231
Cao XF, Wang RC, Yen LF, Lu ZB, Pan NS, Chen ZL (1994).
Construction of a pea tendril cDNA library and sequence
analysis of a pea actin cDNA, PEAc1. Chin Sci Bull, 39:
332~337
Diaz-Camino C, Renaud C, Ovsenek N, Villanueva MA (2004).
Actin expression is induced and three isoforms are differen-
tially expressed during germination in Zea mays. J Exp Bot,
56 (412): 557~565
Drouin G, Dover GA (1987). A plant processed pseudogene.
Nature, 328: 557~558
Elzinga M, Collins JH, Kuehl WM, Adelstein RS (1973). Com-
plete amino-acid sequence of actin of rabbit skeletal muscle.
Proc Natl Acad Sci USA, 70 (9): 2687~2691
Ghosh G, Mukherjee J, Biswas S, Pal A (1987). Actin-like protein
from Mimosa pudica L. Indian J Biochem Biophys, 24 (6):
336~339
Hightower RC, Meagher RB (1986). The molecular evolution of
actin. Genetics, 114: 315~332
Jiang YQ, Zhao WL (2002). Expression and hylogenetic analysis
of pea actin isoforms. J Integr Plant Biol, 44: 1456~1461
Kandasamy MK, Gilli land LU, McKinney EC, Meagher RB
(2001). One plant actin isovariant, ACT7, is induced by
auxin and required for normal callus formation. Plant Cell,
13: 1541~1554
Kandasamy MK, McKinney EC, Meagher RB (2002). Functional
nonequivalency of actin isovariants in Arabidopsis. Mol Biol
Cell, 13: 251~261
Mccurdy DW, Willamson RE (1987). An actin-related protein
inside pea chloroplasts. J Cell Sci, 87: 449~456
Nairn CJ, Winesett LL, Ferl RJ (1988). Nucleotide sequence of an
actin gene from Arabidopsis thaliana. Gene, 65 (2): 247~57
Parthasarathy MV, Perdue TD, Witzmun A, Alevernaz J (1985).
Actin network as a normal component of the cytoskeleton
in many vascular plant cells. Am J Bot, 72: 1318~1323
Reece KS, McElroy D, Wu R (1990). Genomic nucleotide se-
quence of four rice (Oryza sativa) actin genes. Plant Mol Biol,
14: 621~624
Shah DM, Hightower RC, Meagher RB (1982). Complete nucle-
otide sequence of a soybean actin gene. Proc Natl Acad Sci
USA, 79: 1022~1026
Staiger CJ, Chilwa MS (1987). Actin localization and function in
higher plants. Protoplasma, 141: 1~12
Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, De Borman B, Couman B, Hennen
G, Grisar T, Iqout A, Heinen E (1999). Housekeeping genes
as internal standards: use and limits. J Biotechnol, 75:
291~295
Villanueva MA, Ho SC, Wang JL (1990). Isolation and character-
ization of one isoform of actin from cultured soybean cells.
Arch Biochem Biophys, 277 (1): 35~41