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3-羰基辛酰基高丝氨酸内酯诱导拟南芥根细胞Ca2+内流



全 文 :植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (9): 872~878872
收稿 2011-06-22  修定 2011-08-02
资助 国家重点基础研究发展计划(2009CB126010)、河北省自
然科学基金(C2006000707)和河北省重点基础研究计划项
目(08965506D)。
* 通讯作者(E-mail: shuishans@hotmail.com; Tel: 0311-83999012)。
3-羰基辛酰基高丝氨酸内酯诱导拟南芥根细胞Ca2+内流
张哲1,2,3, 张霞1,2, 边子睿1,2,3, 宋水山1,2,*
1河北省科学院生物研究所, 石家庄050051; 2河北省农作物主要病害微生物控制工程技术研究中心, 石家庄050051; 3河北工
业大学化工学院, 天津300130
摘要: N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)是革兰氏阴性细菌群体感应系统(QS)中的胞间通讯信号分子。近年的研究表明AHLs可
以调控植物生长发育及防卫反应, 但其调控机制尚不清楚。本研究以拟南芥为材料, 采用3-羰基辛酰基高丝氨酸内酯
(3OC8-HSL)处理转水母发光蛋白基因的拟南芥幼根细胞, 利用冷光仪检测3OC8-HSL对拟南芥根细胞中胞质游离Ca
2+浓度
([Ca2+]cyt)变化的影响, 同时采用Ca
2+专一性螯合剂EGTA和Ca2+通道抑制剂预处理转基因拟南芥根细胞, 用全细胞膜片钳技
术分析3OC8-HSL诱导拟南芥根细胞中[Ca
2+]cyt升高的Ca
2+来源。结果表明, 3OC8-HSL可诱导拟南芥根细胞中[Ca
2+]cyt瞬时升
高。这种诱导效应可被EGTA、异搏定(verapamil)、LaCl3所抑制, 但LiCl预处理对这种诱导效应无影响。膜片钳分析结果
显示, 3OC8-HSL可激活质膜Ca
2+通道, 增加胞外Ca2+内流。说明细菌AHLs可诱导植物Ca2+信号产生, 且这种Ca2+信号主要源
于胞外Ca2+内流, 暗示Ca2+信使系统参与植物对细菌QS信号的响应。
关键词: N-酰基高丝氨酸内酯; 细菌群体感应; 钙信使; 拟南芥
N-3-oxo-Octanoyl-Homoserine Lactone Induces Intracellular Ca2+ Elevation in
Arabidopsis Root Cells
ZHANG Zhe1,2,3, ZHANG Xia1,2, BIAN Zi-Rui 1,2,3, SONG Shui-Shan1,2,∗
1Biology Institute, Hebei Academy of Sciences, Shijiazhuang 050051, China; 2Hebei Engineering and Technology Center of Mi-
crobiological Control on Main Crop Disease, Shijiazhuang 050051, China; 3School of Chemical Engineering, Hebei University of
Technology, Tianjin 300130, China
Abstract: N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) are the signal molecules which mediate the quorum-sensing
(QS) in Gram-negative bacteria. In recent years, the accumulating evidence indicates that AHLs are able to reg-
ulate the growth, development and defense response of plants. However, the mechanisms by which plant re-
sponses to bacterial QS signal molecule is little known. In this study, the change of cytosolic free Ca2+ concen-
tration ([Ca2+]cyt) and the activities of calcium channel in Arabidopsis thaliana root cells induced by N-3-oxo-
octanoyl-homoserine lactone (3OC8-HSL) were monitored by both microplate luminometer and the whole-cell
patch clamping. A transient elevation in [Ca2+]cyt was observed upon the treatment with 3OC8-HSL in the root
cells of Arabidopsis expressing the Ca2+ bioluminescent indicator aequorin. The elevation in [Ca2+]cyt induced
by 3OC8-HSL treatment was completely blocked by pretreatment with EGTA, verapamil and LaCl3, but was
unaffected by LiCl pretreatment. Furthermore, a hyperpolarization-activated calcium permeable channel was
recorded in plasma membrane of Arabidopsis root tip protoplast. The Ca2+ current intensity increased remark-
ably after 3OC8-HSL treatment. The results reveal that 3OC8-HSL can induce the generation of Ca
2+ signal in
Arabidopsis root cells and the cytosolic free Ca2+ increase induced by 3OC8-HSL comes mainly from the extra-
cellular space, illuminating that Ca2+ signaling participates in the plant cells sensing to bacterial QS signals.
Key words: N-acyl-homoserine lactones; bacterial quorum-sensing; Ca2+ signaling; Arabidopsis thaliana
N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-L-homoserine
lactones, AHLs)是革兰氏阴性细菌个体间通讯的一
种信号分子, 由其介导细菌群体感应系统参与细
菌多种生物学功能的调节(Whitchead等2001)。
AHLs分子是一类分子量较小的脂肪酸信号分子,
研究报告 Original Papers
张哲等: 3-羰基辛酰基高丝氨酸内酯诱导拟南芥根细胞Ca2+内流 873
包含一个保守的高丝氨酸内酯环和一条酰基侧
链。其特异性由其酰基链长度(4~18个碳原子)、
酰基链的饱和水平和侧链上C3位的取代基(羰基和
羟基)所决定(Camilli和Bassler 2006)。近年来的研
究表明, AHLs不仅被细菌自身感知, 而且也可以被
细菌的真核寄主植物感知, 进而调控植物的基因
表达和细胞反应 (宋水山2010; 赵芊和宋水山
2010)。
在植物细胞中, Mathesius等(2003)利用蛋白质
组学的方法研究发现, N-3-羰基十二酰基高丝氨酸
内酯(3OC12-HSL)和N-3-羰基已酰基高丝氨酸内酯
(3OC6-HSL)处理蒺藜苜蓿根后, 有150多种蛋白质
的表达量发生变化, 包括参与宿主防卫、应激反
应、新陈代谢活性、转录调控、蛋白质加工、细
胞骨架和植物激素响应的蛋白质。Schuhegger等
(2006)研究发现, 西红柿(Lycopersicon esculentum)
根际定殖产AHLs的菌Serratia liquefaciens MG1可
增强西红柿对叶原真菌Alternaria alternata的系统
抗性, 而不产AHLs的突变株MG44则不能产生这
种效应; 基因芯片和Northern blot的研究表明AHLs
可诱导水杨酸和乙烯通路的防卫基因的表达。Or-
tíz-Castro等(2008)通过测定不同浓度AHLs处理后
拟南芥生长表型变化, 发现AHLs主要改变了拟南
芥的根系结构, 影响主根生长以及侧根和根毛的
形成和发育。von Rad等(2008)报道, N-丁酰基高
丝氨酸内酯(N-butyl-homoserine lactone, C4-HSL)
和N-己酰基高丝氨酸内酯(N-hexanoyl-DL-homos-
erine lactone, C6-HSL)显著促进拟南芥根和幼苗的
生长, 并且能调节水杨酸和乙烯相关的防卫基因
表达。本实验室的研究又发现, C4-HSL、C6-HSL
处理马铃薯可影响其生长, 并提高马铃薯的抗病
能力(黄媛媛等2010); 3OC6-HSL和N-3-羰基辛酰基
高丝氨酸内酯(N-3-oxo-octanoyl-homoserine lac-
tone, 3OC8-HSL)都能显著促进拟南芥主根的生长
(边子睿等2011), 并能提高拟南芥幼苗对盐的耐受
性(待发表)。这些结果表明, 植物可以感应细菌
AHLs, 并做出相应的反应。但目前对于植物细胞
感应和应答细菌群体感应信号AHLs的信号转导机
制尚不清楚。
植物细胞内游离Ca2+是细胞内信号转导主要
的第二信使。当植物细胞受到外界生物和非生物
因子刺激时, 胞质游离Ca2+浓度([Ca2+]cyt)瞬时升高,
Ca2+浓度变化引起一连串的下游作用, 激活相应的
靶酶或靶蛋白, 从而引起细胞生理生化反应。研
究表明, Ca2+促使系统参与植物对多种激素如ABA
(Levchenko等2005; Kohler 2001)、赤霉素(Leckie
等1998)等 , 多种环境因素如光(Sai和Johnson
2002)、触摸(Knight等1996)、干旱(Knight等1997)
以及真菌激发子(Blume等2000; Knight等1996)和
结瘤因子(Muller等2000)应答的信号转导过程。细
菌胞间通讯信号分子AHLs是一类脂肪酸酯化合
物, 在结构上与某些真核生物的激素分子具有一
定相似性。Cooley等(2008)研究发现, 3OC12-HSL
可诱导哺乳动物[Ca2+]cyt升高。用C6-HSL处理沙雷
氏菌能够诱导细菌[Ca2+]cyt瞬时升高, 并且可提高
蛋白激酶的活性(Werthen和Lundgren 2001)。但迄
今为止, 尚未有关于AHLs是否引起植物[Ca2+]cyt变
化的报道。
本文以转水母发光蛋白基因的拟南芥幼根
细胞为材料, 检测用细菌信号3OC8-HSL处理后
[Ca2+]cyt的变化, 采用药理学方法探讨[Ca
2+]cyt变化
的Ca2+来源, 并进一步采用膜片钳分析质膜Ca2+通
道及Ca2+内流情况, 探究3OC8-HSL是否可诱导拟
南芥根细胞[Ca2+]cyt瞬时变化, 以及[Ca
2+]cyt变化的
Ca2+流来源, 以证明Ca2+浓度变化可能是植物感应
细菌AHL的早期信号转导事件。
材料与方法
1 材料和试剂
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L. Heynh)
(Col-0)由本实验室保存; 转水母发光蛋白基因哥
伦比亚拟南芥(Col-aeq)由河北师范大学生命科学
学院尚忠林教授惠赠。
3OC8-HSL、无水氯化镧(LaCl3)、异搏定
(verapamil)购自Sigma公司; EGTA、氯化锂(LiCl)
购自生工生物工程(上海)有限公司; 腔肠素(coel-
enterazine)购自Promega公司。
2 拟南芥幼苗培养
选取籽粒饱满的拟南芥种子, 用75%乙醇消
毒30 s, 无菌水反复冲洗2次, 再用25%次氯酸钠消
毒5 min, 用无菌水反复冲洗5次。3~5粒种籽为一
簇, 点种于MS培养基上。12 h光照/12 h黑暗环境
植物生理学报874
下, 恒温22 ℃培养7~9 d。
3 荧光辅基的孵育
选用在MS培养基上生长7~9 d的拟南芥幼
苗。以20株苗为一簇, 取Col-aeq拟南芥根浸泡于
含有4 μg·mL-1腔肠素的500 μL氯化钙缓冲液(10
mmol·L-1 CaCl2、2 mmol·L
-1 MES, Tris调pH至5.7)
中避光孵育24 h, 温度28 ℃。将孵育过的Col-aeq
拟南芥根用新鲜氯化钙缓冲液洗涤2次, 重新浸泡
于500 μL新鲜氯化钙缓冲液中, 静置30 min。这是
因为触碰或温度等因素可能造成细胞胞质内钙离
子浓度变化, 30 min静置足以让涌入胞内的钙离子
通过质膜上的钙泵回到钙库, 保持细胞胞质内钙
离子浓度处于稳态水平。这时可按需要使用钙离
子螯合剂EGTA (10 mmol·L-1)或钙离子通道抑制剂
异搏定(10 mmol·L-1)、LaCl3 (10 mmol·L
-1)、LiCl
(20 mmol·L-1)等药物处理(尚忠林和孙大业2002;
Torrecilla等2000)。
4 荧光强度的检测及换算
将处理好的Col-aeq拟南芥根用滤纸吸干, 放
置于盛有50 μL氯化钙缓冲液的黑色96孔板小孔
中。所有操作须尽量轻缓、避光。用冷光仪(Syn-
ergy 2 Multi-Mode Microplate Reader, 美国)每5 s检
测一次拟南芥根细胞发出的荧光。当检测到的荧
光强度趋于稳定时, 由进样口向相应盛有样品的
孔内加入一定量的3OC8-HSL, 检测3OC8-HSL诱导
胞内钙离子浓度的变化。当荧光强度再次稳定一
段时间后, 由进样口2向样品内加入钙离子释放液
[2 mol·L-1 CaCl2、20% (V/V)无水乙醇], 检测并记
录剩余发光值。
按公式: p(Ca2+)=5.5593-0.332588logk计算胞
内钙离子浓度(Mithofer和Mazars 2002)。其中, k指
速率常数, 其大小等于每次记录的发光数值除以
细胞内残存水母发光蛋白的发光总值。
5 拟南芥幼苗根尖细胞原生质体制备
选取在MS培养基上生长5~7 d的Col-0拟南芥
根, 用刀片切取根尖部及其以上1 cm左右的组织,
切成1 mm小段放入1 mL裂解液(1.0%纤维素酶、
0.01%果胶酶、10 mmol·L-1 CaCl2、10 mmol·L
-1
KCl、2 mmol·L-1 MgCl2、2 mmol·L
-1 MES, Tris调
pH至5.6~5.8, 山梨醇调渗透压至310 mmol·kg-1), 28 ℃
孵育, 60 r·min-1振荡90 min。将原生质体过200目
筛网, 用2 mL EP管收集, 室温下100×g离心3 min,
保存于冰上待用。
6 膜片钳检测
本实验使用全细胞步进式电压钳技术(Hamill
等1981)记录电流变化(Axon 200B, 美国)。细胞外
液为: 20 mmol·L-1 CaCl2、5 mmol·L
-1 MES, Tris调
pH至5.7, 山梨醇调渗透压至310 mmol·kg-1; 电极内
液为: 10 mmol·L-1 EDTA、0.5 mmol·L-1 CaCl2、4
mmol·L -1 Ca(OH)2、2 mmol·L
-1 MgATP、0.5
mmol·L-1 TrisATP、15 mmol·L-1 HEPES, Tris调pH
至7.2, 山梨醇调渗透压至260 mmol·kg-1, 电极内液
的Ca2+终浓度为100 nmol·L-1。室温[(20±2) ℃]、暗
光条件下开始记录。取原生质体0.5 mL于膜片钳
浴池中, 静置5 min, 然后加入1 mL细胞外液, 再静
置5 min。于显微镜下找到合适的原生质体, 并操
作微操作器使电极尖端快速、稳定地接近原生质
体, 对电机内部开始施加负压。待细胞被负压吸
破, 即可开始检测此时的封接电阻, 记录电流(Kar-
mazínová和Lacinová 2010)。
实验结果
1 3OC8-HSL诱导拟南芥根细胞[Ca2+]cyt瞬时升高
在表达Ca2+感应蛋白——水母发光蛋白基因
的转基因拟南芥中, 可以通过测定水母发光蛋白
介导的光强变化来检测[Ca2+]cyt的变化。本研究发
现, 转基因拟南芥根细胞中[Ca2+]cyt稳态浓度约为
0.22 μmol·L-1。采用5种不同浓度的3OC8-HSL分别
处理拟南芥根细胞, 发现当加入0.1、1、10和100
μmol·L-1的3OC8-HSL处理10 s后, 根细胞中[Ca
2+]cyt
迅速升高, 之后又迅速恢复到稳态水平, 但0.01
mmol·L-1的3OC8-HSL未能诱导[Ca2+]cyt的瞬时升高
(图1-A)。4个有效浓度对根细胞[Ca2+]cyt的诱导效
应并未有显著差异 , 处理后均可以使根细胞中
[Ca2+]cyt迅速升高到0.32 μmol·L
-1以上(图1-B)。
2 3OC8-HSL诱导拟南芥根细胞外Ca2+内流
为探究3OC8-HSL处理导致拟南芥根细胞
[Ca2+]cyt瞬时升高的Ca
2+来源, 我们分别用Ca2+专一
性螯合剂EGTA、细胞质膜Ca2+通道抑制剂异搏定
和LaCl3预处理拟南芥根30 min, 之后加入100
μmol·L-1 3OC8-HSL, 观测[Ca
2+]cyt的变化。结果表
明, 三者预处理均能完全阻止3OC8-HSL诱导的
张哲等: 3-羰基辛酰基高丝氨酸内酯诱导拟南芥根细胞Ca2+内流 875
[Ca2+]cyt瞬时升高, 但胞内钙库Ca
2+通道抑制剂LiCl
(20 mmol·L-1)并不影响3OC8-HSL对胞内Ca
2+浓度
的诱导作用(图2-A和B), 说明3OC8-HSL诱导的拟
南芥根细胞[Ca2+]cyt的增加来源为胞外的Ca
2+内
流。
3 3OC8-HSL激活质膜Ca2+通道促进胞外Ca2+内流
水母发光蛋白法检测的结果表明, 3OC8-HSL
诱导的拟南芥根细胞[Ca2+]cyt升高主要是由胞外钙
离子通过细胞膜上的钙通道进入细胞的。为了验
证3OC8-HSL对细胞膜上的钙通道是否具有激活作
用, 本实验使用全细胞步进式电压钳技术检测拟
南芥根尖原生质体质膜上的Ca2+流动。对原生质
体全细胞跨膜电流的检测结果表明, 100 μmol·L-1
3OC8-HSL引起了显著的超极化激活电流。在-200
mV电压时, 本底离子电流强度为-144.7 pA, 而使
用100 μmol·L-1 3OC8-HSL处理后, 离子电流强度升
高到-242.1 pA (图3-A)。根据实验所得数据统计
得出了电流-电压关系曲线(图3-A)。如图所示, 随着
膜电压超极化程度的加强, 跨膜电流强度也随之
增大, 表现出显著的超极化激活特征(图3-B和D)。
若将细胞外液中的CaCl2替换为BaCl2, 所检测到的
离子电流强度与对照无显著差异(图3-B和C)。
讨  论
细菌产生AHLs用于其群体内胞间通讯, 来协
调其群体行为。植物自身也能够产生与AHLs结构
类似的化合物, 包括N-酰基乙醇胺(NAEs)和酰基
烷酰胺(alkamides) (Ortíz-Castro等2008)。这些化
合物广泛分布于植物中, 并且具有强大的生物活
性, 所以被人们认为是一类新型的植物激素(Ló-
pez-Bucio等2006; Chapman 2004)。López-Bucio等
(2007)研究发现, 一定浓度的N-十二酰基乙醇胺
(NAE12:0)可以抑制拟南芥幼苗主根生长, 并刺激
图2 3OC8-HSL及Ca
2+螯合剂和Ca2+通道抑制剂处理
对拟南芥根细胞[Ca2+]cyt的影响
Fig.2 Effects of inhibitors on the changes of cytosolic free
Ca2+ concentration induced by 3OC8-HSL
in Arabidopsis root cells
A: EGTA、异搏定、LaCl3和LiCl预处理对3OC8-HSL诱导拟
南芥根细胞[Ca2+]cyt随时间变化的影响; B: 钙信号抑制剂预处理后
3OC8-HSL诱导拟南芥根细胞[Ca
2+]cyt的瞬时变化。30次独立实验
数据统计结果。
图1 3OC8-HSL处理对拟南芥根细胞[Ca
2+]cyt的影响
Fig.1 Effects of 3OC8-HSL on [Ca
2+]cyt
in Arabidopsis root cells
A: 不同浓度的3OC8-HSL对拟南芥根细胞[Ca
2+]cyt随时间变化
的影响; B: 不同浓度的3OC8-HSL诱导拟南芥根细胞[Ca2+]cyt瞬时
变化的最大平均值。30次独立实验数据统计结果。
植物生理学报876
侧根发育。同样, 从植物中分离出的椰油脂肪酸
二乙醇酰胺可以通过影响细胞分裂和分化过程来
改变拟南芥根和芽的系统结构(Campos-Cuevas等
2008)。本实验室研究发现, 3OC6-HSL和3OC8-
HSL处理能显著增加拟南芥主根根长(边子睿等
2011)。尽管NAEs和酰基烷酰胺影响植物生长发
育的作用机制尚不清楚 , 但许多植物激素如
ABA、乙烯、赤霉素、茉莉酸等调控植物生长发
育的过程均需Ca2+信使的参与(Liu等2010; 许涛等
2007; Sun等2006; Leckie等1998)。本研究结果表
明, 一定浓度的3OC8-HSL处理拟南芥根细胞可诱
导[Ca2+]cyt瞬时升高(图1), 说明Ca
2+信使可能参与
3OC8-HSL对植物细胞反应的调节。细菌AHLs有
可能被植物作为一种植物激素来感知, 并且做出
相应的细胞反应。Ca2+信号产生可能是AHLs在植
物细胞中信号转导过程的上游事件。
Ca2+信号可以直接由胞外钙库中的钙离子通
过质膜钙通道内流产生, 也可以由胞内钙库如内
质网或者液泡释放钙离子产生, 也可能是两方面
共同作用的结果(Han等2003)。本研究结果表明,
Ca2+专一性螯合剂EGTA、钙通道抑制剂异搏定或
钙通道拮抗剂LaCl3预处理, 均阻断了3OC8-HSL诱
导的拟南芥根细胞中[Ca2+]cyt的升高, 而3OC8-HSL
诱导的[Ca2+]cyt升高作用不受胞内三磷酸肌醇(inos-
itol triphosphate, IP3)途径抑制剂LiCl预处理的影
响。说明3OC8-HSL诱导拟南芥根细胞[Ca
2+]cyt升
高的Ca2+来源于胞外Ca2+内流而不是胞内钙库释放
的Ca2+。
膜片钳分析结果显示, 3OC8-HSL处理使得拟
南芥根尖细胞质膜电流增强。当细胞外液中的
Ca2+被Ba2+替换后, 3OC8-HSL处理导致的质膜离子
电流强度明显减少 , 与对照无明显差异。说明
3OC8-HSL特异性地诱导了钙信号的产生, 进一步
验证了3OC8-HSL诱导拟南芥根细胞胞外Ca
2+内流
导致[Ca2+]cyt增加。
植物与微生物在自然环境中长期共同生存、
图3 3OC8-HSL诱导拟南芥根原生质体离子内流
Fig.3 3OC8-HSL induces Ca
2+ influx in Arabidopsis root protoplast
A: 对照(平均值, n=6)、3OC8-HSL处理和用BaCl2替换细胞外液中的CaCl2后3OC8-HSL处理下的电流-电压关系; B~D: 全细胞膜片钳
检测下对照(B)、用BaCl2替换细胞外液中的CaCl2后3OC8-HSL处理(C)和3OC8-HSL处理(D)的电流-时间关系。
张哲等: 3-羰基辛酰基高丝氨酸内酯诱导拟南芥根细胞Ca2+内流 877
共同进化的长河中形成了相互作用的复杂机制。
植物可以通过感应根系细菌分泌产生的代谢物来
感知有益微生物或有害微生物的存在, 进而做出
适当的细胞反应以适应这种共存关系。源自大豆
疫霉菌(Phytophthora sojae)的寡肽激发子Pep-13能
够诱导大麦悬浮培养细菌[Ca2+]cyt, 进而通过级联
反应产生抗病防卫反应(Blume等2000)。Ca2+也参
与鞭毛蛋白flg22在拟南芥叶片, β-甘露糖在大豆悬
浮培养细胞(Mithofer等1999)和许多蛋白类激发子
和寡糖激发子(Lecourieux等2002)诱导的抗病反
应。3OC8-HSL是由植物病原细菌根癌农杆菌和软
腐欧文氏菌产生的, 用于自身群体感应系统的胞
间通讯, 参与其致病因子产生的调控, 是决定其对
植物侵染能力的关键因子。本研究室前期研究表
明, 3OC8-HSL处理可提高拟南芥、马铃薯、黄瓜
对多种病原菌的抗病能力, 提高防卫反应标志酶
如苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等
的活性 , 促进活性氧的产生 , 诱导抗病基因如
PR1、PDF1.2、PB3等的表达(资料待发表)。联系
到本研究结果 , 我们推测植物感应细菌产生的
AHLs, 激活质膜上的钙离子通道, 促进胞外Ca2+内
流, 产生Ca2+信号, 再经下游级联反应使信号转导
放大, 启动相关基因表达, 最终产生抗病反应。
不同细菌产生的信号分子AHLs也不同, 同一
种细菌也可能产生几种不同的信号分子。虽然不
同的AHLs都具有一个相同的高丝氨酸内酯环, 但
酰基侧链则各有特异性。在被检测的十几种AHLs
中, 有的可以诱导植物胞质游离Ca2+浓度增加, 有
的则不表现诱导效果。至于植物对于细菌AHLs的
感应机制是否具有特异性, 目前正在进一步研究
中。
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