全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (7): 1055~1060　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0159 1055
收稿 2015-04-01　　修定 2015-06-17
资助 湖南省自然科学基金项目(2015JJ3178)、长沙市科技攻关
资金专项项目(K1406011-21)和中南林业科技大学青年基
金项目(QJ2013003A)。
* 通讯作者(E-mail: shihp@scnu.edu.cn; Tel: 020-85214793)。
6-BA和硝酸银对三裂叶野葛毛状根生长及异黄酮含量的影响
何含杰1,2, 施和平2,*, 王震3
1中南林业科技大学林业生物技术湖南省重点实验室/生物发育工程及新产品研发协同创新中心, 长沙410004; 2华南师范大
学生命科学学院, 广东省植物发育生物工程重点实验室, 广州510631; 3上海现代哈森(商丘)药业有限公司, 河南商丘476000
摘要: 本文研究了6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和硝酸银(AgNO3)组合对固体培养的三裂叶野葛毛状根生长、异黄酮化合物含量及
抗氧化酶活性的影响。结果表明, 不同浓度的6-BA和30 μmol·L-1 AgNO3组合抑制三裂叶野葛毛状根的生长, 促进毛状根中异
黄酮化合物的合成与积累, 但降低总异黄酮化合物和可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性水平, 促进细胞程
序性死亡的发生。这说明6-BA和AgNO3组合对三裂叶野葛毛状根的生长和异黄酮化合物的积累具有重要的调控作用。
关键词: 三裂叶野葛; 毛状根; 6-BA; AgNO3; 异黄酮化合物; 抗氧化酶活性; 细胞程序性死亡
Effects of 6-Benzylaminopurine and Silver Nitrate on the Growth and Isofla-
vone Contents in Culture of Pueraria phaseoloides Hairy Roots
HE Han-Jie1,2, SHI He-Ping2,*, WANG Zhen3
1Hunan Provincial Key Laboratory of Forestry Biotechnology/Cooperative Innovation Center of Engineering and New Prod-
ucts for Developmental Biology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China; 2Guangdong
Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou
510631, China; 3Shanghai Hasen-Modern (Shangqiu) Pharmaceutical Company Limited, Shangqiu, Henan 476000, China
Abstract: Using hairy roots of Pueraria phaseoloides cultured on solid media as an experiment material in this
paper, the effects of 6-benzylaminopurine (6-BA) in combination with silver nitrate (AgNO3) on its growth, iso-
flavone compound contents, and antioxidase activities were studied. The results showed that the growth of P.
phaseoloides hairy roots, treated by different concentrations of 6-BA in combination with 30 μmol·L-1 AgNO3,
was inhibited, and the synthesis and accumulation of isoflavone compounds in hairy roots per gram was en-
hanced compared with control. Meanwhile, the contents of total isoflavone compounds and soluble protein, and
the activities of superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) in hairy roots were decreased, and the oc-
currence of programmed cell death was accelerated after treatment with different concentrations of 6-BA in
combination with AgNO3. These results indicated that 6-BA in combination with AgNO3 had important regula-
tion on growth and accumulation of isoflavone compounds in P. phaseoloides hairy roots.
Key words: Pueraria phaseoloides; hairy roots; 6-BA; AgNO3; isoflavone compounds; antioxidase activities;
programmed cell death
三裂叶野葛系多年生、豆科藤本植物, 其根
含有葛根素、大豆苷等异黄酮化合物, 具有改善
心脑血循环、增强免疫力等功能, 此外还具有类
似雌性激素的功效, 广泛用于治疗高血压、心绞
痛等病症(吴德邻等1994; 杨秋娅等2013)。但由于
其野生资源的匮乏而无法满足医药工业的巨大需
求, 为此, 我们利用遗传转化三裂叶野葛外植体的
方法, 获得了自主、快速生长且高葛根素含量的
毛状根(施和平等2003)。已有的研究表明, 植物毛
状根的生长和次生代谢物质的合成与积累易受植
物激素、硝酸银(AgNO3)等因素的影响(杨睿等
2005; 张真等2008)。细胞分裂素和AgNO3作为重
要的调节物质, 参与了植物器官的发育与衰老、
药用植物的生长和次生代谢等过程(何含杰和施和
平2014; 王思瑶等2014; 杨东清等2013; 袁玉辉等
2013)。但迄今为止还未见有关细胞分裂素和AgNO3
对三裂叶野葛毛状根生长和次生代谢影响的报
道。为此, 我们研究了6-BA和AgNO3对三裂叶野
葛毛状根生长和次生代谢的影响, 以期为今后利
植物生理学报1056
用三裂叶野葛毛状根进行异黄酮物质的生产提供
技术参考。
材料与方法
1 植物材料
采用实验室继代培养保留下来的三裂叶野葛
[Pueraria phaseoloides (Roxb.) Benth.]毛状根, 参考
施和平等(2003)的方法进行继代培养。
2 培养基及培养条件
采用添加不同浓度(0.1、0.5、1.0、3.0、5.0
mg·L-1) 6-BA和30 μmol·L-1 AgNO3的MS固体培养基,
蔗糖浓度为3%, 琼脂为18 g·L-1, pH 5.8~6.0; 以MS培
养基为对照。接种后, 将三裂叶野葛毛状根置于培
养架上, 于(25±2) ℃、黑暗条件下静止培养。
3 毛状根的培养及其生长的测定
选取生长旺盛的三裂叶野葛毛状根, 剪切成
4~5 cm长的根尖段, 然后接入含有不同浓度6-BA
和30 μmol·L-1 AgNO3的MS固体培养基上进行培养
(每瓶约0.5 g)。在培养过程中, 每隔5 d随机抽取3
瓶, 同时用天平称量毛状根的干重。
4 异黄酮化合物含量的测定
三裂叶野葛毛状根中异黄酮化合物含量的测
定参考施和平等(2003)的方法。
5 可溶性蛋白含量和抗氧化酶活性的测定
三裂叶野葛毛状根培养物中可溶性蛋白含量
的测定参照Bradford (1976)的方法。超氧化物歧
化酶(superoxide dismutase, SOD)活性的测定参照
Beauchamp和Fridovich (1971)的方法。过氧化物
酶(peroxidase, POD)活性的测定参照施和平等
(2010)的方法。
6 DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测
参照施和平等(2003)的方法提取三裂叶野葛
毛状根基因组DNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测条
件为: 50 V, 1.5 h。
实验结果
1 6-BA和AgNO3组合对毛状根生长的影响
由图1可见, MS培养基上培养的三裂叶野葛
上培养的毛状根生长较快, 培养5~25 d, 毛状根的
干重逐渐增加, 培养至25 d时达到最大值, 每个培
养瓶中毛状根的干重约为0.37 g, 是培养初期的
2.88倍; 随着营养物质的消耗及毛状根的逐渐褐
化, 生物量逐渐下降, 培养至40 d时达到最低值。
与对照相比较, 在添加不同浓度6-BA和30 μmol·L-1
AgNO3的培养基上, 毛状根生长缓慢, 生长峰值出
现的时间推迟5~10 d (图1-A)。另外, 随着6-BA浓
度升高, 毛状根生长的抑制程度也越大。当AgNO3
浓度恒定为30 μmol·L-1, 添加6-BA 0.5 mg·L-1时, 则
三裂叶野葛毛状根的产生部分被抑制, 且老根逐
渐褐化和衰老(图1-C); 当6-BA浓度为5.0 mg·L-1时,
则毛状根的生长完全被抑制, 老根逐渐变成黑色
或逐渐膨大且似愈伤化(图1-D)。表明6-BA和
AgNO3组合抑制三裂叶野葛毛状根的生长, 降低毛
状根的生物量。
2 6-BA和AgNO3组合对毛状根中异黄酮化合物含
量的影响
由图2-A可见, MS培养基上培养的三裂叶野
葛毛状根中异黄酮化合物含量呈先上升后下降的
变化趋势, 培养至10 d时, 达到最大值, 约为35.83
mg·g-1 (DW), 提高了32.24%, 随后开始逐渐下降。
与对照相比, 在MS+6-BA 0.1 mg·L-1+AgNO3 30
μmol·L-1上培养的三裂叶野葛毛状根中异黄酮化合
物含量呈逐渐下降的变化趋势, 培养至30 d时, 含
量下降了25.10%; 而在培养基中添加0.5~5.0 mg·L-1
6-BA和30 μmol·L-1 AgNO3则可以促进每克三裂叶
野葛毛状根中异黄酮化合物的积累, 在培养末期,
异黄酮化合物含量均高于对照中的含量。然而,
不同浓度6-BA和30 μmol·L-1 AgNO3组合降低了每
个培养瓶中三裂叶野葛毛状根的总异黄酮化合物
含量。培养至30 d时, 培养瓶中总异黄酮化合物的
含量是同期对照的17.47%~66.20% (图2-B)。
3 6-BA和AgNO3组合对毛状根中可溶性蛋白含量
的影响
从图3可见, 对照上培养的三裂叶野葛毛状根
中可溶性蛋白含量呈现先下降后上升的变化趋势,
培养至25 d时, 达到最低值, 约为1.26 mg·g-1 (FW),
是培养初期的15.39%; 培养25~30 d, 可溶性蛋白含
量又逐渐升高, 30 d时为培养初期的16.88%。与对
照相比, 添加0.1、0.5、1.0、3.0、5.0 mg·L-1 6-BA
和30 μmol·L-1 AgNO3的培养基上培养的三裂叶野
葛毛状根中可溶性蛋白含量总体上呈现下降的变
化趋势, 培养至30 d时, 达到最低值, 分别是其培养
初期含量的37.43%、44.29%、76.37%、59.76%和
50.93%, 但均高于同期对照水平。另外, 在三裂叶
何含杰等: 6-BA和硝酸银对三裂叶野葛毛状根生长及异黄酮含量的影响 1057
图2 不同浓度6-BA和AgNO3 30 μmol·L
-1组合对三裂叶野葛毛状根中异黄酮化合物含量的影响
Fig.2 Effects of different concentrations of 6-BA in combination with 30 μmol·L-1 AgNO3 on the contents of isoflavone
compounds in P. phaseoloides hairy roots
野葛毛状根培养过程中 , 不同浓度6-BA和30
μmol·L-1 AgNO3组合培养的不同时期毛状根中可
溶性蛋白含量均较同期对照高。这表明, 不同浓
度6-BA和30 μmol·L-1 AgNO3组合可以延缓三裂叶
野葛毛状根中可溶性蛋白的降低。
4 6-BA和AgNO3组合对毛状根中SOD和POD活性
的影响
从图4-A可知, MS培养的三裂叶野葛毛状根
中SOD活性变化幅度较大, 培养至30 d时, 达到最
大值, 约为222.21 U·mg-1 (蛋白), 是其培养初期水
图1 不同浓度6-BA和AgNO3 30 μmol·L
-1组合对三裂叶野葛毛状根生长的影响
Fig.1 Effects of different concentrations of 6-BA in combination with 30 μmol·L-1 AgNO3 on the growth of P. phaseoloides hiary roots
B: MS; C: MS+6-BA 0.5 mg·L-1+AgNO3 30 μmol·L
-1; D: MS+6-BA 5.0 mg·L-1+AgNO3 30 μmol·L
-1。培养25 d。
植物生理学报1058
平的10.40倍。与对照相比, 添加0.1、0.5、1.0、
3.0、5.0 mg·L-1 6-BA和30 μmol·L-1 AgNO3组合的
培养基上培养的三裂叶野葛毛状根中SOD活性很
低, 且变化不明显, 培养至30 d时, SOD活性分别较
同期对照下降了49.94%、82.59%、77.58%、
69.03%和80.99%。这表明不同浓度6-BA和30
μmol·L-1 AgNO3组合可降低三裂叶野葛毛状根中
SOD活性。
由图4-B可知, 对照毛状根中POD活性呈上升
趋势, 培养至30 d时POD活性达到最大值, 是培养
初期毛状根POD活性水平的6.16倍, 然后随着毛状
根的褐化而逐渐降低。与对照相比, 添加不同浓
度6-BA和AgNO3 30 μmol·L
-1培养基培养的三裂叶
野葛毛状根POD活性则随着培养时间的延长而逐
渐升高, 在培养至30 d时达到最大值, 分别是同期
对照POD活性的82.15%、55.19%、28.85%28.16%
和39.30%。以上结果表明 , 不同浓度6-BA和
AgNO3 30 μmol·L
-1组合降低三裂叶野葛毛状根的
POD活性。
5 6-BA和AgNO3组合对毛状根细胞程序性死亡
(programmed cell death, PCD)的影响
由图5可见, 三裂叶野葛毛状根在添加不同浓
图5 不同浓度6-BA和AgNO3 30 μmol·L
-1组合处理后三裂叶野葛毛状根中DNA片段的电泳检测
Fig.5 Electrophoresis detection of DNA fragments in P. phaseoloides hairy roots after treatment with different concentrations of
6-BA in combination with 30 μmol·L-1 AgNO3
M: marker; 1: 对照; 2: 6-BA 0.1 mg·L-1; 3: 6-BA 0.5 mg·L-1; 4: 6-BA 1.0 mg·L-1; 5: 6-BA 3.0 mg·L-1; 6: 6-BA 5.0 mg·L-1。
图3 不同浓度6-BA和30 μmol·L-1 AgNO3组合对三裂叶野
葛毛状根中可溶性蛋白含量的影响
Fig.3 Effects of different concentrations of 6-BA in
combination with 30 μmol·L-1 AgNO3 on soluble
protein contents in P. phaseoloides hiary roots
图4 不同浓度6-BA和AgNO3 30 μmol·L
-1组合对三裂叶野葛毛状根中SOD和POD活性的影响
Fig.4 Effects of different concentrations of 6-BA in combination with 30 μmol·L-1 AgNO3 on the activities
of SOD and POD in P. phaseoloides hairy roots
何含杰等: 6-BA和硝酸银对三裂叶野葛毛状根生长及异黄酮含量的影响 1059
度6-BA和30 μmol·L-1 AgNO3的培养基上培养至20
d时, 通过琼脂糖凝胶电泳可以观察到140~200 bp
大小的DNA片段; 培养至30 d时, DNA片段更亮,
且亮度与6-BA的浓度呈正相关。说明不同浓度
6-BA和30 μmol·L-1 AgNO3组合可以诱导三裂叶野
葛毛状根PCD的发生。
讨　　论
6-BA是一种细胞分裂素类抑制物质, 而AgNO3
是乙烯作用的抑制剂; 它们可在植物的生长发育
及次生物质代谢过程中发挥着重要的作用(袁玉辉
等2014; 李琰等2010)。已有的报道证实, 在MS培
养基中添加2.0 mg·L-1 6-BA可以显著促进丹参
(Salvia miltiorrhiza)毛状根中丹参酮IIA的生物合
成与积累(房翠萍等2011); 在MS培养基中添加1.0
mg·L-1 KT和不同浓度的AgNO3可以显著促进葡萄
(Vitis vinifera)愈伤组织中白藜芦醇的合成与积累
(张真等2008)。实验结果显示, 不同浓度6-BA和30
μmol·L-1 AgNO3组合不仅抑制三裂叶野葛毛状根
的生长, 而且降低毛状根总异黄酮化合物的含量
(图1和2), 这与已有的研究结果不一致, 可能与植
物种类、毛状根类型以及激素浓度不同有关。
较多的Ag+对植物活体细胞有伤害作用, 进而
调控细胞内抗氧化酶活性水平。已有的研究结果
证实, 外施6-BA和AgNO3可以提高黄瓜(Cucumis
sativus)和小麦(Triticumae slivum)叶片中POD和
SOD的活性水平(娄群峰等2003; 艾辛等2000; 杨东
清等2013)。AgNO3可以提高香蕉组培苗种POD和
SOD的活性水平 , 而降低雌性系黄瓜植株体内
POD的活性水平(陈学好和赵有为1993; 区炳庆和
何丽烂2003)。本文结果表明, 不同浓度的6-BA和
30 μmol·L-1 AgNO3组合可以延缓三裂叶野葛毛状
根中可溶性蛋白的降低, 降低SOD和POD的活性
水平(图3和4), 这与陈学好和赵有为(1993)的研究
结果相反, 但与区炳庆和何丽烂(2003)的研究结果
部分一致。这表明, 6-BA和AgNO3对植物抗氧化
酶活性的影响因植物或毛状根类型而异, 但有关
6-BA和AgNO3组合调控三裂叶野葛毛状根SOD和
POD活性水平的具体机制尚有待进一步研究。
PCD是植物生长过程中一种重要的生理现象,
受到许多因素的诱导和影响, 如植物激素等(Kuni-
kowska等2013; 代建丽等2013)。外施6-BA可以促
进烟草(Nicotiana tabacum)和胡萝卜(Daucus caro-
ta)细胞的衰老, 诱导PCD的发生, 提高衰老相关基
因(senescence-associated gene) SAG-12的表达水平
(Samuilov等2013)。10 μmol·L-1 Ag+可以促进氰化
钾诱导的豌豆(Pisum sativum)叶表皮细胞的PCD发
生(Carmi等2004)。在本研究中, 不同浓度6-BA和
30 μmol·L-1 AgNO3组合不仅抑制三裂叶野葛毛状
根的生长, 而且促进PCD的发生, 且高浓度6-BA的
促进效果较显著(图5), 与已有的研究结果相一
致。已有的研究表明, 植物PCD的发生与乙烯的合
成和积累密切相关, 而AgNO3是乙烯作用的抑制
剂, 因此, 本实验中6-BA和AgNO3组合对三裂叶野
葛毛状根生长、异黄酮合成的影响是否是通过影
响其乙烯的合成与积累以及是否通过乙烯来影响
三裂叶野葛毛状根的异黄酮化合物的合成和抗氧
化酶的活性, 还需进一步的研究和验证。
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