全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (2): 178~184178
收稿 2013-09-18　　修定 2013-12-17
资助 国家苹果产业技术体系项目(CARS-28-01-07)、青岛市科
技计划基础研究项目[12-1-4-5-(1)-jch]和“十二五”农村领
域国家科技计划项目(2013BAD02B01)。
* 通讯作者(E-mail: hydai@qau.edu.cn; Tel: 0532-86080008)。
三个苹果NBS基因的鉴定及其对外源生长物质的响应
柏素花1,2, 宋霄1, 张玉刚1, 戴洪义1,*
青岛农业大学1园艺学院, 2生命科学学院, 山东省高校植物生物技术重点实验室, 山东青岛266109
摘要: 为了探讨苹果NBS基因的生理作用, 从苹果中鉴定了NBS家族的3个基因, 分别命名为MdNBS、MdTIR-NBS1和
MdTIR-NBS-LRR1。这3个基因编码的蛋白质均含有NB-ARC结构域, MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-LRR1蛋白N端还有TIR
结构域, MdTIR-NBS-LRR1蛋白在C端含有LRR结构。荧光定量PCR分析表明, 这3个不同类型的NBS基因的表达具有明显
不同的组织特异性, 此外, MdNBS、MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-LRR1在‘嘎啦’苹果幼苗叶片中均受SA和MeJA诱导。ACC
处理不能提高MdNBS和MdTIR-NBS1基因的表达, 但能诱导MdTIR-NBS-LRR1基因表达。结果表明, MdNBS、MdTIR-NBS1
和MdTIR-NBS-LRR1基因可能参与了苹果抗逆或抗病防御反应。
关键词: 苹果; NBS基因; 基因表达; SA; MeJA; ACC
Identification of Three Apple NBS Genes and Their Expression Responding to
Exogenous Phytohormones
BAI Su-Hua1,2, SONG Xiao1, ZHANG Yu-Gang1, DAI Hong-Yi1,*
1College of Horticulture, 2Key Lab of Plant Biotechnology of Shandong Province, College of Life Sciences, Qingdao Agricultural
University, Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: To explore the physiological roles of apple NBS genes, three typical NBS genes were identified from
Malus×domestica and designated as MdNBS, MdTIR-NBS1 and MdTIR-NBS-LRR1. All the proteins encoded by
the three genes contain a NB-ARC domain. In addition, both MdTIR-NBS1 and MdTIR-NBS-LRR1 proteins
include a TIR motif in N terminus and MdTIR-NBS-LRR1 protein has a LRR motif in C terminus. The
quantitative real-time PCR revealed that the expressions of these three NBS genes varied with different organs.
MdNBS was highly expressed in functional leaves, MdTIR-NBS1 in buds and MdTIR-NBS-LRR1 in young
leaves, respectively. Expression course analysis demonstrated that the expression of MdNBS, MdTIR-NBS1 and
MdTIR-NBS-LRR1 in the young leaves of ‘Gala’ apple could be up-regulated by SA and MeJA. ACC treatment
could not enhance the expression of MdNBS and MdTIR-NBS1, but could promote the expression of MdTIR-
NBS-LRR1. Taken together, the results implied that the three genes might be involved in defense responses
against biostress or abiostress in apple.
Key words: Malus×domestica; NBS genes; gene expression; SA; MeJA; ACC
近年来, 苹果腐烂病、白粉病、轮纹病、早
期落叶病等多种真菌病害频繁发生, 造成苹果减
产、果品质量下降, 严重地限制了苹果产业的发
展。探讨苹果植物的抗病机制、培育苹果抗性品
种尤为迫切, 抗病基因的分离和鉴定对于培育抗
病品种并深入了解苹果抗病机制具有重要意义。
在长期进化过程中, 植物已逐渐形成一套抵
御病原侵染的防御机制, 包括物理防御(如厚的角
质层)和化学防御(如酚类物质、丹宁、凝集素、
酶类等)两类不同的方式(Chisholm等2006)。其中
参与化学防御的物质有些是组成型合成的, 具有
基本的、广谱性的防御功能。还有一些则是诱导
合成的, 是针对特定病原的特异性防御反应。介
导这些防御物质诱导合成的蛋白有两类(Jones和
Dangl 2006), 一类是模式识别受体(pattern recog-
nition receptors, PRRs), PRR能够识别病原表面的
保守分子, 也即PAMPs (pathogen-associated mole-
cular patterns, PAMP), 从而激活一系列的信号元件
最终导致抗菌物质的合成(Zhang等2010)。另一类
柏素花等: 三个苹果NBS基因的鉴定及其对外源生长物质的响应 179
是NBS-LRR, 这是一类能与核苷酸进行结合的蛋
白质并具有亮氨酸重复序列(Dangl和Jones 2001)。
NBS-LRR蛋白能与病原菌的效应子进行结合而诱
发一系列信号转导事件, 最终导致抗菌蛋白的合
成。目前发现的植物抗性基因(R gene)大都是
NBS-LRR家族的基因(Dangl和Jones 2001)。例如,
从玉米(汪结明等2009)、水稻(王世全等2005)、小
麦(王海燕等2009)、马铃薯(陈观水等2006)等植物
中都已经分离鉴定了具有抗性功能的NBS-LRR蛋
白。NBS-LRR蛋白在结构上保守, 又存在着多样
性, 是宿主抵抗多种不同病原的潜在分子基础。
其保守的结构域包括: NBS (nucleotide-binding-
site)、LRR (leucine-rich repeat)、TIR (toll and
interleukin-1 receptor)、PK (protein kinase)、CC
(coiled-coil)等(孙文丽等2008), 这些结构域分别执
行不同的功能(McHale等2006)。NBS结构域是
NBS-LRR类亚家族中最保守的部分, 与ATP和GTP
的结合有关, 通常被认为是许多蛋白质执行功能的
必需元件, 并且含有一些高度保守的基序, 如P-loop
(即Kinase-1a)、Kinase-2、Kinase-3a和疏水区GLPL
等(Traut 1994)。根据N端结构的不同, NBS-LRR蛋
白能够进一步分为两个亚类: 一类是TIR-NBS-LRR
蛋白, 其N末端有一个白细胞介素受体(TIR)的同源
结构域(Vidal等2002); 另一类是CC-NBS-LRR蛋白,
其N末端有一个螺旋卷曲结构域(CC)。NBS-LRR
需要通过两条主要的信号转导途径诱发宿主的免
疫反应, 一条是水杨酸依赖的信号转导途径, 另外
一条途径是茉莉酸/乙烯信号转导途径。前者参与
活体营养病原的防御反应, 后者调控死体营养病原
的防御反应。水杨酸信号途径和茉莉酸/乙烯信号
途径在一定程度上存在着拮抗, 这二者的平衡是维
持植物防御体系完整的重要因素。
在苹果抗病基因鉴定工作中 , 早在2004年
Baldi等就鉴定了苹果基因组中NBS-LRR类基因的
同源序列, 并将其作为分子标记整合到12个连锁
群上, 随后NBS-LRR基因与苹果抗病性之间的研
究也逐渐展开。Lee等(2003)比较了苹果植物野生
种和栽培种中NBS家族基因的结构, 发现野生种和
栽培种的NBS基因之间没有明显的序列分化, 表明
病原作为选择压力在NBS基因家族的进化过程中
发挥重要作用。Calenge等(2005)利用NBS基因家
族序列为基础发展了分子标记用以鉴定和定位苹
果抗性基因。另外, 一些与苹果抗病性连锁的NBS
基因也被鉴定出来。目前已经发现黑星病的抗性
位点Rvi15 (Vr2)包含有3个TIR-NBS-LRR基因
(Galli等2010), 火疫病抗性位点包含一个NBS-LRR
基因(Parravicini等2011), Dunemann等(2007)还发
现苹果白粉病抗性基因与已鉴定的其他NBS类苹
果抗病基因连锁。Lee和Lee (2005)还在野生苹果
种中鉴定了一个TIR-NBS基因, 转化拟南芥后能使
拟南芥具有细菌斑点病抗性。但苹果NBS家族基
因的表达与主要抗病信号转导途径之间的关系尚
未见报道, 本研究在对苹果基因组NBS-LRR基因
进行分析的基础上, 选取具有代表性的3个具有不
同结构域的NBS家族的基因, 分析它们对水杨酸
(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)及1-氨基环丙烷-1-羧酸
(ACC)处理的反应, 为进一步深入研究苹果NBS-
LRR基因家族在苹果抗病过程中的功能提供参考
信息。
材料与方法
1 植物材料及其处理
试验所用苹果各组织器官取自苹果(Malus×
domestica Borkh.)品种‘嘎啦’, 外源生长物质处理
用‘嘎啦’组培苗进行。组培苗按以前报道的方法
(Bai等2013)准备。
植物生长物质诱导处理试验选用由茎尖培养
获得的‘嘎啦’组培苗。分别用1 mmol·L-1 SA、100
μmol·L-1 MeJA及10 μmol·L-1 ACC喷洒于‘嘎啦’组
培苗的叶片表面, 以喷施蒸馏水的组培苗作为对
照, 分别于0、2、4、10、24、30 h后取其叶片液
氮速冻, 于–70 ℃保存备用。
2 苹果NBS家族基因的鉴定及克隆
苹果幼叶总RNA提取使用原平皓生物技术有
限公司的EASYspin植物RNA快速提取试剂盒 ,
cDNA第一链合成用RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit (Fermentas, Cat# K1622)进行, 合成
cDNA所用RNA用DNase I处理消除基因组DNA
污染。
以拟南芥NBS-LRR蛋白的氨基酸序列为探
针用tBLASTn算法搜索苹果基因组数据库GDR
(http://www.rosaceae.org/gb/gbrowse/malus_x_
植物生理学报180
domestica/), 获得苹果NBS家族蛋白的编码基因组
序列, 并通过在线软件FGENESH预测编码区。根
据预测的编码区设计基因特异性引物, 以合成的
幼叶cDNA为模板, 用TaKaRa公司的LA Taq酶通过
PCR扩增基因的编码区并按常规方法克隆测序, 测
序结果用于序列分析及系统进化树构建。
3 序列分析
蛋白同源性分析用BLAST算法(http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行, 多重序列比对用软件
Clustalx.1.83进行, 蛋白质结构和性质预测用在线
软件ExPASy (http://www.expasy.org/), 结构域用
SMART程序分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)
(Schultz等1998), 系统进化树用MEGA 5.0软件
(Tamura等2011)按邻接算法构建, bootstrap值为
1 000。
4 实时定量PCR
基因的实时定量PCR在Light Cycler 480
System (Roche)上进行, 反应体系用SYBR® Rremix
Ex TaqTM (TIi RNaseH Plus) (TaKaRa)试剂盒, 按说
明书配制。所用引物及扩增产物长度如表1所示,
用β-actin基因(GQ339778.1)作为内参基因。组织
表达分析中, 使用表达量最低的组织作为校正子,
生长物质诱导试验中用未处理的样品作为校正
子。数据分析根据Livak和Schmittgen (2001)报道
的2-∆∆CT法进行。所有数据都以相对mRNA表达量
表示, 并经过单因素方差分析和Duncan检验。
实验结果
1 苹果NBS基因的克隆及分析
以拟南芥NBS-LRR蛋白的氨基酸序列为电子
探针搜索苹果基因组数据库, 从搜索结果中选取3
个具有代表性的不同结构的NBS家族的基因进行
克隆和序列分析, 分别命名为MdNBS (GDR ID:
MDP0000137959)、MdTIR-NBS1 (GDR ID: MDP-
0000386726)和MdTIR-NBS-LRR1 (GDR ID: MDP-
0000465174)。MdNBS基因的开放阅读框(ORF)长
为2 859 bp, 编码952个氨基酸; MdTIR-NBS1的ORF
长为2 832 bp, 编码943个氨基酸; MdTIR-NBS-
LRR1的ORF长为4 323 bp, 编码1 440个氨基酸。
将得到的3个苹果NBS蛋白与已知其他植物
的NBS抗性蛋白的NBS结构域进行多重序列比对,
发现不同植物间氨基酸序列一致性很低, 但都具
有NB-ARC结构域, 而且该结构域在不同植物间高
度保守, 包含了该基因家族特有的功能基序: 磷酸
结合环(P-loop)、Kinase2a和Kinase3a, 其保守序列
分别为GMGG(I/L/V)GKTT、VLDD(V/I)(W/D)和
GSRXXXTTR (X为任意氨基酸)。除MdTIR-NBS-
LRR1只包含P-loop和Kinase2a两个基序而不含
Kinase3a基序外, 另外两个基因编码的蛋白都包含
有上述3个结构基序。另外, 在NB-ARC结构域中
还包含疏水结构基序GLPL(A/T)。MdTIR-NBS和
MdTIR-NBS-LRR1基因所编码的蛋白在N端均含有
TIR结构域, MdTIR-NBS-LRR1在C端还包含LRR结
表1 用于苹果NBS基因克隆及实时荧光定量PCR的引物
Table 1 Primers for cloning and real-time fluorescence quantitative PCR of NBS genes of apple
基因 引物 引物序列(5′→3′) 扩增片段大小/bp
MdNBS MdNBS-F ATGGCTGAGGCGATCGTTTC 2 859
MdNBS-R TCACACAGCATCCGCTGTAG
MdNBS-realtimepcr-F TCGGTAAGGATTCTACTAAG 103
MdNBS-realtimepcr-R TGGTCAGGTTTGGATAGT
MdTIR-NBS1 MdTIR-NBS1-F ATGAATACCGGCAGCCTCGC 2 832
MdTIR-NBS1-R TCAGATAACCTCAAATCTTTTG
MdTIR-NBS1-realtimepcr-F GTTGGGGACATCAWYGGACT 187
MdTIR-NBS1-realtimepcr-R TAAATGGCTCTWGCAAGYGT
MdTIR-NBS-LRR1 MdTIR-NBS-LRR1-F ATGGCCGATTCTTCTTCTGA 4 323
MdTIR-NBS-LRR1-R TTACAACAACACGAAGGA
MdTIR-NBS-LRR1-realtimepcr-F TTGTATGTCCAGGGAGTGAA 117
MdTIR-NBS-LRR1-realtimepcr-R ATAGAGCGAAACCCAAGAAA
β-actin β-actin-realtimepcr-F CTGAACCCAAAGGCTAATCG 108
β-actin-realtimepcr-R ACTGGCGTAGAGGGAAAGAA
柏素花等: 三个苹果NBS基因的鉴定及其对外源生长物质的响应 181
构, 其结构特征为LXXLXXLXLXXXX (X为不确
定的氨基酸)。MdNBS除了含有NB-ARC结构域外
不含其他已知的结构域。
根据苹果NBS基因编码蛋白的氨基酸序列和其
他不同植物中NBS类蛋白的序列构建系统进化树。
如图1所示, MdTIR-NBS-LRR1和草莓FaTIR-NBS-
LRR聚在一个分枝上, 它们和MdTIR-NBS1、烟草N
蛋白、亚麻M蛋白、拟南芥RPP5等组成一个亚群,
该亚群的蛋白均含有TIR结构基序。MdNBS则与大
豆GmNBS-LRR、拟南芥RPM1、毛果杨PtNBS-LRR、
番茄I2C-1、玉米Rp1及水稻Xa1等抗性蛋白聚成
另一个亚群, 该亚群不含有TIR结构基序(图1)。
2 苹果NBS基因在组织器官中的表达分析
利用荧光实时定量PCR技术分析苹果NBS基
因的组织表达特异性, 结果显示苹果3个NBS基因
在所分析的6种组织中均有不同程度的表达, 它们
有不同的组织表达特异性: 其中MdNBS在功能叶
中表达量最高, 在芽中的表达量最低; MdTIR-NBS1
基因则在芽中的表达量最高, 在花中表达量最低;
MdTIR-NBS-LRR1在幼叶中的表达量最高, 而在枝
皮中的表达量最低(图2)。
3 外源SA对MdNBS、MdTIR-NBS1及MdTIR-
NBS-LRR1表达的影响
SA、JA和乙烯是参与植物防御反应的主要
信号分子, 为了探讨苹果NBS基因的表达是否受这
几种信号分子介导的信号转导途径的调控, 分别
用这些外源信号分子处理‘嘎啦’苹果幼苗, 并用荧
光定量PCR技术检测这些NBS基因在转录水平的
表达。经1 mmol·L-1 SA处理后MdNBS、MdTIR-
NBS1及MdTIR-NBS-LRR1基因的表达均有显著提
高(P<0.05) (图3), 其表达峰值分别为对照的7.38、
11.00和13.82倍, 但其表达峰值出现的时间不同。
其中, MdTIR-NBS-LRR1基因的表达峰值出现最早,
SA处理后4 h表达显著升高, 10 h达到最高点, 而
MdNBS和MdTIR-NBS1两个基因的表达峰值分别
为处理后的30 h和24 h。
图1 三个苹果NBS蛋白与其他植物抗性蛋白系统进化分析
Fig.1 Phylogenetic tree contructed using the deduced amino acid sequences of three apple NBS proteins and
some R proteins from other plant species
GmNBS-LRR: Glycine max ACM89637; PtNBS-LRR: Populus trichocarpa XP_002297751; RPM1: Arabidopsis thaliana CAA61131;
MdNBS: Malus×domestica MDP0000137959; Rp1: Zea mays AAP81261; I2C-1: Solanum lycopersicum AAB63274; Xa1: Oryza sativa
AB002266; M: Linum usitatissimum AAB47618; MdTIR-NBS1: Malus×domestica MDP0000386726; MdTIR-NBS-LRR1: Malus×domestica
MDP0000465174; FaTIR-NBS-LRR: Fragaria×ananassa HQ845018; N: Nicotiana glutinosa AAA50763; RPP5: Arabidopsis thaliana
AAF08790。数字代表1 000重复时的bootstrap值(%)。
植物生理学报182
4 外源MeJA对MdNBS、MdTIR-NBS1及MdTIR-
NBS-LRR1表达的影响
3个NBS基因经100 μmol·L-1 MeJA处理后基因
表达均有显著提高(图4)。MdNBS和MdTIR-NBS1
基因的表达均在处理后4 h有显著的提高, 分别在
10 h和24 h达峰值。MdTIR-NBS-LRR1基因的表达
在MeJA处理后10 h表现出显著提高, 此后, 在所检
测的时间范围内表达一直呈上升趋势。
5 外源ACC对MdNBS、MdTIR-NBS1及MdTIR-
NBS-LRR1表达的影响
ACC作为乙烯合成的前体物质, 用于处理‘嘎
啦’苹果幼苗, 以检测乙烯分子对NBS基因表达的
影响。经10 μmol·L -1 ACC处理后 , MdNBS和
MdTIR-NBS1基因在整个检测时间范围内未发生明
显变化(P>0.05), MdTIR-NBS-LRR1基因在处理后4
h出现较小幅度的表达提高(图5), 处理后10 h和24
h的表达显著高于对照, 分别为对照的2.04和1.83
倍(P<0.05)。
讨　　论
苹果病害是限制苹果产业发展的瓶颈之一,
挖掘抗病基因用于遗传改良是培育抗病品种的主
要途径。NBS基因家族是目前已知的大部分植物
抗病基因的来源, 分析苹果基因组上NBS基因家族
的组成及结构并分析其表达, 对于快速筛选苹果
抗病基因具有重要意义。本文通过对3个苹果NBS
基因的结构和表达分析, 为进一步深入研究整个
基因家族在植物抗病中的作用提供了基本信息。
这3个NBS基因分别代表了苹果NBS蛋白的典型结
构。分析具有不同结构的基因表达对不同处理的
响应, 可以了解不同结构基序和基序组合对外界
刺激的响应模式。
系统进化分析表明, MdNBS、MdTIR-NBS1和
MdTIR-NBS-LRR1分属于含有TIR和不含有TIR两
个不同的亚群, 这体现了其结构上的差异性。除
了结构上的差异以外, 这3个基因主要表达组织亦
图2 MdNBS、MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-LRR1基因在苹果各组织和器官中的表达
Fig.2 The expression of MdNBS, MdTIR-NBS1 and MdTIR-NBS-LRR1 in different tissues or organs of apple
柱形上不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 下图同此。
图3 1 mmol·L-1 SA处理后MdNBS、MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-LRR1基因的时序表达
Fig.3 The expression course of MdNBS, MdTIR-NBS1 and MdTIR-NBS-LRR1 after treatment with 1 mmol·L-1 SA
柏素花等: 三个苹果NBS基因的鉴定及其对外源生长物质的响应 183
不相同。MdNBS、MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-
LRR1基因分别在功能叶、芽和幼叶中表达量最
高。这暗示NBS家族的成员具有不同的功能, 可能
分别在组织特异侵染的病原中发挥特异性的防御
作用。
SA、MeJA和乙烯是植物体内重要的抗病信
号分子, 它们在抵御生物类胁迫中具有重要作用
(Tsuda等2009)。本研究试图通过检测MdNBS、
MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-LRR1的表达对3种外
源生长物质处理的响应, 了解苹果NBS家族的基因
在植物抗逆防御反应中可能的功能。结果显示,
经外源生长物质SA、MeJA诱导处理后, MdNBS、
MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-LRR1在‘嘎啦’苹果叶
片的表达均有显著增加, 表明NBS基因的表达受到
SA和JA信号途径直接或间接的调控, 同时也暗示
它们可能参与苹果植物的抗病防御反应。尽管均
能受到SA和JA处理诱导, 但这3个基因的表达模式
并不相同, 其表达峰值出现的早晚不同, 这种差异
可能显示了不同NBS基因在功能上的一种互补。
与SA和MeJA不同, ACC处理对MdNBS和MdTIR-
NBS1基因的表达没有显著影响, 能小幅度提高
MdTIR-NBS-LRR1基因的表达, 这种差异背后的机
理还需要进一步研究, 但外源生长物质处理的结
果表明, 这3个NBS家族的成员可能在苹果植物对
生物或非生物胁迫的防御反应中发挥功能。
这3个基因所编码的NBS蛋白具有不同的结
构域组成, 表达的组织特异性和对外源生长物质
处理的反应模式均呈现多样化的趋势, 暗示NBS家
族的成员通过多样化的机制参与宿主对病原的抵
抗。目前, 在已经报道的与苹果抗病性相关的基
因中, 包含了几个NBS家族的基因, 例如与火疫病
抗性相关CC-NBS-LRR基因(Parravicini等2011), 与
黑星病抗性相关的3个TIR-NBS-LRR基因(Galli等
2010), 以及能抗细菌性斑点病的TIR-NBS基因
(Lee和Lee 2005)。这些基因所编码的蛋白质中, 除
了均含有NB-ARC结构域外, 其他结构域的组成也
图4 100 μmol·L-1 MeJA处理后MdNBS、MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-LRR1基因的时序表达
Fig.4 The expression course of MdNBS, MdTIR-NBS1 and MdTIR-NBS-LRR1 after treatment with 100 μmol·L-1 MeJA
图5 10 μmol·L-1 ACC处理后MdNBS、MdTIR-NBS1和MdTIR-NBS-LRR1基因的时序表达
Fig.5 The expression course of MdNBS, MdTIR-NBS1 and MdTIR-NBS-LRR1 after treatment with 10 μmol·L-1 ACC
植物生理学报184
不相同, 可见不同的结构域组成可能是宿主抵抗
不同病原的需要。我们在以前鉴定的一个NBS-
LRR1基因(宋霄等2013)与本研究中的3个NBS家
族的基因均不相同, 其所编码的蛋白质结构域的
组成由NB-ARC和LRR结构域组成, 其表达的组织
特异性及对外源生长物质处理的反应均与本研究
中报道的基因不同, 也表明NBS家族的基因可能通
过多样化的机制参与宿主植物对不同病原侵染的
防御反应。
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